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Síntese de acetato de 13C 2-retinila e preparação de dose para testes de diluição de isótopos de retinol

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DOI:

10.3791/68535

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22 de agosto de 2025

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1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

Neste artigo

Resumo

O acetato de retinila é geralmente marcado com dois 13C quando a espectrometria de massa de cromatografia gasosa-combustão-razão isotópica é usada para análise de soro e leite materno. Este trabalho descreve a síntese de acetato de 13C 2-retinila e a preparação de doses para testes de diluição de isótopos de retinol a serem administrados por uma pipeta de deslocamento positivo ou seringa de tuberculina.

Resumo

O teste de diluição isotópica de retinol (RID) é o método mais sensível para avaliar o status de vitamina A estimando as reservas hepáticas totais, consideradas o padrão de referência. Para a detecção de espectrometria de massa por cromatografia gasosa-combustão-razão isotópica, adiciona-se 13C à porção retinol. O procedimento sintético para o acetato de 13C-retinilo começa com a β-ionona natural. Resumidamente, a cetona C18-tetraeno é sintetizada a partir da β-ionona e purificada. Se um acetato de 13C4-retinil for desejado, o carbânion de trietilfosfonoacetato marcado com 13C2 pode ser usado para adicionar dois 13C's à porção β-ionona antes de adicionar os três carbonos da acetona para sintetizar a cetona C18-tetraeno. Se um acetato de3-retinil 13C for desejado, os três carbonos da acetona podem ser marcados com 13C.

Para o acetato de 13C2-retinil mais comumente usado para análise futura por espectrometria de massa de razão isotópica de combustão por cromatografia gasosa, um procedimento modificado de Wittig-Horner é usado e a cetona de tetraeno C18 não marcada é reagida com o carbânion de trietilfosfonoacetato marcado com 13C2 para adicionar dois-13C's às posições 14 e 15 da molécula de retinol. O éster etílico resultante é reduzido ao álcool e esterificado a acetato de 13C 2-retinilo com anidrido acético. O isômero all-trans é purificado em alumina desativada com 8% de água usando solventes relativamente inócuos e altamente voláteis - hexanos e éter dietílico - que são removidos por evaporação rotativa e sonificação de doses de óleo. O produto é caracterizado por espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis), cromatografia em camada fina (TLC) e cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) de acordo com os padrões analíticos. A dose concentrada é armazenada dissolvida em óleo de soja a -80 °C. As doses finais são diluídas em óleo de soja (~200 μL/dose) e quantificadas por espectroscopia UV-Vis contra o óleo de soja veículo. As doses são medidas para administração em humanos com uma pipeta de deslocamento positivo ou seringas de tuberculina para o teste de RID. Usando suposições apropriadas, os estoques corporais totais são calculados e as reservas hepáticas totais são estimadas.

Introdução

A diluição isotópica de retinol (RID) é o único biomarcador do status de vitamina A que mede os estoques totais de vitamina A do corpo (TBS) quantitativamente e, com suposições apropriadas, pode estimar as reservas hepáticas totais (TLR). É a maneira mais sensível de medir o status de vitamina A e o impacto de intervenções contendo retinol pré-formado ou carotenóides pró-vitamina A. Embora tecnicamente desafiador, o RID é preciso e minimamente invasivo porque requer apenas amostras de sangue, ao contrário de biópsias hepáticas1. O teste RID envolve a administração de acetato de retinila deuterado ou marcado com 13C, dependendo da plataforma do espectrômetro de massa. Antes da administração da dose, é coletada uma amostra de sangue basal, o que é essencial ao usar 13marcadores C, mas pode ser feito em um subgrupo selecionado aleatoriamente. Uma segunda amostra é coletada após o acetato de retinila marcado com 13C ter sido misturado com TBS1.

As intervenções de vitamina A para prevenir a deficiência incluem fortificação de alimentos, biofortificação, diversificação alimentar e suplementação. No entanto, em alguns países, houve intervenções sobrepostas direcionadas às mesmas pessoas, levando à hipervitaminose A2, exigindo assim uma estrutura de monitoramento para avaliar os resultados do programa. Como tal, são necessários métodos que meçam quantitativamente o status da vitamina A. Trabalhando com os estados membros, a Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA) promove o uso pacífico de isótopos em pesquisas e avaliações, o que apóia a aplicação do teste RID. O teste RID está ganhando força e em breve poderá ser usado em grandes pesquisas populacionais para avaliar o status de vitamina A de deficiência a excesso em países que implementam intervenções de vitamina A3.

