In vivo Microscopia confocal: um procedimento operacional padrão para a detecção de ácaros Demodex na margem da pálpebra

Resumo

A microscopia confocal in vivo é uma técnica de imagem promissora com alta resolução. Apresentamos o seguinte procedimento para os médicos detectarem Demodex na margem palpebral in vivo.

Resumo

A infestação por ácaros Demodex pode causar inflamação da margem palpebral, e a blefarite Demodex pode dar origem a uma série de condições oculares em casos clínicos. Numerosos médicos diagnosticam a infestação ocular dos ácaros Demodex por meio da depilação dos cílios e da observação dos cílios sob microscopia de luz in vitro. No entanto, a presença de ácaros residuais após a remoção dos cílios e a dor associada ao procedimento são limitações do tratamento clínico padrão.

A microscopia confocal in vivo (IVCM) é uma técnica de imagem não invasiva que permite aos médicos observar os ácaros Demodex na margem da pálpebra em detalhes sem depilação. Esta técnica permite uma análise indolor que pode ser concluída em <30 min. Apesar da crescente atenção dada a este exame, ele pode ser inacessível para muitos oftalmologistas sem vasta experiência. Este artigo apresenta um procedimento operacional padrão para a visualização de ácaros Demodex na margem palpebral com IVCM para promover o aumento da adoção desse método no trabalho clínico.

Introdução

A blefarite é um dos diagnósticos oftalmológicos mais comumente encontrados na prática clínica. Evidências sugerem uma associação significativa entre a presença de ácaros Demodex e blefarite¹. A infestação de ácaros envolve tanto o dano direto causado pelo Demodex² quanto as respostas imunes desencadeadas por suas secreções, que podem atuar como vetor de bactérias e potencialmente contribuir para o desenvolvimento da blefarite³. A blefarite por Demodex (DB) causa um espectro de eventos insatisfatórios, incluindo danos à córnea e à superfície ocular¹, que afetam negativamente a qualidade de vida do paciente ^4,5.

O Demodex é um ácaro parasita que habita os folículos pilosos e as glândulas sebáceas, bem como as áreas próximas a eles⁶. A detecção de Demodex dentro ou ao redor dos folículos dos cílios pode ajudar no diagnóstico de DB⁷. O diagnóstico clínico de DR envolve a depilação dos cílios e a observação de Demodex sob microscopia de luz. No entanto, reconhece-se que muitos ácaros que residem profundamente no folículo podem permanecer no orifício após a remoção dos cílios ^8,9,10, potencialmente levando a uma subestimação da contagem de ácaros. A microscopia confocal in vivo (IVCM), uma ferramenta de imagem não invasiva em oftalmologia, oferece uma abordagem alternativa para visualizar Demodex dentro ou ao redor dos folículos dos cílios in vivo¹¹. Essa técnica fornece uma visão das microestruturas da superfície ocular e das pálpebras com resolução semelhante à^histologia11. Os ácaros podem ser identificados visualmente com base em sua morfologia e motilidade características. No entanto, a CIVM pode apresentar desafios técnicos para oftalmologistas sem ampla experiência com essa modalidade de imagem¹².

Para facilitar a adoção da CIVV em aplicações clínicas de rotina, incluindo o diagnóstico diferencial e acompanhamento de pálpebras saudáveis, bem como DB, propomos um procedimento operacional padrão (SOP) para observar os ácaros Demodex na margem palpebral. Este protocolo fornece aos médicos uma abordagem sistemática para detecção de ácaros in vivo.

Protocolo

Este protocolo enfoca o SOP usado para observação de Demodex na margem palpebral com CIV (Figura 1). Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Eye Hospital, Wenzhou Medical University (aprovação IRB nº H2023-022-K-20), e a exigência de consentimento individual para esta análise retrospectiva foi dispensada devido à natureza retrospectiva. Os procedimentos aqui descritos fazem referência às descrições relatadas anteriormente 11,13,14,15,16.

