Aplicação do Desenho Up-and-Down de Dixon para Estimar a Concentração Alveolar Mínima de Sevoflurano em Ratos com Classificação de Movimento Refinado

Resumo

O protocolo aqui apresentado busca avaliar a profundidade da anestesia utilizando o Up-and-Down Design de Dixon em ratos sedados submetidos a um estímulo de dor padronizado. Além disso, delineia uma classificação dos vários padrões de movimento observados.

Resumo

Ao usar agentes anestésicos voláteis, a medida padrão de potência é a concentração alveolar mínima (CAM), definida como a concentração alveolar na qual 50% dos indivíduos não apresentam resposta motora a um estímulo doloroso. Em estudos clínicos e experimentais, o consenso atual afirma que apenas "movimentos grosseiros e intencionais" contam como uma resposta motora positiva e podem, portanto, indicar sedação muito leve. No entanto, o nível apropriado de anestesia, tanto em humanos quanto em animais, varia individualmente com base em vários fatores de influência, como outros medicamentos administrados. Dois estudos em animais em ratos foram realizados para examinar os efeitos do tetrahidrocanabinol e do etanol no sevoflurano, um dos anestésicos voláteis mais comumente usados. Para estimar o MAC, o Up-and-Down Design de Dixon foi empregado. Para o primeiro animal, foi escolhida uma dose pré-determinada de sevoflurano. Após um período de equilíbrio de 15 min, um estímulo de dor padronizado foi aplicado ao terço distal da cauda do rato usando uma pinça cirúrgica. A resposta do animal ao estímulo foi documentada como positiva ou negativa. Se ocorresse uma reação motora positiva, a dose para o próximo animal era aumentada. Por outro lado, se o rato não exibisse uma resposta motora, a dose para o animal seguinte era diminuída. A regressão isotônica e o método bootstrap foram utilizados para estimar a CAM e os intervalos de confiança de 95%. Este artigo descreve um protocolo detalhado para avaliar a profundidade do anestésico em ratos usando o projeto para cima e para baixo. Ele também fornece uma descrição e categorização novas e detalhadas dos padrões de movimento em ratos sedados quando um estímulo doloroso padronizado é aplicado para aumentar a reprodutibilidade para estudos futuros.

Introdução

O sevoflurano é um dos anestésicos inalatórios voláteis mais utilizados¹. Sua potência é avaliada por meio da concentração alveolar mínima (CAM), que é definida como a concentração alveolar na qual 50% dos pacientes não apresentam resposta motora a um estímulo doloroso ^2,3,4. Para estabelecer a CAM, ratos podem ser usados como modelos animais devido à sua maior homogeneidade em relação aos humanos. O estímulo da dor é normalmente aplicado usando uma pinça cirúrgica no terço distal da cauda do rato². O uso de métodos alternativos para o teste de dor não garantiria a comparabilidade com estudos realizados anteriormente e, portanto, poderia gerar resultados divergentes. Devido à grande variedade de padrões de movimento em resposta ao estímulo, o consenso atual afirma que apenas "movimentos grosseiros e intencionais" devem ser considerados reações motoras positivas³. No entanto, essa definição carece de mais refinamento em relação a quais categorias específicas se qualificariam como "intencionais grosseiras" e até que ponto um movimento deve atender a esse critério. Isso é de extrema importância, pois uma resposta motora a um estímulo pode indicar, em um ambiente clínico, profundidade insuficiente de sedação.

Vários fatores influenciam o estado anestésico, incluindo^{idade 5}, comorbidades⁶, função hepática prejudicada⁷ ou hipotermia⁸. Além disso, os medicamentos administrados junto com os anestésicos afetam significativamente a profundidade da anestesia. Por exemplo, fentanil e propofol, frequentemente usados durante a fase de indução, reduzem a quantidade necessária de sevoflurano ^9,10. Além disso, foi demonstrado que a lidocaína ou a pregabalina podem diminuir a CAM do sevoflurano ^11,12. Além disso, a ingestão recente de álcool ou substâncias como o tetrahidrocanabinol (THC) também pode reduzir a CAM, aumentando a profundidade da anestesia^13,14. Por outro lado, tem sido sugerido que os agentes simpatomiméticos podem aliviar a sedação estimulando o sistema nervoso central¹⁵.

