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In vitro Reconstituição de Redes Citoesqueléticas no Interior de Vesículas Unilamelares Gigantes Separadas por Fase (GUVs)

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DOI:

10.3791/68530

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20 de junho de 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta uma reconstituição simples de redes do citoesqueleto dentro de vesículas gigantes separadas por fase. O método pode ser generalizado e aplicado ao encapsulamento ou confinamento de uma ampla gama de biomoléculas.

Resumo

As membranas lipídicas biomiméticas na forma de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) são comumente usadas para imitar o comportamento da membrana celular devido à facilidade de reconstituição de proteínas dentro de GUVs, visualização e compreensão da dinâmica membrana-proteína celular. No entanto, as membranas celulares compreendem jangadas lipídicas (ou domínios) decorrentes da presença de diferentes lipídios na membrana celular. Essa complexidade aumentada em sistemas modelo pode ser incorporada para resultar em GUVs separados por fase, onde a composição lipídica pode ser ajustada com precisão. Embora os métodos de encapsulamento para a geração de GUVs homogêneos sejam amplamente conhecidos, os métodos para encapsular proteínas dentro de GUVs separados por fase são limitados. Aqui, este protocolo apresenta uma produção simplificada de GUVs separados por fase, compostos por domínios desordenados líquidos (Ld) e ordenados líquidos (Lo), encapsulando eficientemente diferentes proteínas do citoesqueleto, ou seja, FtsZ e actina, tornando o método uma ferramenta versátil para a produção celular mínima. Especificamente, essa abordagem usa um protocolo de transferência de emulsão para produzir GUVs com alta eficiência de encapsulamento. Neste método, uma monocamada lipídica é gerada pela primeira vez emulsionando uma solução proteica em uma mistura lipídica / óleo, onde lipídios de diferentes temperaturas de transição de fase são escolhidos para produzir separação de fase nos GUVs resultantes. Esta emulsão é transferida suavemente sobre uma solução lipídica em óleo em outro tubo, resultando na formação de uma interface água-óleo. A solução é então centrifugada a temperaturas elevadas (idealmente a 37 °C para reter a atividade proteica), após o que os GUVs são coletados para geração de imagens. Este método simplifica a reconstituição in vitro de proteínas do citoesqueleto dentro de GUVs separados por fase sem usar uma configuração laboratorial complicada e, portanto, serve como um método conveniente para estudar a mecânica das interações citoesqueleto-membrana em confinamento.

Introdução

As vesículas gigantes servem como sistemas modelo para entender as funções celulares 1,2. Sua facilidade de produção, visualização, sintonia e reconstituição in vitro de biomoléculas tornam esses modelos biomiméticos o sistema de escolha para muitos estudos de pesquisa 3,4,5. Existem vários métodos conhecidos para fazer GUVs, como eletroformação6, cDICE 7,8, transferência de emulsão e outros métodos baseados em microfluídica 9,10. A produção de GUV com esses métodos é relatada na literatura 3,11. Além disso, in vitro, a reconstituição de redes de citoesqueleto dentro de GUVs foi descrita anteriormente usando um método de transferência de emulsão devido à facilidade desse método de formação de um pote, que não requer nenhuma configuração complexa12. No entanto, essa reconstituição é relatada muito comumente em GUVs homogêneos, um sistema que não imita totalmente a complexidade das membranas celulares.

Este protocolo descreve a reconstituição in vitro de redes de citoesqueletos dentro de GUVs separados por fase, exibindo a complexidade da membrana lipídica. Embora tais redes tenham sido relatadas anteriormente como se ligando à superfície da membrana (externa), mas não confinadas dentro das vesículas gigantes 13,14, a presente técnica de transferência de emulsão se concentra no protocolo para produzir separação de fases, bem como reter a atividade da formação da rede do citoesqueleto. Um dos maiores desafios dessa técnica é a temperatura. Os métodos de produção padrão para gerar GUVs separados por fase requerem o uso de temperaturas elevadas, que variam dependendo da temperatura de transição de fase dos lipídios constituintes. No entanto, as proteínas do citoesqueleto são incapazes de polimerizar em estruturas de ordem superior em temperaturas tão altas 15,16,17. Assim, este protocolo não apenas emprega uma composição lipídica para produzir separação de fases em GUVs à temperatura ambiente, mas também otimiza as condições para produzir um bom rendimento de GUVs em temperaturas fisiológicas.