Figura 1: O dispositivo de tomografia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Prepare o dispositivo e o programa

1. Ligue o computador.
   1. Depois que a área de trabalho aparecer, mude a chave basculante na parte traseira do dispositivo de O para I. Procure o brilho verde da chave basculante indicando que o dispositivo está ligado antes de iniciar qualquer exame.
      NOTA: Ligar o dispositivo antes de iniciar o computador pode resultar em falha de conectividade.
   2. Inicie o software e defina as configurações do programa antes do exame. No menu Configuração , selecione Opções (Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S1); em seguida, marque a caixa Mostrar números de imagem para exibir o número da imagem de cada imagem. Além disso, marque a caixa Mostrar informações na saída para evitar o desligamento não intencional do software.
      NOTA: A exibição das miniaturas das imagens como ícones grandes facilita a observação direta dos resultados. Não altere as configurações com frequência.
2. Preparativos antes do exame
   1. Limpe a lente com lenços de limpeza de lentes. Desinfete o encosto de cabeça e o apoio de queixo com bolas de algodão embebidas em álcool para evitar infecções resultantes de germes patogênicos transmitidos por peças sujas do dispositivo.
   2. Ajuste o apoio de queixo. Certifique-se de que a posição horizontal do apoio de queixo está correta: pressione as duas alavancas pretas para puxar o apoio de queixo para frente até que ele se prenda.
   3. Mova a câmera para trás. Gire o parafuso de ajuste para certificar-se de que ele se afaste do paciente antes do exame.
   4. Aplique uma gota (aproximadamente 0.02 mL) de gel oftálmico à base de carbômero como gel de contato na superfície frontal da lente do microscópio do dispositivo.
      NOTA: Certifique-se de que o gel de contato esteja livre de bolhas de ar e que apenas uma pequena quantidade seja usada. Muito gel de contato aplicado na superfície frontal da lente do microscópio do dispositivo pode fluir para a objetiva e aderir aos componentes mecânicos, causando danos ao dispositivo.
   5. Remova uma tampa estéril e descartável de polimetilmetacrilato (PMMA) de sua tampa protetora e pressione as laterais da tampa firmemente na lente do microscópio do dispositivo sem tocar na superfície anterior da tampa (Figura 2).
      NOTA: Para encaixar a tampa de PMMA corretamente, certifique-se de que o gel de contato esteja em contato com a superfície posterior da tampa sem bolhas de ar. As tampas são armazenadas no recipiente dedicado para evitar danos à embalagem estéril. Não use tampas com embalagem danificada, pois podem apresentar risco de infecções durante o exame.
   6. Aplique uma única gota de substituto de lágrima de gel na superfície frontal da tampa como uma ponte de gel entre a tampa e a pálpebra (Figura 2).
      NOTA: Para evitar confusão entre os géis, usamos o mesmo gel oftálmico à base de carbômero para ambas as aplicações: o substituto de lágrima em gel e o gel usado como agente entre a lente do microscópio e a tampa.
   7. Crie um novo arquivo de paciente ou selecione um arquivo de paciente existente.

Figura 2: O ajuste correto da tampa de PMMA e aplicação de gel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Prepare o paciente

NOTA: Não realize este exame se a integridade da córnea for questionável.

1. Para obter a cooperação do paciente e minimizar os riscos potenciais, explique o seguinte ao paciente:
   1. Assegure ao paciente que o exame com o dispositivo é seguro, mesmo que toque a pálpebra. Informe ao paciente que seu olho será anestesiado por uma gota de um anestésico tópico na margem da pálpebra.
   2. Ao iniciar o exame, peça ao paciente para colocar o queixo no apoio de queixo e encostar a testa no apoio de testa durante todo o procedimento de exame para obter a melhor qualidade de imagem.
   3. Informe ao paciente que o dispositivo será movido para perto da pálpebra até que a tampa do PMMA o toque. Assegure-os de que não sentirão dor enquanto o dispositivo tocar sua pálpebra, embora sintam o contato da tampa de PMMA. Peça-lhes que informem o médico imediatamente se sentirem alguma dor durante o exame.
   4. Informe ao paciente que ele deve manter o olhar firme enquanto o clínico adquire imagens da margem palpebral para a observação do Demodex. Peça ao paciente para informar ao médico se sentir algum cansaço; Eles poderão sentar e descansar um pouco antes que o exame continue. Eles serão informados assim que o exame for concluído.
2. Siga as instruções na embalagem do anestésico tópico e/ou gel para os olhos para evitar contraindicações do medicamento. Pergunte ao paciente se ele tem alguma alergia para confirmar que as alergias do paciente não são contra-indicações do anestésico tópico e/ou gel para os olhos.
   NOTA: Reações alérgicas ao anestésico tópico e / ou gel para os olhos podem ocorrer como resultado de alergias não identificadas.
3. Aplique uma gota de cloridrato de proparacaína, um anestésico tópico, na margem da pálpebra a ser examinada.
   NOTA: Se ocorrer uma reação alérgica, enxágue com solução salina imediatamente.