Anteriormente, o acetato de 10,11,14,15-13 C 4-retinila foi sintetizado usando modificações de Bergen et al. para acetato de retinila deuterado 4,5. Este composto foi usado em experimentos de rato6 e humanos com cromatografia gasosa-combustão-espectrometria de massa de razão isotópica (GCCIRMS) adaptados para análise7. A partir desses experimentos valiosos, determinamos que o GCCIRMS era tão sensível que quatro 13C's não eram necessários para o teste RID usando GCCIRMS. Portanto, o gasto do traçador é reduzido com o uso de apenas dois C's 13nas posições 14 e 15 da molécula de retinol (Figura 1). Essa modificação diminui os custos associados à síntese e leva ao aumento da produtividade devido à via sintética. Aqui, um protocolo ampliado para sua síntese é descrito.

O GCCIRMS é mais sensível do que outros tipos de espectrometria de massa para a medição de isótopos estáveis8 e pode responder a mudanças na dieta e mudanças naturais de enriquecimento de 13C no retinol sérico. Isso foi descrito em gerbos9 e humanos10consumindo milho e em humanos inscritos em uma intervenção vegetal11. De fato, a abundância natural de 13C varia entre diferentes populações e precisa ser determinada em indivíduos inscritos em avaliações de RID12. No entanto, pequenos subgrupos têm sido usados para medição do enriquecimento natural com o RID em crianças ganenses e tailandesas13,14 e mulheres tailandesas15. O enriquecimento individual de 13C na linha de base deve ser determinado para a determinação mais precisa da TBS no nível individual12.

Protocolo

NOTA: Ao inscrever seres humanos para pesquisas, intervenções ou estudos avaliativos, a aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB) deve ser buscada com procedimentos de consentimento informado apropriados.

1. Síntese de acetato de 13C 2-retinilo (Figura 2)

NOTA: Todos os procedimentos sintéticos e quantificação são realizados sob iluminação fluorescente dourada para evitar a degradação e isomerização do composto.