Outro aspecto a ser considerado na produção de sistemas GUV reconstituídos é o volume das biomoléculas encapsuladas necessárias. Para a maioria das proteínas, a produção de volumes maiores pode ser cara e demorada, envolvendo várias rodadas de purificação. Além disso, os experimentos de reconstituição in vitro geralmente requerem uma fase exploratória inicial em que as concentrações de biomoléculas, composições de tampão, etc., são testadas primeiro para obter um conteúdo otimizado de solução interna. Assim, este protocolo otimiza o protocolo de produção GUV para dois ensaios diferentes, que se adaptam às premissas acima mencionadas. Por um lado, este protocolo descreve um ensaio que otimiza o protocolo padrão de emulsão invertida, que envolve volumes relativamente maiores de proteínas e gera produção de GUV de alto rendimento em tubos, que são posteriormente transferidos para placas de 96 poços de imagem. Por outro lado, a abordagem descrita aqui também otimiza o protocolo para produção de GUV separada por fase diretamente em placas de poços de imagem, que emprega volumes menores de biomoléculas (~ 1/4 das quantidades necessárias para a produção em tubos) e permite a geração de GUV em série, alcançando muitas condições encapsuladas em uma etapa de centrifugação. Assim, o protocolo apresentado aqui mostra um método de encapsulamento, mas permite que o usuário escolha qualquer configuração com base em seus requisitos.

Além disso, este protocolo descreve um método otimizado para encapsulamento para duas redes diferentes do citoesqueleto: FtsZ e actina. Como essas duas proteínas requerem diferentes condições de tampão e aglomeração, o protocolo aborda as mudanças subsequentes necessárias para alcançar a reconstituição ideal da rede. Portanto, a abordagem apresentada aqui pode ser usada e generalizada para encapsular quaisquer biomoléculas necessárias dentro de GUVs separados por fase.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação da mistura lipídica

  1. Tome 0,5 mL de clorofórmio em um frasco de vidro de 5 mL. Adicione 17,5 μL de DOPC, 7,4 μL de DOPG, 29,6 μL de DPPC (todos de 25 g/L de estoques lipídicos preparados em clorofórmio), 32,2 μL de 10 g/L de DPPG e 20,6 μL de 18 g/L de colesterol. Adicione 1,2 μL de corante Atto655-DOPE 1 g/L. Vortex suavemente a mistura lipídica e evaporar o clorofórmio sob fluxo de nitrogênio e ressuspender o filme fino em um total de 400 μL de clorofórmio.
  2. Para o encapsulamento de FtsZ, a mistura lipídica final preparada está na proporção DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (proporção de 17,499: 7,5: 31,5: 13,5: 30 mol) marcada com 0,001 mol% Atto655-DOPE. Para a produção de GUVs com actina encapsulada, a mistura lipídica contém lipídios biotinilados e é preparada na proporção DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17,499: 7,5: 30,5: 13,5: 30: 1) marcado com 0,001 mol% Atto655-DOPE.
  3. Dissolva a mistura lipídica (32 mM, 50 μL) em clorofórmio e seque em um frasco de vidro sob fluxo de gás N2 por ~ 15 min.
  4. O frasco de vidro é então armazenado sob vácuo em um dessecador por ~ 30 min para se livrar de quaisquer vestígios de clorofórmio residual.
  5. Disperse o filme seco em uma mistura de decano (20 μL) e óleo mineral (500 μL) no frasco de vidro para obter a concentração final de 3,2 mM e sonicar em temperaturas elevadas (~ 50 ° C) por ~ 30 min usando um sonicador de banho.
  6. Transfira a mistura de lipídios em óleo para um tubo e incube o tubo a 37 ° C por ~ 10 min antes de prosseguir para as próximas etapas.
  7. Prepare a mistura de encapsulamento interno para proteínas.