3. Faça um exame

1. Observe o olho direito primeiro. Mova a câmera de varredura para a esquerda do ponto de vista do operador. O OD será selecionado automaticamente na seção Configurações pelo reconhecimento direito-esquerdo da câmera.
2. Mova a câmera CCD para a esquerda. Gire a lente objetiva da câmera CCD para ajustar a imagem da câmera CCD (a imagem de controle) perpendicularmente ao eixo óptico da câmera a laser do scanner.
3. Inicie um novo exame.
   1. Observe a caixa de diálogo Dados do exame e, na guia Dados do exame , selecione Tomógrafo de retina Heidelberg-Córnea na lista suspensa Dispositivo (Arquivo suplementar 1: Figura suplementar S2) e observe a caixa de diálogo Configurações do módulo de córnea exibida.
   2. Selecione FOV 400 na lista suspensa Field Lens e clique em OK para confirmar (Supplemental File 1: Supplemental Figure S3).
   3. Aguarde até que a janela de aquisição seja aberta; A imagem ao vivo da câmera a laser de varredura e a imagem de controle são exibidas. Se a imagem de controle não for exibida, certifique-se de que o cabo da câmera CCD esteja conectado corretamente à câmera CCD e reinicie a janela de aquisição.
4. Defina os fatores na janela de aquisição (Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S4): selecione 1x na lista suspensa Fator de Zoom CCD para definir o tamanho da imagem de controle. Marque a caixa Brilho automático e a caixa Automático para controlar automaticamente o brilho das imagens ao vivo e de controle. No entanto, se o controle automático de brilho estiver desativado, use o controle deslizante para controlar o brilho do controle e das imagens ao vivo. Verifique se o tipo de digitalização de Section foi selecionado para que uma única imagem seja adquirida e armazenada cada vez que o pedal for pressionado.
5. Adquira uma imagem de referência.
   1. Antes de iniciar uma aquisição, desative o controle automático de brilho e mova o controle deslizante para a esquerda para ajustar o brilho da imagem. Ajuste o plano focal com o pino de ajuste para que o reflexo brilhante inicial seja exibido na imagem ao vivo da câmera a laser de varredura após escurecer, indicando a superfície anterior da tampa de PMMA.
      NOTA: O microscópio permite ajustes focais de 10 μm.
   2. Clique em Redefinir na seção Posição de foco [μm] e aguarde até que o valor de Posição de foco [μm] mude para 0; A imagem atual é indicada como a imagem de referência. Desative a reinicialização automática e marque a caixa Brilho automático ; O brilho da imagem ao vivo será controlado automaticamente.
   3. Se forem exibidas linhas tracejadas em vez de valores na seção Posição de foco [μm], ou se os valores exibidos não mudarem apesar dos ajustes no plano focal, certifique-se de que o cabo da lente do microscópio esteja conectado corretamente.
      NOTA: A posição de foco [μm] para paquimetria exibe a posição do plano focal da imagem exibida no momento em mícrons. Se o plano focal for movido posteriormente, a localização real do plano focal é calculada em relação à posição da imagem de referência.
6. Eleve ou diminua a altura da mesa de exame para o paciente. Coloque o queixo do paciente no apoio de queixo e a testa contra o apoio de testa (Figura 3A,B). Ajuste a elevação do apoio do queixo através do parafuso de ajuste preto designado do dispositivo para que as pálpebras superiores do paciente se alinhem com as marcas vermelhas na coluna do encosto de cabeça.
7. Diga ao paciente para olhar para baixo à frente da fonte de luz fixa do ponteiro e manter o olhar firme (Figura 3A, B).