Para aumentar a reprodutibilidade para estudos futuros, um protocolo detalhado e descrições em vídeo para avaliar a CAM em ratos usando o desenho up-and-down de Dixon¹⁶ são fornecidos. Em contraste com estudos anteriores de MAC, este protocolo descreve etapas processuais detalhadas para apoiar a reprodutibilidade entre laboratórios. Além disso, imagens de vídeo de dois estudos publicados anteriormente foram reanalisadas e as respostas motoras foram classificadas com base em sua extensão e padrão (movimentos coordenados - rolamento, alongamento, saltatório e movimento descoordenado curling). Portanto, este estudo também oferece uma descrição e classificação inovadora e completa dos padrões de movimento em ratos sedados em resposta a um estímulo doloroso padronizado, com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade para pesquisas futuras.

Protocolo

Todos os estudos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê Intramural de Experimentação Animal da Universidade Médica de Viena e pela autoridade reguladora competente (Ministério Federal Austríaco da Mulher, Ciência e Pesquisa). Os experimentos foram conduzidos sob anestesia constantemente mantida. Os animais não percebem conscientemente a dor, mesmo que ocorra um movimento¹⁷. Foram utilizados ratos Wistar adultos com idades entre 81 e 95 dias.

1. Animais de estudo e alojamento

1. Alojar os animais de acordo com o peso e o sexo. Separe machos e fêmeas e os aloje por no mínimo 14 dias antes de iniciar o experimento para permitir a aclimatação. Coloque no máximo três ratos com mais de 400 g ou quatro ratos com menos de 400 g por gaiola.
2. Mantenha as condições ambientais com um ciclo claro/escuro de 12 horas, temperatura ambiente de 22 °C e níveis de umidade entre 45% e 65%.
3. Pese cada animal regularmente e registre o peso corporal antes de cada procedimento.
4. Transporte os animais individualmente da área de alojamento para a instalação de teste. Cubra cada gaiola com um pano para reduzir o estresse visual e aloje os animais não testados em uma sala separada para evitar a exposição a procedimentos experimentais.

2. Configuração do equipamento

1. Verifique se todos os equipamentos necessários estão funcionais e disponíveis antes de iniciar o experimento. Realize verificações de equipamentos de acordo com as diretrizes institucionais ou procedimentos operacionais padrão, incluindo testes de vazamento, calibração e testes de função de energia, quando aplicável.
2. Use uma câmara hermética e transparente (15 cm × 20 cm × 9 cm) para colocar o rato. Certifique-se de que a câmara esteja equipada com uma abertura de 15 mm para guiar externamente a cauda, minimizando o vazamento de gás.
3. Conecte a linha de entrada a um vaporizador de sevoflurano e a uma fonte de oxigênio.
4. Conecte a linha de saída no lado oposto da câmara a um sistema de extração de gás e a um monitor de anestesia para registrar as concentrações de sevoflurano.
5. Confirme se o termômetro retal, a manta de aquecimento e a lâmpada de aquecimento infravermelho estão operacionais. Teste o termômetro em relação a um dispositivo de referência, verifique se a manta de aquecimento atinge as faixas de temperatura desejadas e verifique se a lâmpada infravermelha acende e mantém uma saída estável. Posicione a lâmpada diretamente acima da câmara de teste a uma distância segura de acordo com os procedimentos de segurança locais.
6. Prepare uma pinça arterial de 25 cm para ser usada para o estímulo de dor padronizado.

3. Preparação de medicamentos

1. Preparação de THC (opcional)
   1. Use uma formulação de THC com concentração de 25 mg/mL. Calcule o volume necessário para cada animal multiplicando o peso corporal em quilogramas por (10 mg/kg/25 mg/mL), resultando em 0,4 mL por kg de peso corporal.
   2. Utilizar uma pipeta de deslocamento positivo para calcular o volume exacto calculado para cada animal. Não administrar nesta fase. Prepare a pipeta e reserve-a para administração posterior durante a etapa de administração do medicamento (consulte a etapa 4.6).
   3. Use uma ponta de pipeta adequada para gavagem, como uma que possa conter com segurança até 0,3 mL de fluido. Execute a gavagem oral diretamente usando a pipeta carregada. Descarte a ponta da pipeta após cada uso para evitar contaminação cruzada.
2. Preparação de etanol (opcional):
   1. Preparar etanol na concentração de dose necessária de 1 g/kg ou 2 g/kg. Use uma formulação altamente concentrada de etanol (por exemplo, 96-100%) como base e dissolva-a em solução salina a 0,9% até um volume total de 10 mL / kg de peso corporal para cada animal individual. Use o mesmo volume de solução salina sozinho que o placebo correspondente. Siga todas as diretrizes de segurança institucionais, particularmente aquelas relacionadas ao manuseio e armazenamento de substâncias inflamáveis.
   2. Use uma seringa adequada (5 mL ou 10 mL, dependendo do peso do animal) para elaborar o volume calculado exato para cada animal. Não administrar a substância nesta fase. Prepare a seringa e reserve-a para injeção intraperitoneal durante a etapa de administração do medicamento (consulte a etapa 4.6). Coloque uma agulha de 23 G para administração e cubra-a com uma tampa correspondente para evitar ferimentos até o uso.