2. Preparação de soluções internas para encapsulamento

  1. Mistura de filamentos FtsZ
    1. Prepare a mistura de proteínas FtsZ em um volume total de 10 μL em um microtubo. Para a rede filamentosa FtsZ, adicione 0,87 μL de 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μL de 381 g/L Ficoll70, 1,11 μL de 271 g/L BSA e 1 μL de 25 mM GTP a 5,71 μL de tampão de reação FtsZ (RB). O volume total da solução é de 10 μL contendo 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g / L Ficoll70, 30 g / L BSA e 2,5 mM GTP na solução final. Mantenha-o no gelo antes de usá-lo para encapsulamento em GUVs.
      NOTA: O tampão de reação FtsZ (RB) contém 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de GluK, 5 mM de GluMg.
  2. Mistura de feixe de actina
    1. Para o encapsulamento de feixes de actina, primeiro prepare uma mistura master de actina de 10 μL (A-Mix) contendo 86% de G-actina, 10% de Atto488-actina e 4% de actina biotinilada em água. Para esta etapa, prepare soluções de estoque de proteína de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, para uma concentração final de 35,42 μM A-Mix, adicione 6,39 μ L de 2 g/L de G-actina, 1,48 μL de 1 g/L de Atto488-actina, 1,19 μL de 0,5 g/L de actina biotinilada e 0,9 μL de H2O. Mantenha no gelo e cubra da luz.
    2. Para evitar a pré-polimerização e o agrupamento de actina fora dos GUVs, prepare a solução final de actina minutos antes do encapsulamento. A solução final consiste em 7% de iodixanol, 0,01 g / L de neutravidina, 2,4 μM A-Mix, 0,6 μM de Fascin, 10 g / L de BSA, 20 g / L de Ficoll70 e 5 mM de ATP em tampão de polimerização de actina.
      1. Para preparar esta solução final, que deve ser mantida sempre no gelo, adicione na seguinte ordem: 2,92 μL de iodixanol a 60%, 10,25 μL H2O, 2,5 μL de 0,1 g/L de neutravidina, 0,92 μL de 271 g/L BSA, 1,31 μL de 381 g/L Ficoll70, 2,5 μL de tampão de polimerização de actina 10x, 1,69 μL de 35,42 μM A-Mix, 1,65 μL de 9 μM Fascin e 1,25 μL de 100 mM ATP. Misture bem e pegue rapidamente os 5 μL necessários para encapsular.
        NOTA: meça a osmolaridade desta solução interna com um osmômetro (~430 mOsm/Kg). Deve preparar-se uma mistura de solução exterior correspondente com a mesma osmolaridade, diluindo a glicose em água até atingir o mesmo valor de osmolaridade (ver passo 3.2). O tampão de polimerização de actina 10x contém 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de KCl e 50 mM de MgCl2.

