Um Microscópio Raman Multimodal de Transformada de Fourier de Campo Amplo

Resumo

Um microscópio de transformada de Fourier de campo amplo, baseado em um interferômetro birrefringente compacto e ultra-estável, permite a aquisição paralela de espectros para todos os pixels de um detector 2D. A abordagem no domínio do tempo permite o desemaranhamento de sinais fotoluminescentes e Raman, e possibilita o mapeamento rápido Raman (~5 ms/pixel) com resolução espacial de ~1 μm e espectral de 23 ^cm-1 .

Resumo

A microscopia Raman é uma técnica poderosa para determinar a composição química de uma amostra. O principal desafio dos microscópios Raman espontâneos de última geração, baseados na detecção de varredura pontual no domínio da frequência, é a aquisição de mapas Raman de grandes áreas devido a tempos de permanência típicamente longos em pixels (0,1-1 s). O microscópio de transformada de Fourier (FT) de campo amplo apresentado aqui permite a medição rápida de amostras estendidas com resolução espacial de ~1 μm e resolução espectral de ~23 ^cm-1 . Ele é baseado em um interferômetro birrefringente de caminho comum ultraestável e compacto, adicionado ao longo do caminho de detecção de um microscópio comercial, que permite a aquisição paralela de espectros para todos os pixels de um detector 2D, reduzindo significativamente o tempo de medição (10-100 vezes mais rápido). A abordagem no domínio do tempo aborda efetivamente outra limitação da técnica no domínio da frequência, que é o desemaranhamento do sinal Raman do fundo da fotoluminescência, no qual o sinal Raman pode estar enterrado. Este protocolo descreve como realizar medições hiperespectrais com um microscópio comercial atualizado: o alinhamento do esquema de iluminação, os critérios para escolher os parâmetros de medição e a análise de dados para recuperar e investigar espectros.

Introdução

A imagem espectral é uma técnica que fornece informações tanto espectrais quanto espaciais e tem sido aplicada a diversos campos, desde^{microscopia 1} até^{sensoriamento remoto 2}. Imagens multiespectrais e hiperespectrais são distinguidas com base em se algumas bandas espectrais discretas ou um espectro contínuo são registradas para cada pixel de um sensor 2D. A imagem Raman é uma implementação particular da imagem espectral.

A microscopia de espalhamento Raman é uma técnica poderosa para medir frequências vibracionais ν_R de um sistema. Modos vibracionais estão associados às ligações químicas e, portanto, a espectroscopia^{Raman 3} permite a investigação da composição química de amostras em^{biologia 4} e ciências^{dos materiais 5}. Na espectroscopia Raman espontânea, a amostra é iluminada com radiação monocromática na frequência _ν0, chamada de bomba. Uma fração da luz da bomba, interagindo com os modos vibracionais, pode sofrer espalhamento inelástico, resultando em fótons nas frequências ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}, onde ν_R é a frequência vibracional molecular dentro da amostra. A luz de menor energia espalhada (ν_S) é chamada de radiação Stokes, enquanto a de maior energia (ν_AS) é a radiação anti-Stokes. No equilíbrio térmico, a maioria das moléculas ocupa estados de energia mais baixos, portanto os componentes anti-Stokes são significativamente mais fracos que os de Stokes. Por essa razão, a microscopia de espalhamento Raman normalmente detecta fótons de Stokes. Como moléculas e sólidos possuem múltiplos modos vibracionais, o espectro Raman é caracterizado por bandas distintas que, coletivamente, formam uma assinatura química única, permitindo a identificação e análise do material. O principal desafio dessa abordagem é a seção transversal extremamente baixa do espalhamento Raman espontâneo, com apenas um em mais de 10^{fótons 9-10 12} passando por esse processo.