4. Aplicação de medicamentos

1. Induza a anestesia para administração do medicamento, colocando o rato na câmara e inundando-o com sevoflurano a 3,5% vol em oxigênio a 100% a 3 L / min.
2. Espere aproximadamente 3-5 minutos até que o animal esteja visualmente inconsciente.
3. Realize o teste de reflexo de endireitamento inclinando suavemente a câmara para rolar o animal de costas. Se não tentar se endireitar dentro de 10 s, assuma a profundidade adequada da anestesia.
4. Reduza temporariamente a concentração de sevoflurano para 0 e lave a câmara com oxigênio a 100% por 15 s para minimizar a exposição ao gás anestésico para o experimentador.
5. Remova o animal da câmara e coloque-o na frente de um tubo de entrega de gás que forneça a mesma concentração de sevoflurano para manter a anestesia durante a administração. Pule esta etapa se a administração da substância de teste for breve o suficiente para evitar a recuperação da anestesia.
6. Administrar substâncias de acordo com o desenho experimental: Administrar 10 mg/kg de THC via gavagem gástrica ou administrar 1 g/kg ou 2 g/kg de etanol por via intraperitoneal. Consulte a Seção 3 para obter detalhes de preparação e siga as diretrizes institucionais para realizar os procedimentos de administração por gavagem e intraperitoneal.
7. Devolva o animal à gaiola para se recuperar.
8. Aguarde 1 h para etanol e 2 h para THC antes de continuar com o procedimento.

5. Indução anestésica para teste MAC

1. Após o período de espera, coloque o rato de volta na câmara de teste hermética e inunde-o com a mistura determinada de sevoflurano e oxigênio. Garanta um fluxo constante de oxigênio de 3 L/min. Determinar a concentração individual de sevoflurano (etapa 9.1) para cada animal, começando com 2,6% vol (ou outro ponto de partida predeterminado com base no planeamento estatístico) para o primeiro animal de cada grupo. Uma descrição detalhada do Up-and-Down-Design é fornecida abaixo.
2. Ligue a lâmpada de aquecimento infravermelho.
3. Espere aproximadamente 3-5 minutos até que o animal esteja visualmente inconsciente.
4. Realize o teste de reflexo de endireitamento inclinando suavemente a câmara para rolar o animal de costas. Se não tentar se endireitar dentro de 10 s, assuma a profundidade adequada da anestesia.
5. Reduza temporariamente a concentração de sevoflurano para 0 e lave a câmara com oxigênio a 100% por 15 s para minimizar a exposição ao gás anestésico para o experimentador.
6. Abra rapidamente a câmara e insira o termômetro retal. Monitore a temperatura corporal central durante todo o procedimento e ajuste a intensidade da lâmpada de aquecimento infravermelho e da manta de aquecimento de acordo.
7. Conduza a cauda para fora através da pequena abertura na câmara.
8. Feche a câmara rapidamente.
9. Restabeleça imediatamente a concentração desejada de sevoflurano antes de prosseguir.

6. Tempo de equilíbrio

1. Aguarde um período de 15 minutos para o equilíbrio.
2. Monitore continuamente a temperatura central do animal (37,2 °C ± 0,3 °C) e ajuste os dispositivos de aquecimento de acordo para manter a normotermia.

7. Estímulo da dor

1. Identifique o terço distal da cauda.
2. Aplique o estímulo da dor travando a pinça em sua terceira posição (aproximadamente 50 N de força).
3. Deixe a pinça travada em sua terceira posição até que o rato mostre uma resposta positiva de movimento, mas por no máximo 1 min.
4. Registre no protocolo a presença ou ausência de reação motora. Forneça uma breve descrição do movimento observado em termos de seu padrão e extensão. Consultar o ponto 11 para a classificação dos padrões de movimento.