3. Produção de GUV e encapsulamento in vitro

  1. Produção de GUV em tubos: encapsulamento de FtsZ
    1. Para encapsulamento de FtsZ, adicione 500 μL de tampão de reação FtsZ (RB) em um tubo de plástico de 1,5 mL e adicione suavemente 200 μL de mistura de lipídios em óleo (preparada na etapa 1.6 acima) para permitir a formação de uma interface óleo-água e a deposição de uma monocamada lipídica nesta interface.
    2. Para formar a emulsão, primeiro pegue outro tubo de 1,5 mL e adicione 200 μL de lipídio em óleo. Incubar este tubo a 37 °C durante ~10 min antes de formar a emulsão.
    3. Uma vez incubado, adicionar 5 μl da mistura de proteínas FtsZ (preparada em 2.1.1) a este tubo. A proteína de 5 μL em meio aquoso afunda no fundo do tubo como uma gota.
    4. Faça uma emulsão batendo suavemente no fundo do tubo 5-6 vezes até que a solução fique visivelmente turva.
    5. Pipetar suavemente esta emulsão e colocá-la sobre a interface óleo-água (preparada no passo 3.1.1 acima).
    6. Centrifugar a 6000 x g durante 30 min a uma temperatura pré-aquecida de 37 °C e manter esta temperatura até ao final da produção da vesícula.
    7. Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por quase 30 minutos antes de fazer a imagem.
    8. Remova a camada superior de óleo pipetando suavemente da parte superior do tubo, deixando quase 100-200 μL de solução para geração de imagens.
    9. Corte uma ponta de pipeta em um ângulo inclinado com uma tesoura e pegue suavemente 50-100 μL da solução GUV do fundo do tubo. Esta solução será usada para imagens.
  2. Produção de GUV diretamente em placas de 96 poços: encapsulamento de actina
    1. Para o encapsulamento de actina, primeiro prepare uma mistura de solução externa (glicose em água) com a mesma osmolaridade da mistura interna de actina. Para corresponder aos ~ 430 mOsm / Kg da mistura interna, faça uma mistura de solução externa adicionando 198 μL de glicose 2 M em 802 μL H2O.
    2. Para fazer as vesículas diretamente em uma placa de poço, primeiro passivar um poço de uma placa de 96 poços. Adicione 100 μL de 10 g/L de BSA no poço e incube por 10-15 min. Em seguida, lave o poço com 100 μL de solução externa cinco vezes, tomando cuidado para não tocar no fundo de vidro passivado com a ponta da pipeta. Deixe 100 μL da mistura de solução externa no poço após concluir a lavagem.
    3. Adicione suavemente 50 μL de mistura de lipídios em óleo ao poço para preparar a monocamada lipídica sobre a solução externa. Para garantir uma deposição correta do óleo sobre a fase aquosa, apoie a ponta da pipeta em um lado do poço e deixe o óleo deslizar da parede do poço.
    4. Para formar a emulsão, primeiro pegue um tubo de 1,5 mL e adicione 100 μL de lipídio em óleo. Incubar este tubo a 37 °C durante ~10 min antes de formar a emulsão.
    5. Adicione 2,5 μL da solução final de actina (da etapa 2.2.2) ao tubo contendo 100 μL de mistura de lipídios em óleo (etapa 1.6 acima). A proteína de 2,5 μL em meio aquoso afunda no fundo do tubo como uma gota.
    6. Faça uma emulsão batendo suavemente no fundo do tubo 10-20 vezes até que a solução fique visivelmente turva.
    7. Pipetar suavemente esta emulsão e colocá-la sobre a interface óleo-água (preparada no passo 3.2.3 acima). Mergulhe cuidadosamente a ponta da pipeta no meio da monocamada de óleo e deposite a emulsão. A emulsão forma uma nuvem turva confinada na fase monocamada de óleo.
    8. Centrifugar a placa de 96 poços a 200 x g durante 20 min a uma temperatura pré-aquecida de 37 °C e manter esta temperatura até ao final da produção da vesícula.
      NOTA: Centrifugue a 400 x g por 10 min para encurtar o tempo de produção da vesícula. No entanto, atenha-se a esses parâmetros de centrifugação para obter melhores resultados. A centrifugação acima de 400 x g resulta em vesículas compactadas com agregados lipídicos acumulados na parte inferior da placa de imagem.
    9. Deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente por quase 30 minutos antes de fazer a imagem.
      NOTA: A imagem direta pode ser realizada em um poço sem a necessidade de remover a camada superior de óleo ou transferir as vesículas para outra câmara/poço.

4. Imagem e reconstrução de imagem 3D

  1. Pegue uma placa de poço de imagem 96 e passiva-a com BSA por ~ 10 min antes de transferir a amostra para a placa do poço de imagem (consulte a etapa 3.2.2).
  2. Transfira a solução GUV para a placa de poço passivado.
  3. Configure a placa do poço no palco de um microscópio confocal invertido em uma objetiva de água de 40x.
  4. Concentre-se em qualquer região de interesse (ROI) e obtenha uma sequência de imagens z-stack do ROI escolhido com intervalos fixos de z-step. O protocolo resulta em GUVs de tamanho de 5-30 μm, de modo que o intervalo pode ser fixado em 0,5-1 μm, conforme necessário.
  5. Salve cada sequência de imagens z-stack em .tiff formato.
  6. Abra uma sequência de imagens de interesse em um software de processamento de imagens (ImageJ/Fiji). Identifique a imagem com a intensidade mais alta. Segure ctrl+shift+c para abrir a janela Brilho e Contraste e clique em Automático.
  7. No menu ImageJ/Fiji, vá para Analisar > Definir escala e insira a distância física conhecida e sua unidade para cada pixel da imagem.
  8. No menu ImageJ/Fiji, vá para Pilhas de > de imagem > projeto Z para reconstruir uma imagem 3D da pilha z. Defina o Tipo de projeção como Desvio padrão. As opções padrão podem ser usadas para o restante das configurações (Iniciar fatia e Parar fatia).
    NOTA: cuidado com os artefatos de projeção de desvio padrão decorrentes da sobreposição de pilhas z na reconstrução 3D. Para garantir que não haja artefatos, remova as pilhas z no hemisfério inferior da esfera para observar apenas a metade superior da projeção.