Em uma configuração padrão de um microscópio de espalhamento Raman, a luz de excitação é fortemente focada em um ponto da amostra. Após rejeitar os fótons de bombeamento espalhados elasticamente (tipicamente com filtros espectrais), a luz restante é coletada e caracterizada com um espectrômetro no domínio da frequência (por exemplo, grade dispersiva); A resolução espectral desses dispositivos pode atingir ~0,5-1 ^cm-1. A medição é repetida para cada ponto (x,y) no campo de visão (FOV) de uma amostra por um método chamado varredura pontual ou ^{raster 6}. Existem duas questões principais nessa abordagem: (1) a baixa seção transversal do espalhamento Raman espontâneo normalmente requer longos tempos de integração (0,1-1 s) para coletar fótons suficientes para cada pixel do espectrômetro, portanto o mapa Raman de uma amostra estendida pode exigir longos tempos de medição; (2) a excitação pela luz da bomba também gera fotoluminescência (PL), que se sobrepõe ao sinal Raman espontâneo e frequentemente pode sobrepujá-lo.

Para aumentar a velocidade de aquisição, é possível adotar a abordagem de varredura de^{linha 7} , na qual a bomba é focada ao longo de uma linha do FOV (por exemplo, na coordenada x) e o sinal coletado (espalhamento PL ou Raman) é dispersado por um espectrômetro com um sensor 2D, produzindo para a coordenada x dada um conjunto de dados 2D no qual um eixo corresponde ao espectro e o outro a uma coordenada espacial y. No entanto, essa implementação ainda sofre com as perdas significativas introduzidas pela fenda de entrada do espectrômetro, cuja largura estreita proporciona uma melhor resolução espectral, mas também limita a quantidade de luz coletada.

Uma configuração de campo amplo pode ser mais adequada para reduzir o tempo de medição: com esse método, uma grande área da amostra é iluminada e o espectro é adquirido para todos os pixels de um sensor 2D simultaneamente. Nesse caso, informações espectrais podem ser coletadas usando um conjunto de filtros^{passa-banda 8} ou um filtro espectral^{ajustável 9} em frente a uma câmera de imagem monocromática. Além disso, esse método é baseado em uma abordagem no domínio da frequência, e adquire apenas um número discreto de bandas espectrais.

Um método alternativo para medir um espectro é a abordagem da transformada de Fourier (FT). É uma técnica no domínio do tempo baseada no teorema¹⁰ de Wiener-Kintchin, que afirma que a densidade espectral de potência de um sinal é a transformada de Fourier de sua autocorrelação temporal. Em Óptica, isso é obtido na prática gerando duas réplicas da forma de onda com um interferômetro. Sua interferência é medida por um detector em função do atraso relativo, dando origem ao chamado interferograma¹¹. A abordagem FT é amplamente utilizada para medir espectros na região espectral infravermelha, onde é chamada de espectroscopia infravermelha por transformada de Fourier (FTIR⁾¹². A FTIR é rotineiramente usada para medir o espectro de absorção de transições vibracionais na faixa espectral do infravermelho médio (~2,5−25 μm comprimento de onda).

A abordagem de FT no domínio do tempo oferece alguns benefícios em comparação com os espectrômetros dispersivos convencionais: alcança maior taxa de transferência devido à ausência de fendas (vantagem etendue de Jacquinot¹²); ele oferece uma resolução espectral flexível, que depende apenas do alcance da varredura. Além disso, é bem adequado para configurações de campo amplo: de fato, ao usar um detector 2D, o método mede um interferograma para cada pixel em paralelo, permitindo o registro simultâneo de espectros contínuos em todos os pixels. Por outro lado, um sistema de imagem de FT deve cumprir dois requisitos desafiadores: (1) o atraso relativo entre as duas réplicas de luz deve ser controlado a uma pequena fração do ciclo óptico; (2) o deslocamento de fase entre raios que interferem em um único pixel deve ser limitado para garantir uma boa coerência e, portanto, alto contraste. Algumas soluções foram propostas com base em interferômetros de caminho^{comum de 13, 14} ou quase¹⁵, mas são bastante complexas ou têm resolução espectral maior que 100 ^cm-1.