   NOTA: O movimento dos olhos durante a coleta de imagens pode resultar em má qualidade de imagem e danos à superfície ocular.
8. Use um cotonete para virar a pálpebra superior, expondo totalmente a raiz dos cílios e a margem palpebral. Posicione o reflexo do feixe de laser no nível da pálpebra superior do paciente girando o parafuso de ajuste do dispositivo. Mova a câmera a laser de varredura lentamente em direção à margem superior da pálpebra do paciente até que ela toque suavemente o centro da tampa de PMMA verticalmente (Figura 3C). Se o paciente relatar desconforto, faça uma pausa e verifique o alinhamento da tampa de PMMA.
   NOTA: Não aplique muita pressão na pálpebra do paciente. O contato entre a tampa do PMMA e a pálpebra do paciente devido a uma ponte de gel insuficiente, movimento dos olhos e da cabeça do paciente e/ou um movimento de câmera muito forte do operador pode ferir a superfície ocular e a pálpebra.
9. Escaneie cuidadosamente a raiz dos cílios do lado temporal em direção ao lado nasal da margem palpebral com movimentos horizontais minuciosos da margem palpebral, permitindo a avaliação dos cílios e seus folículos. Digitalize e adquira imagens girando a lente do microscópio do dispositivo no sentido horário ou anti-horário, modifique o plano de foco gradualmente para observar todo o folículo e a raiz dos cílios e anote as diferentes profundidades exibidas na imagem ao vivo da câmera a laser de varredura. Adquira imagens digitalizando de seis a dez folículos pilosos dos cílios por olho, com amostragem distribuída pelas regiões temporal, média e nasal da margem da pálpebra.
   NOTA: Se um pequeno reflexo for exibido na imagem ao vivo da câmera a laser de varredura e persistir ao alterar a posição do plano focal, isso pode indicar a presença de bolhas de ar no gel de contato. Para resolver esse problema, renove o gel de contato.
10. Salve as imagens manualmente e registre todas as imagens suspeitas de ácaros Demodex pressionando o pedal. Ative o feedback de áudio do pedal para verificar a aquisição bem-sucedida da imagem. Se nenhuma estrutura palpebral for exibida e apenas camadas limite altamente reflexivas forem visíveis na imagem ao vivo da câmera a laser de varredura, isso pode indicar que o contato entre a tampa do PMMA e a margem da pálpebra do paciente foi interrompido. Para resolver esse problema, realinhe a câmera até que a tampa de PMMA toque corretamente a margem da pálpebra do paciente.
11. Se a imagem ao vivo aparecer borrada, distorcida ou não exibir a estrutura do folículo piloso, esses problemas podem indicar que o paciente está movendo a cabeça ou piscando. Lembre o paciente de se concentrar na luz de fixação para minimizar o movimento. Se possível, ajuste o brilho, o plano focal e a posição de digitalização para melhorar a qualidade da imagem.
12. Se a câmera a laser de varredura precisar ser ajustada ou se o paciente sentir fadiga ou qualquer dor, peça ao paciente para sentar, mover a câmera a laser de varredura para trás e reajustar a câmera. Se o paciente continuar a sentir desconforto durante o exame e não mostrar sinais de alívio dos sintomas após o repouso, interrompa e reagende o procedimento para garantir a segurança do paciente.
13. Se um paciente for examinado várias vezes ao longo do dia, armazene todas as imagens na mesma guia de exame na janela de visualização de imagens.
14. Examine o olho esquerdo, mova a câmera para a direita do ponto de vista do operador e aguarde até que o sistema operacional seja selecionado automaticamente. Remova a tampa de PMMA do dispositivo, coloque uma nova tampa de PMMA na lente do microscópio do dispositivo e repita as etapas anteriores.