5. Análise estatística da frequência GUV com base no tamanho

  1. Adquira imagens de pilha Z dos GUVs de interesse, conforme explicado nas etapas 4.4 e 4.5. Para criar imagens do maior número possível de GUVs em um amplo campo de visão, adquira pilhas confocais com zoom de 1x ou 2x.
  2. Abra as sequências Z-stack em um software de processamento de imagem (neste caso, ImageJ/Fiji), conforme explicado em 4.6.
  3. Selecione o canal de exibição onde o sinal de fluorescência da membrana foi adquirido clicando na barra rotulada como c abaixo da imagem. Ajuste o brilho e o contraste da imagem conforme explicado em 4.6.
  4. Navegue pelos diferentes planos adquiridos clicando na barra z abaixo da imagem aberta. Selecione o plano onde o diâmetro da vesícula a ser analisada é o maior.
  5. Abra o gerenciador de ROI no ImageJ/Fiji clicando em Analisar ferramentas > > Gerenciador de ROI.
  6. Nas ferramentas disponíveis no painel principal do ImageJ/Fiji, clique na seleção oval.
  7. Desenhe um círculo que se ajuste ao GUV seguindo a intensidade de fluorescência da membrana GUV. Para desenhar uma seleção de círculo, pressione a tecla shift e arraste o mouse para expandir o círculo até o tamanho da vesícula. A seleção do círculo pode ser movida clicando simultaneamente com o botão esquerdo do mouse no centro da vesícula e arrastando o mouse para o local desejado.
  8. Armazene a seleção de círculo desenhada no ROI Manager clicando em Add [t], localizado no painel de opções do ROI Manager.
  9. Para obter o tamanho da vesícula em mícrons, clique em Medir localizado no painel do ROI Manager. Uma nova janela aparecerá. Considere o valor exibido na coluna Principal ou Secundária (ambas as colunas devem ter o mesmo valor, pois se referem aos eixos da elipse) como a medida do diâmetro da vesícula.
  10. Use o software de plotagem (Excel, Origin, Prism) para criar um gráfico de barras onde a fração de GUVs para diferentes faixas de tamanho é especificada.

Resultados

Como primeiro passo, GUVs com separação de fase por membrana foram produzidos seguindo uma abordagem de emulsão invertida modificada (Figura 1A). Isso resulta em um alto rendimento de GUVs, que exibem uma membrana desmisturada em domínios Ld e Lo , conforme representado pelo rótulo Atto 655-DOPE no domínio Ld e regiões escuras correspondentes a domínios Lo não marcados (Figura 1B). Este método produz GUVs separados por fase de tamanhos que variam de 5 a 30 μm (Figura 1C) em temperaturas elevadas (todas as etapas realizadas a 37 ° C e fotografadas em RT). Além disso, as velocidades de centrifugação foram ajustadas para garantir a incorporação dos lipídios componentes originais nos GUVs, bem como para evitar a superpopulação excessiva.

Além disso, para demonstrar o encapsulamento bem-sucedido de biomoléculas usando o método de emulsão descrito no protocolo atual, as redes FtsZ e actina foram reconstituídas em experimentos individuais. As redes FtsZ são recapituladas dentro de GUVs, que emergem como filamentos que se ligam preferencialmente a domínios Ld por meio de sua sequência de direcionamento de membrana (MTS) na presença de 2,5 mM GTP e 50 g / L Ficoll70 (conforme ilustrado na Figura 2). As redes foram observadas aproximadamente 1 h após a etapa de encapsulamento. No entanto, as redes de actomiosina emergem como feixes finos (em contraste com as redes espessas de FtsZ) após a reconstituição dentro de GUVs (Figura 3). Deve-se notar que os lipídios biotinilados desempenham um papel crucial na ligação das redes de actomiosina à membrana dos GUVs. Sem lipídios biotinilados, os feixes de actomiosina não podem adotar uma configuração curva e permanecer como feixes retos, curtos e rígidos no lúmen, em vez de aderir à membrana como uma malha emaranhada de feixes longos (Figura 4).