Neste trabalho, é descrito um novo microscópio de campo amplo, que permite a aquisição de imagens de fotoluminescência e espalhamento Raman. O bloco inovador desse sistema é um interferômetro birrefringente de caminho comum compacto e ultra-estável, chamado Translating-based Wedge-based Identical pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Ele fornece varreduras de atraso de centenas de ciclos ópticos com uma precisão de fase de uma pequena fração do próprio ciclo óptico e alta estabilidade. As duas réplicas de luz possuem polarizações ortogonais e viajam colinarmente pelo mesmo caminho comum, portanto, não são afetadas por flutuações no comprimento do caminho, típicas de um interferômetro de feixe duplo. O esquema, mostrado no conjunto da Figura 1, consiste em dois blocos de cristal birrefringente com eixos ópticos ortogonais: um (B₂) com comprimento fixo e o outro (B₁) divididos em duas cunhas que podem ser movidas na direção comum da hipotenusa. A luz incidente é polarizada por_{P 1} em 45° em relação ao eixo óptico do cristal birrefringente, de modo que metade da energia está ao longo da polarização comum e metade ao longo da extraordinária. Ao viajar ao longo dos blocos birrefringentes, os dois componentes ortogonais acumulam um atraso relativo que é finamente ajustado variando a espessura total do bloco B₁ ao alterar a inserção da cunha. O segundo polarizador_P2 projeta os componentes do campo para uma polarização linear comum para fazê-los interferir. O atraso τ entre réplicas depende do deslocamento da cunha x ao longo da hipotenusa comum como (Equação 1), com c velocidade da luz, α ângulo do ápice das cunhas, Δn= n_{e-n o} diferença nos índices de refração ordinário e extraordinário (birrefringência). Como a resolução espectral Δv é inversamente proporcional ao intervalo de varredura T=|T_{2-T 1}|, com T₁, T₂ atraso inicial e final do interferograma, a alta resolução espectral exigida pela espectroscopia Raman exige alta birrefringência e translações de cunha longa. Entre os cristais birrefringentes mais comuns, YVO₄ (ortovanadato de ítrio) é particularmente adequado para seu alto Δn e faixa de transparência no infravermelho visível-próximo. As cunhas são projetadas com um ângulo de ápice de 10°, assim, com um comprimento de varredura de 15,3 mm, o interferômetro pode transmitir um atraso de 2500 fs a 600 nm, obtendo uma resolução espectral de 23 ^cm-1, em toda a faixa espectral de interesse (a sensibilidade da câmera de silício representa o limite superior). Este trabalho apresentará a estratégia para um ajuste adequado da amostragem do interferograma (ou seja, intervalo de passos e varredura) para alcançar a resolução espectral desejada e para lidar com o fundo de banda larga, desembaraçando o sinal Raman da fotoluminescência.

Como descrito por Candeo et ^al.17, este espectrômetro birrefringente pode ser acoplado a um microscópio óptico comercial para realizar medições hiperespectrais. Os requisitos são os seguintes: um corpo de microscópio óptico reconfigurável, um interferômetro birrefringente TWINS, uma câmera monocromática de baixo ruído (por exemplo, CCD ou sCMOS) e uma fonte de laser de banda estreita. Para este último, os comprimentos de onda típicos de excitação para Raman e espectroscopia de fluorescência são 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm e 785 nm. Apesar de lasers de alta pureza espectral, como o listado na Tabela de Materiais, serem a melhor escolha, um laser com largura de linha maior, por exemplo, ~0,1 nm, também pode ser usado, dada a resolução espectral limitada do instrumento. O microscópio é aprimorado colocando o TWINS no caminho de detecção, entre a lente tubular e o detector monocromático. Essa configuração proporciona um atraso uniforme do caminho em todo o campo de visão e um contraste médio de 55%. O caminho de excitação é projetado para obter uma iluminação uniforme da amostra: na prática, a ponta de saída de uma fibra multimodo de grande núcleo é visualizada no plano da amostra. Ao usar um embaralhador mecânico, os modos são fortemente acoplados no núcleo da fibra, produzindo um perfil de topo plano no plano da amostra. Além disso, uma bobina móvel vibratória compensa o padrão de manchas típico da radiação monocromática. Uma caracterização dessa iluminação em cartola é mostrada na Figura Suplementar 1. O feixe é focado na amostra por um objetivo corrigido ao infinito, que também coleta Raman retroespalhada e luz de luminescência em direção ao caminho de detecção. Os filtros necessários para rejeitar a iluminação serão detalhados.