  1. Sintetize acetato de β-ionila em um grande lote a partir de β-ionona disponível comercialmente. Por exemplo, cubra o hidreto de sódio (NaH) (4 g, 0,16 mol) com 100 mL de éter. Adicione trietilfosfonoacetato não marcado (36 g, 0,16 mol) em 100 mL de éter gota a gota e mexa por 2 h. H2 é liberado e a suspensão inicial torna-se clara e âmbar.
    CUIDADO: O hidreto de sódio (NaH) é um forte agente redutor que é útil em uma ampla gama de reações químicas. No entanto, incêndios em laboratório podem ocorrer devido à sua reação altamente exotérmica com a água na atmosfera 16,17. Recomenda-se acessar uma Ficha de Dados de Segurança; diretrizes adicionais para o manuseio de sólidos moderadamente pirofóricos, como NaH, foram publicadas18. Mantenha-o suspenso em óleo ou solvente não reativo durante o manuseio, lave os recipientes de reação e recipientes de armazenamento com gás inerte (como nitrogênio ou argônio), resfrie o recipiente de reação e armazene em recipientes selados mantidos em ambiente seco. Em nosso laboratório, o NaH é transferido em pequenas quantidades (~ 1 g) sob um ambiente de nitrogênio para frascos e depois armazenado em um dessecador selado até o uso.
  2. Adicione β-ionona (21 g, 0,12 mol) em 40 mL de éter e reaja durante a noite (~ 15 h a 20 ° C). No dia 2, extinguir a reação com água e extrair o acetato de etil-β-ionilideno em hexanos e lavar repetidamente com água em uma série de funis separatórios para maximizar a recuperação. Seque a camada orgânica (MgSO4 anidro), filtre e concentre
    NOTA: A cromatografia em camada delgada (TLC) geralmente detecta apenas pequenas impurezas neste estágio da síntese. Isso pode ser armazenado por um longo período a -80 °C antes de prosseguir para as próximas etapas.
  3. Reaja acetato de etil-β-ionilideno (28 g, 0,11 mol) com 120 mL de hidreto de alumínio e lítio 1 molar (LiAlH4) em éter dietílico. Mergulhe o recipiente de reação em um banho de acetona com gelo seco e agite a solução continuamente para obter etanol β-ionilideno.
    CUIDADO: O hidreto de alumínio e lítio (LiAlH4) é um forte agente redutor. Acesse uma Ficha de Dados de Segurança e consulte as diretrizes adicionais para o manuseio de sólidos moderadamente pirofóricos, como LiAlH418,19. O principal objetivo da maioria das precauções de segurança é minimizar o risco de exposição do LiAlH4 à atmosfera e evitar reações descontroladas. Isso geralmente envolve manter esses compostos suspensos em óleo ou solvente não reativo durante o manuseio, lavagem de recipientes de reação e recipientes de armazenamento com gás inerte (como nitrogênio ou argônio), resfriamento do recipiente de reação e armazenamento de LiAlH4 em recipientes selados mantidos em ambiente seco. Em nosso laboratório, o hidreto de alumínio e lítio é adquirido em frascos selados de 1 molar em vez da forma em pó, com os volumes necessários removidos com uma seringa e a atmosfera do frasco substituída por nitrogênio.
  4. Dissolva 28 g (0,12 mol) de etanol β-ionilideno em 300 mL de hexanos. Adicione aproximadamente 50 g por dia de MnO2 a 90% durante 3 dias (51 g, 52 g e 54 g) e mexa a mistura de reação por mais tempo (geralmente 2 dias a 20 ° C). Por fim, adicione 35 g de MnO2 e deixe durante a noite por aproximadamente 15 h; A reação é aproximadamente 90% completa. Filtrar e lavar o acetaldeído de β-ionilideno do MnO2 com diclorometano.
  5. Dissolva o acetaldeído bruto de β-ionilideno (22 g, 0,10 mol) em 150 mL de acetona com agitação constante e adicione 10 mL de hidróxido de sódio 1 N gota a gota. Deixe a reação por 6 h.
  6. Extraia a cetona de tetraeno C18 com hexanos e lave repetidamente com água usando uma série de funis separatórios para maximizar a recuperação. Seque a solução resultante com um evaporador rotativo para produzir cetona de tetraeno C18 cis-trans bruto. Como o isômero trans é mais desejável para estudos em humanos, purifique a mistura em sílica gel desativada com água a 4% (300 g) usando um gradiente lento de 0-10% de acetato de etila em hexano.
  7. Agite NaH (1,2 g, 0,05 mol) com 50 mL de éter. Adicione 13Cde 2-trietilfosfonoacetato (11 g, 0,049 mol) dissolvido em 50 mL de éter gota a gota e mexa por 2 h. Dissolva C18 tetraeno cetona (12 g, 0,044 mol) em 50 mL de éter e reaja durante a noite por aproximadamente 15 h a 20 ° C.
  8. Extinguir a reacção com água e extrair o éster etílico do ácido 2-retinóico 14,15-13 C com hexanos e lavar com água numa ampola de separação. Seque a camada orgânica com MgSO4 anidro e concentre; Purificar em 8% de alumina neutra desativada em água (400 g) com um éter dietílico lento de 0 a 3% em gradiente hexano para produzir isômeros CIS/TRANS.
    NOTA: Muitas vezes, a primeira purificação tem contaminantes conforme julgado pelo TLC. Os contaminantes são visualizados pela reação da placa TLC com vapor de iodo. Quando os contaminantes estão presentes, é crucial repurificar em 400 g de alumina neutra desativada com 8% de água com 100% de hexanos para resultar em éster etílico puro de ácido 2-retinóico de 14,15-13 C.
  9. Reduza o éster etílico de ácido 2-retinóico 14,15-13 C (3,7 g) com 15 mL de hidreto de alumínio e lítio 1 molar em um banho de acetona com gelo seco, agitando para obter 14,15-13 C 2-retinol (Figura 1).
  10. Dissolva 14,15-13 C2-retinol (3,5 g) em 20 mL de trietilamina. Enquanto agita a solução, misture 3,5 ml de anidrido acético com 7 ml de trietilamina e adicione gota a gota ao balão. Deixar o balão durante a noite no frigorífico para a formação do acetato de 14,15-13 C 2-retinilo (aproximadamente 15 h).
  11. Extrair 3,9 g de acetato bruto de 2-retinilo a 14,15-13 C em hexanos, secar, concentrar e purificar em 500 g de alumina neutra desativada a 8% de água com um éter dietílico lento de 0-3% em gradiente de hexano. Monitorizar as fracções com um espectrofotómetro ultravioleta visível (UV-Vis) a 325 nm. Remova todos os solventes restantes com um rotoevaporador. Avaliar o produto final com HPLC e detecção de fotodíodos para determinar a relação cis/trans. Um exemplo de um sistema de gradiente avançado para separar o perfil cis/trans usando cromatografia líquida de ultrapressão está disponível na Figura Suplementar S1.
    NOTA: A relação cis/trans é geralmente >95% all-trans nesta fase.
  12. Para armazenamento, dissolva o acetato de 2-retinilo 14,15-13 C em óleo de soja de qualidade alimentar sem outros aditivos e armazene em vidro âmbar lavado com nitrogênio a -80 °C e rotule como estoque concentrado.

2. Preparação da dose de soluções oleosas de acetato de retinilo marcado com isótopo estável

NOTA: O acetato de retinila marcado isotopicamente foi administrado em cápsulas20 ou em soluções oleosas administradas com uma pipeta de deslocamento positivo de 250 μL21 ou seringa médica22 (Figura 3). Testamos a estabilidade das cápsulas (Figura 4), descrita abaixo.