No protocolo de emulsão modificado, a velocidade de centrifugação é ajustada para obter GUVs separados por fase, conforme mencionado anteriormente. De fato, velocidades de centrifugação mais altas com amostras contendo redes de actomiosina (600 x g por 15 min) resultam na agregação de vesículas em uma configuração semelhante a um tecido dentro do poço de produção. Assim, em todos os experimentos de reconstituição padrão de redes de actomiosina, a velocidade ideal de centrifugação foi definida em 200 x g para obter GUVs não agregados (Figura 5).

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Figura 1: Geração de GUVs separados por fase em um pote empregando o método de transferência de emulsão dupla. (A) Esquema experimental das principais etapas na produção de vesículas separadas por fase por meio de transferência de emulsão dupla. (B) Imagem de projeção Z confocal dos GUVs resultantes gerados seguindo o método descrito em A. A barra da escala é de 50 μm. (C) Gráfico de barras com a fração de GUVs separados por fase gerados de acordo com seu diâmetro. Experimentos realizados n = 3, o número total de GUVs analisados por experimento = 100. Os dados mostrados como valores médios, os pontos de dados individuais são os três experimentos independentes. As barras de erro representam o desvio padrão dos três experimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Vesículas separadas por fase com redes FtsZ encapsuladas. (A) Imagens de projeção 3D confocais realizadas em uma pilha z totalmente adquirida de um GUV separado por fase contendo uma rede FtsZ. (B) Imagens confocais de projeção Z realizadas apenas na metade superior da vesícula. Devido à formação heterogênea de domínios sobre a superfície do GUV, a reconstrução 3D dos cortes confocais adquiridos mostra a sobreposição de domínios lipídicos das áreas superior e inferior da vesícula. Para evitar sobreposições e facilitar a inspeção visual dos domínios, a metade inferior das pilhas z adquiridas é removida do arquivo. A metade superior resultante é então usada para sua projeção 3D por meio de desvio padrão. As barras de escala são ambas de 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Vesículas separadas por fase com redes de actomiosina encapsuladas. (A) Imagens confocais de projeção Z de uma pilha inteira adquirida com uma visão de zoom do poço após a produção da vesícula. O alto rendimento de vesículas obtido permite o estudo de diferentes estruturas de actomiosina dentro das vesículas. A barra de escala é de 50 μm. (B) Imagens confocais de projeção Z realizadas na metade superior de uma vesícula. Para facilitar a análise visual dos domínios lipídicos, apenas a metade superior das fatias da imagem é usada para realizar uma projeção 3D. A barra de escala é de 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Importância dos lipídios biotinilados para a geração de redes de actomiosina ligadas à membrana dentro de vesículas separadas por fase. Projeções 3D confocais representando vesículas separadas por fase com redes de actomiosina não anexadas. Se os lipídios biotinilados não forem incorporados à mistura, as estruturas de actomiosina se formam no lúmen e não adquirem uma configuração curva no folheto interno das vesículas (painel direito, actina marcada com Atto488). A barra de escala é de 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Efeito da velocidade de centrifugação na produção de vesículas separadas por fase por meio de transferência de emulsão. Imagens 2D confocais mostrando uma amostra GUV gerada empregando uma força de centrifugação de 600 x g por 15 min. A velocidade de centrifugação empregada, superior aos 200 x g otimizados, resulta na agregação de vesículas em uma configuração semelhante a um tecido dentro do poço. A barra de escala é de 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Um dos principais desafios para a reconstituição in vitro de sistemas modelo baseados em membrana é o encapsulamento de proteínas dentro de GUVs separados por fase devido à sua preparação em altas temperaturas. De fato, a geração desse tipo de vesículas separadas por fase por meio da síntese de um pote pode levar a dificuldades decorrentes da degradação de proteínas em temperaturas elevadas. Assim, este protocolo descreve as condições otimizadas para observar a separação de fases da membrana seguindo o método de emulsão dupla para produção de GUV em temperaturas fisiológicas, mantendo simultaneamente a atividade das proteínas encapsuladas. Essa abordagem introduz uma carga negativa em ambos os domínios para facilitar a ligação de quaisquer proteínas desejadas quando as interações eletrostáticas são um pré-requisito. No caso de encapsulamento de FtsZ, apesar da presença de carga negativa em ambos os domínios, as redes do citoesqueleto se desenvolvem e se ligam preferencialmente aos domínios Ld , indicando que, juntamente com a carga negativa, a fluidez da membrana é um requisito essencial para a ligação às proteínas18. Além disso, no caso do encapsulamento de actina, as redes se desenvolvem sobre regiões de membrana onde lipídios biotinilados são incorporados19.