Para mostrar como medir características espectrais de banda larga e banda estreita com este microscópio hiperespectral, tanto a luminescência quanto o espalhamento Raman são medidos para uma amostra de teste selecionada especificamente para fins ilustrativos. A amostra consiste em uma mistura de três pigmentos em pó com espectros Raman bem conhecidos: dois polimorfos de branco de titânio (_{TiO 2}), a saber, rutilo e anatase, e amarelo sulfeto de cádmio (CdS). No entanto, o mesmo procedimento pode ser usado para uma gama mais ampla de aplicações, desde ciência dos materiais até biologia.

O escopo deste artigo é ilustrar os passos para realizar uma medição hiperespectral, enquanto a montagem e o alinhamento do interferômetro TWINS são detalhados por Candeo et ^al.17. Portanto, um experimentador interessado deve começar a partir de um interferômetro pré-montado baseado nessa tecnologia.

O protocolo começa com a preparação da amostra e como configurar o microscópio para excitar e coletar os fótons de espalhamento Raman e PL. Em seguida, os parâmetros de varredura (comprimento da varredura, etapa de amostragem) e os parâmetros de aquisição (tempo de exposição, binning de hardware) são definidos de acordo com os requisitos do sinal em investigação. Por fim, será apresentado o pipeline de pós-processamento, detalhando o procedimento para recuperar o espectro em cada pixel (hipercubo espectral, Figura 2B) a partir do conjunto de dados temporais adquirido (hipercubo temporal, Figura 2A), e delineando os algoritmos para redução de ruído e análise espectral avançada. Todo o fluxo de trabalho é mostrado na Figura 3.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da amostra

ATENÇÃO: Use luvas de látex durante essa preparação, pois o pigmento CdS é tóxico, especialmente quando inalado.

1. Use um raspador para depositar 20 mg de cada pó de pigmento em uma balança de precisão, obtendo uma proporção de peso 1:1:1.
   NOTA: Limpe cuidadosamente a ponta do raspador para cada amostra para evitar contaminação cruzada.
2. Misture os pós com um almofariz para remover os grumos.
3. Despeje a mistura resultante sobre uma lâmina de microscópio; Use a ponta do raspador para pressioná-la suavemente e obter uma espessura quase uniforme da camada.
4. Aplique esmalte nas bordas de um esmalte de microscópio. Coloque sobre a mistura, com o esmalte virado para baixo, e aplique pressão suficiente para vedar. Deixe secar por alguns segundos para endurecer o polimento.

2. Montagem do microscópio

ATENÇÃO: Use óculos de segurança quando o laser estiver ligado, pois a potência máxima alcançada no plano de amostra é de 300 mW.

NOTA: O desempenho do laser de bombeamento permanece inalterado pelas variações de temperatura, desde que seja operado dentro da faixa de temperatura especificada na ficha técnica (por exemplo, 10-40 °C para o laser reportado na Tabela de Materiais).