  1. Diretamente após a síntese, dissolva o acetato de retinila rotulado em ~ 15 mL de óleo vegetal não fortificado (por exemplo, óleo de soja de qualidade alimentar) antes de começar a cristalizar e armazene em um frasco âmbar de 24 mL a -30 a -80 ° C até que esteja pronto para preparar as doses finais.
    1. Se o acetato de retinila rotulado tiver sido comprado, retire cuidadosamente a parte superior da ampola selada a vácuo, marcando com uma lima ou quebre o lacre em um frasco com tampa de rosca. Dependendo da massa necessária, coloque uma quantidade pesada em uma garrafa âmbar marrom de 24 mL e adicione uma pequena quantidade de óleo vegetal (10 mL provavelmente serão suficientes). Sonicar a mistura até que se torne uma solução límpida.
  2. Estime a quantidade de óleo final necessária multiplicando o número de indivíduos por 200 μL. Por exemplo, se 60 indivíduos forem inscritos, faça aproximadamente 70 doses para ter o suficiente para o desperdício (aproximadamente 10-20%). Assim, 70 × 200 μL são 14 mL.
    NOTA: Não confie na massa do óleo sintético ou cristais. Você deve usar um espectrofotômetro para quantificar as doses. Toda vitamina A sintética contém solventes residuais. Estes podem ser dissipados por sonificação ou sob um fluxo suave de nitrogênio, mas são a principal razão pela qual a massa sozinha não pode ser usada para determinar as doses de isótopos.
    Se as soluções de acetato de retinilo marcadas forem mantidas por muito tempo no freezer sem serem usadas, elas devem ser reanalisadas para determinar se ocorreu degradação substancial.
  3. Para quantificar o acetato de retinilo:
    1. Ligue o espectrofotômetro UV-Vis (preferencialmente espectrofotômetro de varredura de feixe duplo) e o computador conectado, se aplicável. Inicie o espectrofotômetro UV-Vis seguindo as instruções do fabricante. Deixe o espectrofotômetro aquecer por pelo menos 30 minutos antes da leitura.
    2. Configure dois frascos volumétricos de 25 mL e tampas e encha cada um com 25 mL de hexanos quase até a linha. Rotular um balão como "Óleo" ou "Em branco" e o outro como "Vitamina A" ou "Dose"; em seguida, reserve o frasco de vitamina A até que os brancos sejam executados.
    3. Despeje um pouco de óleo de soja puro em um copo plástico descartável e adicione 20-40 μL ao frasco de óleo para esvaziar o sistema.
      NOTA: Costumamos usar 20 μL, mas desde que o volume da dose em branco e do isótopo sejam os mesmos, pode-se usar mais.
    4. Inverta 4-5x para misturar o óleo e os hexanos, depois enxágue as duas cubetas de quartzo do espectrofotômetro com esta solução e encha ambas ~ 75% completas.
    5. Coloque as duas cubetas no espectrofotômetro, tomando cuidado para não tocar na frente e atrás transparentes (manuseie apenas pelos lados foscos). Para melhor precisão, vire a frente numerada de cada cubeta correspondente em direção ao usuário.
    6. Feche a porta de bloqueio de luz sobre as amostras.
    7. Clique na função Blank ou Baseline e permita que o sistema meça a absorbância da linha de base de óleo e hexanos. Isso corrige a absorção da solução de hexanos em branco de óleo. Varredura de 260 a 400 nm; Confirme se a leitura é "zero" a 400 nm após o término desse processo. Caso contrário, aperte o botão zero e execute novamente a verificação. Uma vez concluído, o sistema está pronto para medir a absorbância da dose de acetato de retinila.
    8. Rejeitar o conteúdo da cubeta de amostra e encher com a solução de hexanos Dose. Coloque a amostra no local apropriado e escaneie os espectros. Selecione o pico e leia a absorbância. O acetato de retinilo puro tem apenas um lambda máximo a 325 nm.
      NOTA: Se você tiver mais de um pico ou tiver um a 280 nm, o acetato de retinilo se degradou e não deve ser usado para dosagem.
  4. Cálculos para a etapa 2.3
    NOTA: O E 1%, 1 cm para retinol é 1.810 a 325 nm em hexanos. Você estará quantificando o acetato de retinila em equivalentes de retinol.
    1. Divida a absorbância por 0,181 para obter o μg/mL de solução.
    2. Multiplique por 25 mL para obter o μg em 20 microlitros de solução de óleo.
      NOTA: Exemplo: A absorbância de 20 μL de óleo em 25 mL de hexanos é de 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/mL × 25 mL = 40,75 μg em 20 μL de óleo
      Se você precisar de 286 μg para a dose, isso é 140,4 μL. Isso é 1 μmole, mas 288 μg de 13C2-retinol serão produzidos no intestino por causa do rótulo. Você pode querer fazer uma diluição para se aproximar da quantidade de dose de 200 μL e refazer a quantificação acima.
  5. Preparação de cápsulas para testar a estabilidade
    1. Separe as cápsulas no fundo branco maior e nas tampas azuis menores.
    2. Coloque o fundo das cápsulas brancas em caixas de ponta de pipeta (96 cápsulas por caixa) e feche para evitar que a poeira entre nas cápsulas e coloque as tampas azuis em um saco plástico com zíper durante a noite. Descarte as cápsulas que estão rachadas.
    3. Deixe a solução de óleo de acetato de retinila atingir a temperatura ambiente. Despeje uma pequena quantidade (~ 5 mL) em um pequeno copo de plástico não utilizado.
    4. Prepare uma pipeta repetidora carregando a seringa de 5 mL (onde 1 = 100 μL) e ajustando-a para "2" para dispensar 200 μL por pressão do gatilho.
    5. Carregue o óleo de acetato de retinilo na pipeta repetidora puxando o braço de carregamento. Dispense pelo menos 4 alíquotas de 200 μL de volta ao copo para limpar as bolhas de ar da ponta.
    6. Dispense 1 alíquota de 200 μL por fundo de cápsula branca tocando levemente a ponta da pipeta na parede interna da cápsula e pressionando o gatilho.
    7. Quando a pipeta repetidora estiver quase vazia, retire mais óleo.
    8. Depois de completar um conjunto inteiro de 96 cápsulas, dispense o óleo de volta no copo e comece a deslizar levemente as tampas azuis em cada fundo branco, tomando cuidado para não quebrar as tampas.
    9. Depois que todas as tampas estiverem nas cápsulas, levante cada cápsula, certifique-se levemente de que a tampa esteja bem colocada e recoloque-a na caixa de pontas.
    10. Armazene as cápsulas em temperaturas e condições escolhidas. A escuridão pode ser alcançada armazenando as cápsulas em prateleiras sob papel alumínio. Abaixo estão os exemplos:
      um.  no congelador: -20 °C no escuro
      b.  no frigorífico: 4 °C no escuro
      c. na bancada: 20 °C (temperatura ambiente) no escuro
      d. no banco, mas deixada de fora: 20 °C (temperatura ambiente) exposta à iluminação fluorescente padrão
      e.  em um forno, replicando temperaturas ambientes mais altas em outros locais: 37 °C no escuro