8. Recuperação

1. Desligue o vaporizador e a lâmpada de aquecimento e coloque o rato de volta na gaiola.

9. Projeto para cima e para baixo

1. Determine a concentração de sevoflurano para o experimento a seguir usando o Up-and-Down-Design de Dixon. Se o animal anterior apresentou uma resposta motora ao estímulo, aumente a concentração para o próximo animal em 0,2%pt. Por outro lado, se o animal anterior não apresentou nenhuma resposta motora, diminuir a concentração em 0,2%pt.

10. Eutanásia (se aplicável)

NOTA: A eutanásia não é inerentemente uma parte necessária dos experimentos. Deve ser consultado o Comité Interno para as Experiências com Animais competente. Para os dois estudos referenciados, optou-se por realizar coletas de sangue intracardíaco e eutanasiar os animais posteriormente. Os animais não foram devolvidos à gaiola conforme descrito na etapa 8.1, mas, em vez disso, o procedimento continuou diretamente com a etapa 9.1.

1. Prepare a solução de eutanásia dissolvendo 300 mg de pentobarbital em 1 mL de solução salina. Aspire a solução para uma seringa e mantenha-a pronta para uso imediato após a coleta de sangue.
2. Retire o rato da caixa e coloque-o na frente de um tubo de respiração que fornece 3,5% de sevoflurano em 100% de oxigênio para manter a anestesia constante. Posicione o animal de costas para permitir o acesso desobstruído à área torácica.
3. Realize a coleta de sangue intracardíaco usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 5 mL. Palpe suavemente os batimentos cardíacos com um dedo para localizar o coração. Insira a agulha logo caudal ao processo xifóide, ligeiramente à esquerda da linha média e em um ângulo raso.
4. Aspire suavemente enquanto ajusta a posição da agulha até que o fluxo sanguíneo seja observado. Colete o volume necessário.
5. Depois de completar a coleta de sangue, remova cuidadosamente a seringa da agulha e coloque a seringa pré-carregada contendo a solução de pentobarbital. Administre todo o 1 mL da solução por via intracardíaca para garantir a eutanásia de acordo com as diretrizes éticas institucionais.

11. Continuando os experimentos

1. Repita o experimento a partir da etapa 3 para cada animal de estudo individualmente.

12. Classificação dos padrões de movimento (facultativo)

1. Classifique as respostas comportamentais nas seguintes categorias:
   1. Rolamento: Classifique como rolamento quando a resposta comportamental envolve uma rotação axial do corpo, normalmente ao longo do eixo longitudinal.
   2. Alongamento: Classifique como alongamento quando a resposta comportamental é caracterizada por uma extensão bilateral e simétrica dos membros e do corpo.
   3. Movimento saltatório: Classifique como movimento saltatório quando a resposta comportamental consiste em chutes ou solavancos repentinos e focados nos membros posteriores, semelhantes a rajadas curtas de todo o corpo.
   4. Curling: Classifique como curling quando a resposta comportamental envolve movimento descoordenado e direcionado para dentro de intensidade variável, fazendo com que o corpo se curve em direção ao seu centro.

Resultados

No estudo de THC, a estimativa de bootstrap da CAM foi de 2,8 vol% no grupo controle (IC 95%: 2,7-2,9 vol%) e 2,1 vol% no grupo de 10 mg/kg de THC (IC 95%: 1,8-2,4 vol%)¹³.

No estudo com etanol, a CAM estimada foi de 2,24 vol% no grupo controle (IC 95%: 1,97-2,94 vol%). No grupo etanol 1 g/kg, foi de 1,65 vol% (IC 95%: 1,40-1,98 vol%), e no grupo etanol 2 g/kg, 1,08 vol% (IC 95%: 0,73-1,42 vol%)¹⁴. O número diferente de casas decimais reflete as ...

Discussão

Este estudo refina o protocolo para determinar a CAM do sevoflurano em ratos, detalhando etapas metodológicas críticas e abordando desafios comuns para contribuir para uma abordagem mais padronizada e reprodutível para avaliar a profundidade anestésica.

A determinação precisa da CAM é essencial para as práticas anestésicas experimentais e clínicas. Este trabalho contribui para a literatura existente, fornecendo um método claro e reprodutível para avaliar a pot...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Câmara transparente hermética	N/A	N/A	Genérico
Braçadeira arterial	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Drä ger Primus	Drä ger Austria GmbH	Primus
Drä ger Vapor 2000	Drä ger Austria GmbH	Vapor 2000
Unidade de controle de manta homeotérmica	Aparelho de Harvard, Holliston, Massachusetts, EUA	50-7137	230 V
Manual Móvel Aquecedor Infantil	Fisher/Paykle, Auckland, Nova Zelândia	IW9210/920