1. Alinhe o interferômetro TWINS ao longo do caminho de detecção do microscópio.
   NOTA: Conforme detalhado por Candeo et ^al.17, o módulo interferômetro deve ser adicionado entre a lente do tubo e o detector, garantindo uma distância adequada entre eles. Para o microscópio usado neste trabalho, isso só é garantido quando o módulo ocular for removido.
2. Para adaptar o esquema de iluminação Koehler a uma excitação a laser, remova a lâmpada de excitação embutida do microscópio e use uma objetiva do microscópio para coletar a luz na saída de uma fibra multimodo de grande núcleo.
   NOTA: A ampliação objetiva define o tamanho do padrão de iluminação quando a ponta da fibra é conjugada com o plano da amostra. Uma possível escolha é um objetivo de 10x/0,25-0,30.
3. Escolha o comprimento de onda da excitação e foque o laser de excitação na entrada da fibra multimodo de grande núcleo. Ligue a câmera e execute um software de visualização.
   1. Anexe uma seção central da fibra à membrana vibratória de uma bobina móvel, o que removerá a mancha. Embaralhe mecanicamente a fibra dobrá-la firmemente para fundir todos os seus modos espaciais. Ligue o laser.
   2. Prepare uma amostra de teste para alinhamento, por exemplo, listras fluorescentes vermelhas de marcador em um slip de cobertura de microscópio.
   3. Ajuste a posição da ponta da fibra em relação ao sistema óptico de iluminação movendo a fibra com um estágio de translação de precisão para obter um ponto com intensidade uniforme e bordas bem definidas no plano da amostra.
      NOTA: Um laser de 532 nm é usado para todas as medições relatadas. Com uma fibra do tamanho de núcleo de 400 μm, o diâmetro do ponto cobre 82% da largura do campo de visão da câmera.
4. Empregue um conjunto de filtros para os caminhos de excitação e detecção, adotando os seguintes critérios (Figura Suplementar 2):
   1. Use um filtro passa-banda estreita a 532 nm (largura de banda de 2,0 nm) para limpar a linha do laser e rejeitar quaisquer bandas laterais da bomba que surjam do alargamento não linear devido à propagação na fibra.
   2. Use um espelho dicróico (DM na Figura 1) para refletir a luz do laser em direção à amostra e transmitir a radiação retroespalhada e retro-espalhada coletada pelo objetivo.
   3. Use um filtro passa-longas (LPF na Figura 1) a 532 nm para rejeitar a luz residual de iluminação.
   4. Durante a medição de espalhamento Raman, use um filtro passa-curto (FPS na Figura 1) a 600 nm para suprimir a fluorescência de fundo.
5. Meça a potência no plano da amostra com um medidor de potência. Atenue o feixe de bombeamento para obter uma intensidade na amostra que não cause danos (da ordem de 2 W/^cm2, conforme relatado na Tabela 1). Use um obturador para o laser enquanto ajusta os outros parâmetros de medição.
   NOTA: Devido à baixa seção eficaz do espalhamento Raman espontâneo, é necessária alta densidade de potência para aprimorar a coleta de sinais. No entanto, o limiar de dano amostralizado deve ser considerado. Diferentemente dos sistemas de varredura pontual, um sistema de campo amplo ilumina uma grande área, tornando a dissipação de energia menos eficiente e exigindo um gerenciamento cuidadoso de energia para evitar danos à amostra.
6. Coloque a amostra no palco do microscópio e ajuste o foco.
   NOTA: Para encontrar o foco facilmente, primeiro ilumine a amostra com uma lâmpada branca em transmissão ou reflexão. No último caso, uma lâmpada colocada ao lado do microscópio poderia ser usada. O foco da amostra será posteriormente otimizado com a luz do laser de bombeamento.

3. Parâmetros de medição

1. Ligue o driver do motor que realiza a translação da cunha. Controle os componentes de hardware (câmera e motor) simultaneamente para realizar medições hiperespectrais (exemplo de interface de usuário mostrado na Figura Suplementar 3).
2. Defina os parâmetros de aquisição da câmera, o tempo de exposição e o binning por hardware para otimizar a intensidade do sinal, adotando as seguintes instruções:
   1. Como uma alta relação sinal-ruído (SNR) no sinal temporal leva a um SNR alto nos espectros recuperados, privilegia-se um tempo de exposição longo, que preenche melhor a faixa dinâmica do sensor.
      NOTA: Para sinais baixos, assim como para espalhamento Raman, é necessário encontrar um compromisso entre o nível do sinal e o tempo total de medição: o maior tempo de exposição pode não ser viável.
   2. Escolha o binning de hardware para coletar carga de mais pixels antes da leitura.
      NOTA: Somar carga e fazer uma única leitura proporciona melhor desempenho de ruído do que ler vários pixels e depois somar o sinal deles em pós-processamento. A escolha do binning também é impulsionada pela redução aceitável da resolução espacial.
3. Escolha parâmetros de varredura, comprimento total e etapa de amostragem de acordo com os seguintes critérios:
   1. Para alcançar uma alta resolução espectral para picos Raman, configure uma translação assimétrica de cunha longa (-2526 fs→ -36 fs). Por outro lado, realize uma varredura simétrica ao redor da posição de atraso zero (-65 fs → 65 fs) para obter mais características espectrais de banda larga do sinal PL.
   2. Usando a Equação 1 para atraso τ como função da translação wedge x, escolha a etapa de amostragem para cumprir o limite de Nyquist para a largura de banda espectral de interesse.
      NOTA: Dado o comprimento de onda mínimo do espectro λ_min, impõe-se (Equação 2).
      