3. Administração da dose

NOTA: A pipeta de deslocamento positivo foi comparada diretamente com seringas de tuberculina para determinar a exatidão e precisão entre os técnicos (Figura 5).

As doses são administradas utilizando pipetas de deslocamento positivo de 250 μL de Rainin ou seringas de tuberculina de 1 ml.

  1. Descongele as doses congeladas ou coloque-as em um refrigerador com compressas de gelo se for para o local de campo. Durante o transporte, as doses geralmente descongelam.
  2. Remova o frasco de vidro âmbar do refrigerador e abra. Mantenha o frasco para injetáveis numa "caneca" ou copo para evitar que tombe.
  3. Insira a ponta da pipeta ou a seringa de tuberculina no óleo e retire uma pequena quantidade. Pressione o êmbolo rapidamente para deslocar quaisquer bolhas que possam ter se formado. Puxe lentamente a quantidade de volume necessária para a pipeta ou seringa. Certifique-se de que não haja bolhas.
  4. Limpe a parte externa da ponta com um lenço de papel. Não toque na extremidade da ponta da pipeta ou seringa, pois isso retirará o líquido.
  5. Coloque a ponta na boca do participante, solte o óleo na boca e instrua a pessoa a fechar a boca e engolir.
    NOTA: É útil se os participantes puderem inclinar a cabeça ligeiramente para trás para a dosagem.
  6. Após a dose, administre um "caçador" ou um lanche gorduroso fornecendo pelo menos 10 g de gordura. Para crianças pequenas, administre 1 mL de óleo não fortificado entregue em uma colher de plástico como um caçador. Para crianças mais velhas e adultos, meio sanduíche de manteiga de amendoim, batata branca frita ou baguete com pasta de chocolate são bons lanches de acompanhamento.
    NOTA: Pesquisas informativas devem ser realizadas para determinar qual lanche é aceitável localmente.

Resultados

Começando com β-ionona disponível comercialmente, 28 g de acetato de etil-β-ionilideno foram sintetizados. Após a redução, 22 g de acetaldeído de β-ionilideno reagiram com acetona em condições básicas para produzir C18-tetraeno cetona; Foram obtidos 12 g de cetona C18-tetraeno purificada, que foi ~ 90% all-trans. Isso foi posteriormente reagido com o carbânion de 13C 2-trietilfosfonoacetato usando um procedimento de Wittig-Horner modificado para adicionar dois 13C's nas posições 14, 15 da molécula de retinol. O éster etílico resultante (rendimento de 3,7 g) foi reduzido ao álcool e esterificado a acetato de 13C 2-retinilo com anidrido acético dissolvido em trietilamina. A vitamina sintética foi purificada em alumina desativada com 8% de água usando solventes orgânicos altamente voláteis - hexanos e éter dietílico. A preparação resultante foi caracterizada usando espectroscopia UV-Vis, TLC e HPLC. Para armazenamento de longo prazo, o acetato de retinila rotulado é armazenado dissolvido em óleo de soja a -80 °C.