Embora o ensaio de transferência de emulsão seja amplamente utilizado na literatura, ele só tem sido aplicado na produção de GUVs homogêneos. Este protocolo, portanto, consiste em vários aspectos modificados do ensaio, que permitem a observação da formação de domínio na membrana. Um dos principais aspectos a esse respeito é a temperatura. Para observar domínios, bem como para manter a funcionalidade das proteínas (especificamente a formação da rede citoesquelética), este protocolo emprega 37 ° C para produzir GUVs. Por um lado, quando os GUVs são produzidos a uma temperatura mais alta, as proteínas encapsuladas perdem sua funcionalidade, residindo no lúmen e não polimerizando em estruturas de ordem superior. Por outro lado, se os GUVs forem produzidos a uma temperatura mais baixa, a separação de fases não é observada na membrana. Assim, 37 °C torna-se a temperatura ideal para a produção de GUV nos experimentos.

É importante notar que este protocolo fornece dois sistemas de ensaio possíveis para produzir GUVs seguindo o mesmo princípio de transferência de emulsão: dentro de tubos e placas de poço. Ambos apresentam vantagens e desvantagens, que o usuário pode precisar levar em consideração durante a fase de planejamento experimental para determinar qual sistema melhor se adapta às suas necessidades. De fato, os tubos de plástico não requerem uma centrífuga equipada com rotor para placas de poços, são mais fáceis de manusear e permitem o controle do fator de diluição das vesículas após a produção e antes da imagem. No entanto, eles exigem volumes maiores (para as fases oleosa e aquosa) e remoção da camada de óleo após a produção para extração de GUV, o que pode deixar restos de óleo no poço de imagem se essa etapa não for executada com cuidado. Alternativamente, as placas de poço requerem o uso de menos volume de amostra, permitem o encapsulamento de diferentes condições internas em série e de uma só vez, e não requerem extração GUV, pois as vesículas podem ser visualizadas logo após a produção no mesmo poço de produção. A principal desvantagem das placas de poços é a agregação de vesículas e a necessidade de ajustar os parâmetros de centrifugação para atingir um rendimento de produção de vesículas semelhante ao observado em tubos.

Independentemente do sistema de encapsulamento empregado (tubos ou placas de poços), essa abordagem mostra que condições ótimas de aglomeração são necessárias para produzir os GUVs, bem como para facilitar a polimerização de proteínas encapsuladas. Em particular, seguindo este protocolo, a melhor condição para GUVs com FtsZ encapsulado foi observada com 30 g/L de BSA e 50 g/L de Ficoll7018; enquanto para a actina, foi necessária uma mistura de 10 g/L de BSA, 7% de iodixanol e 20 g/L de Ficoll7019.

Outro aspecto importante da produção de GUV é a velocidade e o tempo de centrifugação. Para a formação de redes FtsZ sob as concentrações de aglomeração acima mencionadas, a centrifugação a 6000 x g por 30 min produz uma população de GUVs que são bem distribuídas e separadas sobre a placa do poço de imagem. Por outro lado, para a actina, 200 x g por 20 min permite a geração de um alto rendimento de produção GUV. Se a velocidade ou o tempo de centrifugação diminuir, o rendimento dos GUVs é afetado, enquanto aumentá-lo acima dos valores mencionados leva à agregação de GUVs. Sob as referidas condições, este protocolo gera GUVs com eficiência máxima de encapsulamento, bem como GUVs individuais que não aderem juntos.

Embora este protocolo possa ser generalizado para quaisquer lipídios e biomoléculas encapsuladas, a composição da membrana desejada e o conteúdo das vesículas ditam os parâmetros de centrifugação, que permitem a geração de vesículas separadas por fase. Portanto, este protocolo serve como uma diretriz para permitir a produção de diversas vesículas com domínios de membrana.