      onde a birrefringência Δn depende do comprimento de onda (veja as equações de Sellemeier).
4. Abra o obturador para apontar o laser para a amostra. Se for observada uma diminuição na intensidade do sinal, espere até que a amostra atinja uma condição estacionária (tipicamente alguns segundos).
   NOTA: Para compensar a diminuição da intensidade do sinal, ajuste o binning e o tempo de exposição para manter um bom SNR.
5. Inicie a aquisição de uma imagem monocromática para cada posição da cunha, ou seja, atraso temporal entre réplicas a partir de cada ponto do sensor 2D.
   NOTA: O software de aquisição deve salvar duas variáveis: o hipercubo temporal (conjunto de imagens 2D) e o vetor de posições motoras registrado pelo codificador durante a varredura.
6. Após a medição, desligue o laser e prossiga com a análise dos dados.

4. Processamento do datacube adquirido

1. Gerar o hipercubo espectral a partir do conjunto de dados adquirido, seguindo estas instruções:
   1. Carregue o arquivo de correção de posições dos motores para o motor de passo específico (veja a discussão).
   2. Carregue o arquivo de calibração de frequência do interferômetro específico para associar frequências espaciais medidas (pseudofrequências) a frequências ópticas reais (veja a seção de Discussão).
   3. Escolha a faixa de frequência para os espectros que serão calculados pela transformação de Fourier dos interferogramas de todos os pixels.
   4. Entre as funções de apodização^{disponíveis, 12} para janelas do interferograma medido, selecione aquela que oferece um bom equilíbrio entre alargamento espectral e redução de artefatos nos espectros recuperados, como a janela Happ-Genzel (Hamming).
   5. Gerar o hipercubo espectral transformando Fourier os interferogramas podizados para todos os pixels. Salve em valores complexos.
      NOTA: O espectro complexo do FT carrega informações adicionais, que serão úteis para reduzir o ruído do conjunto de dados e extrair os espectros médios de um conjunto de pixels selecionados.
2. Uma vez que o hipercubo espectral tenha sido calculado, realize-se várias investigações, por exemplo, obter o espectro médio em áreas selecionadas; gerar uma imagem RGB de cor falsa; mapear picos espectrais; Subtraia o contexto.
3. Para reduzir o ruído espectral, que pode sobrecarregar picos significativos, especialmente em espectros Raman, implemente a Decomposição de Valor Singular (SVD)¹⁸ seguindo estes passos:
   1. Remodele o hipercubo temporal em uma matriz A com interferogramas ao longo de suas linhas.
   2. Execute a SVD da matriz, obtendo as matrizes U, S e V tais que A = USV^T.
      NOTA: As colunas U são as distribuições espaciais dos autovetores de V (colunas), enquanto S é uma matriz diagonal com valores singulares (SVs) em ordem decrescente.
   3. Remodele cada coluna de U em uma matriz de pixels e realize sua FT 2D para obter suas frequências espaciais.
   4. Como altas frequências estão associadas a mudanças muito abruptas no mapa, considere-as como ruído; defina uma região quadrada centrada no espaço de Fourier calculado que separa frequências baixas (principalmente sinais) e altas (principalmente ruído).
      NOTA: Uma possível escolha para essa área é com um lado de 1/4 em relação ao tamanho do espaço de Fourier.
   5. Calcule a razão do sinal espacial (SSR) para cada SV dividindo a soma das intensidades dos pixels (módulo complexo) dentro da fronteira pela soma das intensidades fora da fronteira. Plote o SSR em função do número SV.
   6. Defina um limiar para SSR, ou seja, o número de SVs significativos a manter para reduzir a contribuição de ruído no conjunto de dados, evitando artefatos.
      NOTA: A SSR normalmente apresenta uma tendência decrescente que se estabiliza até um platô à medida que o número de valores singulares aumenta. Uma regra prática é manter os valores singulares até o ponto em que o platô começa.
   7. Defina todos os SVs inferiores a zero na matriz diagonal S, obtendo_{S sem ruído,} e calcule um hipercubo temporal reduzido como V_{T deruído} dos EUA.
      NOTA: SVD é uma fatoração matricial que também pode ser aplicada ao hipercubo espectral remodelado (com linhas contendo espectros em vez de interferogramas).
4. Repita os passos 4.1-4.2 com o hipercubo temporal sem ruído para recuperar os espectros.
5. Baixe o programa pelo link na Referência¹⁹ para realizar uma análise mais aprofundada do conjunto de dados com o algoritmo Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   NOTA: Desenvolvedores de software fornecem uma descrição detalhada do^{algoritmo 20}. É um método iterativo para resolver o problema da análise de mistura: cada espectro é expresso como a combinação linear de perfis espectrais puros. Com uma representação matricial: B = C R^T+E, onde B é o conjunto de dados, C contém as concentrações para cada espectro, as colunas de R são os espectros de referência dos constituintes, e E expressa o erro.
   1. Remodele o hipercubo espectral em_{uma matriz de} frequências N_pixels x N frequências, com N_pixels no total de pixels_{e N comprimento} de vetores de frequência de frequência.
   2. Selecione o número de espécies esperadas na amostra e cargue seus espectros de referência.
      NOTA: Espectros de referência podem ser medidos para cada pigmento separadamente. Caso contrário, o programa fará um SVD do conjunto de dados e usará tantos componentes principais quanto os constituintes selecionados para as estimativas iniciais.
   3. Restrições selecionadas: perfis espectrais recuperados devem ser não negativos e o mais semelhantes possível aos espectros de referência.
   4. Plote o mapa de concentração (colunas remodeladas de C) e os espectros (colunas de R) para cada espécie.
   5. Exporte esses mapas e use-os para produzir uma imagem de cor falsa (Figura 4A), concluindo a análise.
      NOTA: Os programas usados para obter os resultados apresentados aqui não são publicamente disponíveis, mas podem ser obtidos dos autores mediante solicitação.