O esquema sintético bem-sucedido para acetato de 14,15-13 C 2-retinilo descrito acima é representado na Figura 2. A via total que começa com β-ionona é composta por sete etapas. O primeiro rendimento foi de 0,9 g de acetato de 2-retinila 14,15-13 C totalmente trans. As frações dos isômeros cis / trans (1,2 g) foram combinadas e repurificadas em 300 g de alumina neutra desativada com 8% de água para resultar em 0,3 g adicionais de acetato de 2-retinila all-trans 14,15-13 C.

Para determinar a estabilidade do acetato de retinila em cápsulas, o acetato de retinila (1 g) foi dissolvido em hexanos e purificado por cromatografia em coluna aberta usando 300 g de alumina desativada a 8% de água com hexanos como solvente. O acetato de retinila foi monitorado por espectroscopia TLC e UV-Vis, e apenas as frações puras foram utilizadas. Este processo é idêntico ao usado na síntese e purificação do acetato de 13C2-retinil no laboratório Tanumihardjo para o teste RID conforme descrito acima. O acetato de retinila purificado foi dissolvido em óleo de soja, o solvente orgânico removido por evaporador rotativo e mais óleo adicionado a uma concentração final de 7,5 μM (para produzir 1,5 μmol por 200 μL, o ponto médio entre a dose para um adulto e uma criança para o teste RID quando GCCIRMS é usado para análise). A concentração foi determinada por espectroscopia UV-Vis conforme descrito acima.

Uma alíquota de 200 μL do óleo foi distribuída em cápsulas de celulose tamanho 3 (volume máximo de 300 μL) para o estudo de estabilidade. As cápsulas de cada dose foram armazenadas em cinco condições. A escuridão foi alcançada armazenando as cápsulas em prateleiras sob papel alumínio. Cápsulas (150) foram preparadas para cada condição para um total de 750 cápsulas: i) no freezer: -20 °C no escuro; ii) na geladeira: 4 °C no escuro; iii) na bancada: 20 °C (temperatura ambiente) no escuro; iv) na bancada, mas deixada de fora: 20 °C (temperatura ambiente) exposta à iluminação fluorescente padrão; v) em estufa, replicando temperaturas ambientes mais altas em outros locais: 37 °C no escuro.

No estudo de estabilidade da cápsula, três cápsulas de cada condição foram medidas em cada ponto de tempo (-20 ° C, 4 ° C, temperatura ambiente escura, temperatura ambiente clara, 37 ° C). Todas as cápsulas foram deixadas à temperatura ambiente (as cápsulas em temperatura ambiente foram analisadas primeiro); A variação de temperatura causa variação de absorbância. As cápsulas foram medidas até 480 dias. As cápsulas permaneceram estáveis por nove meses a -20 °C e 4 °C (Figura 4).

Uma comparação de método foi realizada para comparar as seringas tuberculínicas de uso único com as pipetas de deslocamento positivo Rainin como padrão de referência. A pipeta de deslocamento positivo Rainin foi calibrada com água, levando em conta a temperatura e a pressão locais, e depois testada com três ponteiras em triplicata para determinar o volume de óleo alvo dispensado na configuração de 200 μL em um barco de pesagem tarifada. O protocolo de dispensação foi conduzido por 10 técnicos com níveis de experiência variados. Para cada técnico, oito seringas foram testadas em triplicata e comparadas com a referência da pipeta. As laterais da pipeta foram limpas com lenço de papel e o óleo dispensado no barco de pesagem em ângulo, garantindo que o máximo de óleo fosse liberado. Os técnicos estavam cegos para os resultados da massa dispensada ao longo do protocolo; A massa de óleo foi registrada por um técnico separado. O processo foi repetido com 200 μL de óleo de soja usando oito seringas de tuberculina (por exemplo, Norm-Ject).

O software estatístico R foi utilizado para ajustar um modelo de componente de variância (FitVCA)22 (Figura 5). Os fatores de variabilidade medidos incluíram técnico, seringa dentro do técnico e erro de replicação. O valor médio (IC 95%) normalizado da entrega da seringa quando comparado ao volume de entrega da pipeta foi de 0,996 (0,912, 1,08). A variância do erro replicado foi responsável por 64,8% da variância total, indicando que a maior fonte de variabilidade foi de medições repetidas na mesma seringa. A variação percentual do técnico e da seringa dentro do técnico foi muito menor, contribuindo com 22,9% e 12,3%, respectivamente.