Tais metodologias de reconstituição in vitro dentro de GUVs separadas por fase são cruciais para compreender a intrincada dinâmica proteína-membrana mediada por domínios lipídicos, considerando a complexidade das membranas celulares14. O tamanho pequeno e a natureza altamente dinâmica desses domínios lipídicos dificultam a caracterização das interações interfaciais in vivo. Assim, os GUVs servem como uma ferramenta vital devido à sua relativa facilidade de preparo e modulação físico-química, bem como sua adequação para análise por microscopia de luz20.

Além disso, o encapsulamento de moléculas funcionais dentro de biointerfaces heterogêneas apresenta aplicações promissoras no campo da nanomedicina. Em particular, o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos funcionalizados com diferentes propriedades decorrentes da distribuição assimétrica e partição de biomoléculas em áreas confinadas em sua superfície21. As interações fármaco-lipídico desempenham um papel significativo nas propriedades farmacocinéticas dos fármacos, como seu transporte, distribuição e acúmulo, que acabam influenciando a eficácia dos fármacos utilizados22. Portanto, entender o papel dessas interações nas propriedades farmacocinéticas dos medicamentos é fundamental no desenvolvimento de medicamentos eficazes. Membranas lipídicas modelo podem ser exploradas para entender seus mecanismos de interações com peptídeos, polímeros e nanocarreadores23. Assim, mudanças na composição lipídica de células e tecidos em certas condições de doença podem alterar as interações biofísicas, que podem ser exploradas para desenvolver medicamentos específicos e sistemas de liberação de medicamentos24.

Em conclusão, o protocolo aqui descrito fornece uma estratégia fácil para gerar GUVs separados por fase com proteínas encapsuladas ancoradas em seu folheto lipídico interno. A geração desses sistemas vesiculares tem uso promissor em campos como biotecnologia e biologia sintética, onde montagens multicomponentes com funcionalidades complexas para imitar funções semelhantes a células podem trazer soluções inovadoras e novas aplicações.

Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao MPIB Core Facility pela assistência na purificação de proteínas, Michaela Schaper pela clonagem de plasmídeos, Kerstin Röhrl pela purificação de proteínas e Sandra Ortmeier pelas preparações lipídicas. Os autores também gostariam de agradecer a Adrián Merino-Salomón e Shunshi Kohyama pelas discussões úteis sobre as condições de crowder e o encapsulamento de proteínas. M.R.-L. faz parte do IMPRS-ML e do Projeto ONE MUNIQUE apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF), bem como pelo Estado Livre da Baviera sob a Estratégia de Excelência do Governo Federal e dos Länder. Os autores também gostariam de agradecer o apoio do Centro de Nanociência (CeNS), Munique.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (DOPG)Avanti Lipídios polares840475Em clorofórmio
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)Avanti Lipídios polares850375Em clorofórmio
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal de sódio) (18:1 Biotinyl Cap PE)Avanti Lipídios polares870273In clorofórmio
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sal de sódio) (DPPG)Avanti Lipídios polares840455Em clorofórmio
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)Avanti Lipídios polares850355Em clorofórmio
96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)
Actin (músculo esquelético alfa-actina, coelho)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (músculo esquelético alfa-actina, coelho)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16Banho
de Pó SonicatorBranson 1510R-MTHBransonic Limpador Ultrassônico
Biotina-Actina (músculo esquelético alfa-actina, coelho)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
CentrífugaEppendorf5424R
CentrífugaEppendorf5804 R
ClorofórmioSigma Aldrich67-66-3
Colesterol (ovino)Avanti Lipídios polares700000Em clorofórmio
DecanoTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (humano, recombinante)Citoesqueleto Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 microscópio de varreduraCarl ZeissC-Apochromat 40  &vezes;  /1,2 objetiva de imersão em água. Lasers de estado sólido bombeados por diodo: 488  nm e 640  Nm.
Óleo mineralSigma Aldrich8042-47-5
Miosina II (músculo esquelético de coelho)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinaThermo Fisher Scientific Inc.31000
OsmômetroFiske AssociatesFiske Micro-Osmômetro modelo 120
Greiner Bio-One  GmbH07-000-109
Laser confocal

Referências

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