Resultados

A Figura 4A mostra o mapa Raman para uma região selecionada da mistura de pó. É uma representação em falsas cores dos mapas de abundância recuperados com MCR-ALS, conforme descrito no passo 4.5. Ele fornece informações sobre a composição da amostra, já que as três espécies podem ser claramente distintas dentro do campo de visão. A Figura 4B mostra os espectros médios nas regiões selecionadas do mapa, com uma resolução espectral ...

Discussão

Um microscópio multimodal de campo amplo de campo FT foi introduzido para a aquisição de imagens espontâneas de espalhamento Raman e luminescência, sendo aplicável à ciência dos materiais. A aplicabilidade a amostras biológicas é demonstrada por Candeo et ^al.17, que apresentam uma imagem de fluorescência hiperespectral de células humanas coloridas. O principal desafio para as medições de espalhamento Raman nesse campo é evitar danos fotográficos resultantes da dis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anatase	Cronos	1200	Polimorfia do pigmento branco TiO2
Pó de sulfeto de cádmio	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Amarelo cádmio, índice de cor escuro/PY35
Câmera	Andor	Luca R	Câmera CCD de multiplicação de elétrons com 1004x1002 pixels de 8µ m x 8µ m
Filtro de limpeza	Semrock	LL01-532-12.5	& Oslash; 1/2" 2,0 nm - filtro de linha de laser FWHM a 532 nm
Coberturas	BRAND GmbH & Co	4700 55	Coberturas de microscópio de vidro borosilicato 22x22x0,15 mm
Espelho dicróico	Semrock	Di02-R532-25x36	Divisor de feixe a laser de borda única de 25,2x35,6 mm a 532 nm
Fibra	Thorlabs	M74L05	400µ Tamanho m-core, fibra multimodo NA 0,39
Laser	Fotônica Hubner	Cobolt Samba 1000	Laser bombeado por diodo CW a 532 nm, potência máxima 1000 mW
Filtro passa-longa	Semrock	LP03-532RU-25	Filtro de borda passa-longa ultra íngreme a 532 nm
Microscópio	Leica	DMRBE	Microscópio de pesquisa trinocular
Objetivo	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Objetivo de excitação e coleta com ampliação 10x, 0,3 NA
Objetivo	Newport	M-10X	Lente objetiva no caminho de iluminação, com ampliação de 10x, 0,25 NA
Rutilo	Cronos	2900	Polimorfia do pigmento branco TiO2
Filtro passa-curto	Thorlabs	FESH600	& Oslash; Filtro passa-atalho de 25,0 mm com comprimento de onda de corte 600
Slides	Marienfeld	1000612	Laminas de microscópio 76x26x1 mm