A análise de subgrupos foi realizada dividindo os técnicos em dois grupos (n = 5/grupo) com base na experiência. A média de entrega normalizada da seringa foi semelhante entre os dois grupos, mas o IC 95% foi mais estreito para técnicos com mais experiência; 1,001 (0,939, 1,063) e 0,998 (0,900, 1,100), respectivamente. Entre os técnicos mais experientes, a maior variância veio da seringa dentro do técnico (57,0%) e do erro de replicação (42,9%), enquanto para os técnicos menos experientes, a maior variância veio do erro do técnico (32,7%) e do erro de replicação (67,2%).

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Figura 1: A estrutura do retinol com os carbonos numerados. Os 13C's são geralmente adicionados nas posições 14 e 15 para uso com cromatografia gasosa-espectrometria de massa de combustão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: O esquema sintético de acetato de 14,15-13 C2-retinil usado em testes de diluição de isótopos de retinol quando cromatografia gasosa-combustão-espectrometria de massa de razão isotópica é usada para análise de soro ou leite materno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Uma seringa de tuberculina de 1 mL sem volume morto na ponta e a pipeta de deslocamento positivo de 250 μL usada para dosagem em estudos de traçadores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Curvas de degradação do acetato de retinila armazenado em cápsulas em cinco condições diferentes. As condições são -20 °C, 4 °C, 20 °C (temperatura ambiente) no escuro, 20 °C (temperatura ambiente) sob luz fluorescente padrão e 37 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Análise do componente de variância da quantidade de administração da dose comparando seringas de tuberculina de 1 mL com uma pipeta de deslocamento positivo de 250 μL entre 10 técnicos cegos para os resultados durante a avaliação. Os valores são a massa de óleo dispensada (200 μL) das seringas normalizadas para a pipeta de deslocamento positivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Um exemplo da verificação final da pureza do acetato de 14,15-13C-retinilo por cromatografia líquida de ultrapressão. Os espectros correspondentes são característicos das formas cis / trans da vitamina. As condições de UPLC foram Solvente A 70:25:5 (acetonitrila:água:isopropanol) com acetato de amônio 10 mM e o Solvente B foi 75% acetonitrila, 25% isopropanol. A coluna utilizada foi uma coluna Acquity UPLC, BEH C18 1,7 μM, 2,1 x 100 mm. A coluna foi ajustada em 29 °C e a vazão foi de 0,4 mL/min. O gradiente começou com 100% de Solvente A e foi mantido por 5,0 min, seguido por uma transição para 98% de Solvente B por 7 min e mantido por 8 min antes de voltar para 100% de Solvente A por 1 min e mantido por 4 min de equilíbrio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Embora existam fontes comerciais de acetato de retinila deuterado e marcado com 13C, existem várias vias sintéticas para o retinol na literatura para químicos orgânicos qualificados. Escolhemos um caminho sintético para o acetato de retinila deuterado seguir e fizemos os ajustes apropriados para adicionar 13C à espinha dorsal da porção de retinol, que são descritos acima. A síntese do acetato de 14,15-13 C 2-retinila foi realizada usando um procedimento de sete etapas, começando com β-ionona disponível comercialmente. β-Ionone é um componente vegetal natural e contribui para fragrâncias, como as rosas. A etapa mais crucial na via sintética é a formação da cetona de tetraeno C18. Este composto intermediário precisa ser pelo menos 90% puro para que as etapas subsequentes produzam bons rendimentos.

A marcação foi realizada usando um procedimento de Wittig-Homer modificado com 13C 2-trietilfosfonoacetato comercialmente disponível. Os compostos marcados são usados no teste RID para determinar TBS e estimar TLR. O método utiliza GCCIRMS para análise de retinol purificado do soro ou leite materno de indivíduos que receberam doses com níveis fisiológicos dos compostos marcados. As doses mais comuns são 1 μmol para crianças e 2 μmol para adultos. Embora a análise do GCCIRMS seja sensível ao enriquecimento de isótopos, a análise do soro requer um mínimo de 400 μL de soro para obter massa de retinol suficiente para introdução no GC.

O teste 13C-RID tem sido utilizado em estudos clínicos23,24 e em grupos de crianças africanas25 com planos futuros de torná-lo acessível para o trabalho de base populacional. Realizamos os experimentos com cápsulas e seringas para investigar se essas modificações são adequadas para o trabalho populacional. As cápsulas precisavam estar na posição vertical ou vazavam; Nós rapidamente descartamos a ideia de que eles poderiam ser armazenados em frascos de comprimidos âmbar comuns para uso em campo. As cápsulas ficaram estáveis apenas por ~ 9 meses em temperaturas de geladeira e freezer. A produção de cápsulas seladas pode melhorar a estabilidade, reduzindo a pequena exposição à atmosfera durante o armazenamento. O uso de cápsulas deve ser testado e validado por grupos de usuários antes da implementação.