Figura 3: Posicionamento do paciente. (A, B) O paciente está posicionado. (C) A tampa está sendo ajustada para tocar a pálpebra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Após o exame

1. Saia do exame; Certifique-se de que as imagens dos folículos dos cílios sejam armazenadas e que as imagens adquiridas sejam exibidas na janela de visualização de imagens. Caso contrário, a aquisição da imagem pode ter falhado ou os dados podem não ter sido salvos. Primeiro, descarte possíveis avarias do equipamento, como problemas de conexão de software ou falha no pedal. Após a solução do problema, explique a situação ao paciente e repita o exame.
2. Peça ao paciente para não esfregar os olhos após o exame até que o efeito da anestesia local tenha diminuído.
3. Remova a tampa de PMMA do dispositivo.
4. Limpe a lente do microscópio com lenços de limpeza de lentes.
5. Selecione Classificar por tempo de aquisição (rápido) na caixa de diálogo Opções e observe as imagens adquiridas dos folículos dos cílios exibidas em ordem do lado temporal para o nasal (Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S5) - a ordem de varredura da raiz do cílio ao longo da margem da pálpebra. Revise todas as imagens, selecione as imagens de alta qualidade para análise (Figura 4) e exclua as imagens de baixa qualidade. Peça a um observador que avalie as imagens quanto à presença de ácaros e registre o número de folículos de cílios com ácaros Demodex no total para cada olho.
   NOTA: Imagens de alta qualidade mostram a morfologia clara do ácaro, e a parte fotografada do ácaro deve ser a maior possível, idealmente maior que 100 μm. Se não estiverem disponíveis imagens de alta qualidade, é necessária uma avaliação independente por um segundo observador. Se os resultados dos dois observadores forem inconsistentes, um terceiro observador deve julgar para resolver a discrepância e estabelecer o resultado final para inclusão no relatório.
6. Crie relatórios colocando a imagem de alta qualidade do lado temporal para o lado nasal na caixa de luz do relatório. Nos modelos de relatório e nos formatos de contagem de ácaros (consulte o Arquivo Suplementar 2), selecione um modelo de relatório apropriado para descrever os resultados com base nos resultados do exame.

Figura 4: Demodex dentro do folículo dos cílios. (Imagens: 400 μm x 400 μm). (UMA)Três ácaros Demodex são observados dentro do folículo (seta amarela) e um único cílio é marcado (seta branca). (B) Cinco ácaros Demodex são observados dentro do folículo (seta amarela) e um único cílio é marcado (seta branca). Como os ácaros podem migrar através de diferentes profundidades, a imagem em um único plano focal pode capturar porções fragmentadas de ácaros individuais, resultando em representação morfológica incompleta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Desligue o dispositivo após o trabalho todos os dias

1. Depois de fechar todas as caixas de diálogo e janelas, feche o software.
2. Desligue o computador.
3. Desligue o dispositivo alternando a chave basculante na parte traseira do dispositivo de I para O. Para obter o desempenho ideal do sistema e a segurança dos dados, primeiro desligue o software e, em seguida, desligue o dispositivo.
   NOTA: O dispositivo não deve ser mantido ligado continuamente por muito tempo, especialmente por mais de um dia inteiro.
4. Mantenha regularmente a Fonte de Alimentação Ininterrupta (UPS) conectada ao equipamento e garanta seu funcionamento adequado para evitar perda de dados ou mau funcionamento do dispositivo causado por quedas repentinas de energia.
5. Execute backups regulares, como utilizar o armazenamento NAS (Network-Attached Storage).

Resultados

Seguindo o SOP descrito acima, examinamos pacientes com suspeita de infestação por Demodex em 2024. Além disso, comparamos os dados de 2023, quando esse POP não havia sido aplicado. Conforme mostrado na Figura 5, o número de pacientes submetidos ao IVCM para detecção de Demodex em 2024 é significativamente maior do que no ano anterior. Este POP permite o exame de pacientes de diferentes idades, de 4 anos a 92 anos.

Discussão

O ectoparasita Demodex é um dos parasitas mais comuns em humanos. Esses ácaros vivem nos folículos dos cílios, nas glândulas meibomianas (MGs) e nas glândulas sebáceas e são transparentes, de formato alongado e medem 0,15-0,4 mm de comprimento¹⁷. O IVCM realizado com o dispositivo fornece imagens em tempo real de 400 μm x 400 μm com resolução lateral de 1 μm/pixel e ampliação de 800x. Através do IVCM, imagens detalhadas de Demodex nos folículos d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gel oftálmico à base de carbômero, Vidisic	Bausch and Lomb, Berlim, Alemanha	8187195
Heidelberg Eye Explorer Software	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemanha	Versão 1.3.3.0
Tomógrafo de retina Heidelberg III	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemanha	HRT3-08398
Cloridrato de proparacaína	Laboratórios Alcon, Fort Worth, TX, EUA	8387271
TomoCap	Heidelberg Engineering GmbH, Heidelberg, Alemanha	18829	Tampa de PMMA