As soluções finais de óleo são estáveis à temperatura ambiente por ~ 2 meses, mas uma vez que começam a se degradar, a degradação continua rapidamente. Não é aceitável qualquer actividade parcial para os ensaios de RID, uma vez que a quantidade doseada é utilizada no cálculo da TBS. É melhor manter as soluções em bolsas de gelo no campo durante o uso e congelá-las novamente o mais rápido possível após a conclusão da dosagem. É melhor trazer apenas algumas doses a mais do que o necessário para o dia e manter o resto congelado. O congelamento e o descongelamento não afetam essas soluções porque o próprio óleo contém antioxidantes. As soluções de óleo são mais robustas do que as amostras de sangue, mas ainda precisam ser mantidas no escuro o tempo todo e congeladas quando não estiverem em uso.

As doses são administradas utilizando pipetas de deslocamento positivo de 250 μL de Rainin ou seringas de tuberculina de 1 ml. As pipetas de deslocamento de ar não são adequadas para doses dissolvidas em óleo. Nosso laboratório comparou experimentalmente esses dois métodos (ver Resultados Representativos). A administração com a pipeta ou seringa é semelhante, com alguns desvios. As pipetas de deslocamento positivo Rainin são recomendadas para pesquisas ou estudos clínicos, mas as seringas podem ser usadas para trabalhos de base populacional. Seringas com pouco volume morto na ponta são recomendadas para maximizar a precisão da dose (por exemplo, Norm-Ject).

Os cálculos para o teste RID incluem a quantidade de dose administrada, e o erro na quantidade de dose administrada é proporcional ao erro na estimativa resultante de TBS. Para o uso de seringas de tuberculina versus pipetas de deslocamento positivo, a entrega média normalizada da seringa foi próxima de 1, indicando que as seringas podem fornecer administração precisa da dose para estudos populacionais. Os limites de confiança de 95% foram de aproximadamente ± 8% da administração da dose alvo. Os técnicos com mais experiência prévia com as seringas tiveram um IC de 95% mais estreito (± 6%) e menor contribuição de variância do técnico em comparação com técnicos com menos experiência (± 10%). Isso sugere que um protocolo de treinamento e validação usando óleo veicular deve ser realizado antes da implementação em campo. Esses resultados merecem validação adicional em cada laboratório que deseja usar seringas de tuberculina de uso único como um método de administração econômico e que economiza tempo para administrar as doses em testes de dose-resposta e RID em estudos populacionais.

Optamos pela pipeta de deslocamento positivo para pesquisas e estudos clínicos usando o teste RID para maximizar a precisão em nível individual, pois sua exatidão e precisão relatadas são de ≤1%. Em comparação, o teste de resposta à dose relativa modificado é qualitativo e nenhum cálculo é baseado na quantidade de dose administrada1. Portanto, recomendamos o uso de seringas para o teste em inquéritos de base populacional e que a dose seja dissolvida em aproximadamente 0,7 mL de veículo.

O teste RID é um método sensível para quantificar a TBS e estimar a TLR, que é o padrão de referência para avaliar o status de vitamina A. Tem sido usado em muitas aplicações de pesquisa usando deutério ou marcação de 13C. As aplicações atuais e futuras usarão o teste RID em ambientes clínicos e subgrupos populacionais em pesquisas. A simplificação da dosagem será importante para essas aplicações.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste manuscrito.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH-R01 DC019357 e pelo Projeto de Pesquisa Coordenada da AIEA E43035. Agradecemos a Nicholas Keuler, do grupo de Consultoria Estatística da Universidade de Wisconsin-Madison, pela assistência na análise da comparação do método da seringa de uso único.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
anidrido acéticoSigma Aldrich242845
acetonaSigma Aldrich179124
aluminaSigma Aldrich199974
CoposQualquerQualquer empresa de fornecimento de vidro 
beta-iononaSigma AldrichW259500
éterSigma Aldrich673811
pipetas de pasteur de vidroQualquerQualquer empresa de fornecimento de vidro 
hexanosSigma178918
trietilfosfonoacetato marcadoSigma Aldrich293202
solução de hidreto de alumínio e lítioAcros orgânicos199511000
Óxido de manganêsSidma Aldrich310700
pipetas de deslocamento positivoRainin17008579
acetato de retiniloSigma AldrichR4632
Funis de separaçãoQualquerQualquer empresa de fornecimento de vidro 
gel de sílicaSigma Aldrich1.07734
hidreto de sódioAldrich223441
hidróxido de sódioFisher CientíficoS318-100
espectrofotômetroQualquer digitalizaçãoO feixe duplo é preferido
trietilaminaSigma Aldrich471283
trietilfosfonoacetatoAldrichT61301
seringa de tuberculinaNorma-Ject19G334
óleo vegetalsojaMercearia
Balões volumétricos (25 mL)QualquerQualquer empresa de fornecimento de vidro 

Referências

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

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