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Artigo de método

Exame das características anatômicas das células ganglionares da retina sob excitotoxicidade induzida por ácido N-metil-D-aspártico (NMDA)

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DOI:

10.3791/68537

⸱

19 de setembro de 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos o uso de um método de marcação de fosfatase alcalina (AP) geneticamente direcionado para investigar as características anatômicas e fenótipos de retinas de camundongos sob excitotoxicidade induzida por NMDA. Em conjunto com várias linhas repórter específicas do subtipo de células ganglionares da retina (RGC), descobrimos novos fenótipos em RGCs moribundos ao longo do processo degenerativo.

Resumo

As células ganglionares da retina (RGCs) são os neurônios de saída da retina, responsáveis pela transmissão de informações visuais ao cérebro. Na retina de camundongos maduros, mais de 40 tipos de RGC foram identificados com base em características genômicas, morfológicas e funcionais. A degeneração RGC é uma marca registrada de várias doenças retinianas debilitantes, incluindo glaucoma e neuropatia óptica traumática. Obter uma visão mais profunda dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à degeneração, sobrevivência e resiliência do RGC em diferentes condições de doença é crucial para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas eficazes. Para investigar a degeneração do RGC, adotamos uma técnica simples, mas poderosa, usada extensivamente em estudos de desenvolvimento da retina para morfologias do RGC e projeção central. Aqui, aplicamos este método para avaliar os fenótipos anatômicos de RGCs sob excitotoxicidade induzida por NMDA. Essa abordagem permite a visualização de um grande número de RGCs degenerados ao longo do tempo, permitindo-nos mapear a sequência de eventos degenerativos, identificar fenótipos característicos de RGCs moribundos e distinguir RGCs resistentes a danos induzidos por NMDA.

Introdução

A lesão cerebral traumática (TCE) é uma lesão súbita que causa danos neuronais ao cérebro. Em formas graves de TCE, como as causadas por acidentes automobilísticos ou colisões esportivas e lesões por explosão devido a explosões, as forças mecânicas podem interromper a arquitetura celular, levando à inflamação, estresse oxidativo, excitotoxicidade e, eventualmente, morte neuronal 1,2.

A retina, a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), tem servido como um sistema modelo de TCE para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à excitotoxicidade e desenvolver estratégias de intervenção terapêutica 3,4,5. Os modelos de retina mais pertinentes para estudos de TCE são o modelo de esmagamento do nervo óptico e a excitotoxicidade das retinas induzida por ácido N-metil-D-aspártico (NMDA). No modelo de retina de excitotoxicidade induzida por NMDA, as células ganglionares da retina (RGCs) foram identificadas como o tipo mais suscetível de neurônios da retina porque os RGCs utilizam o glutamato como um importante neurotransmissor excitatório e vários tipos de receptores de glutamato, incluindo receptores AMPA (AMPARs), receptores KAPA (KAPARs) e receptores NMDA, para desencadear o potencial axônico6. Além dos RGCs, outras células da retina e circuitos neurais também podem ser afetados pelo tratamento com NMDA 7,8,9. A aplicação intravítrea de NMDA provoca a abertura prolongada do receptor NMDA, o que leva a um influxo excessivo de cálcio nas células, causando atividade neuronal superexcitatória e homeostase de cálcio desequilibrada 10,11,12,13.

O receptor NMDA é um complexo heteromérico composto por três subunidades: GluN1, GluN2 e GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, codificado por Grin1, contém oito isoformas em camundongos devido ao splicing alternativo de Grin1. Existem quatro subunidades GluN2 diferentes (a-d), que são codificadas por quatro genes separados: Grin2a-2d. Existem duas subunidades GluN3 diferentes (a e b), que são codificadas por Grin3a e 3b. De acordo com os dados do scRNA-seq19,20, o Grin1 é altamente expresso na maioria dos subtipos de RGC (Figura 1A), bem como em alguns subtipos de células amácrinas (AC) com níveis de expressão fracos a moderados (Figura 1B). Grin2a é enriquecido em menos subtipos RGC e AC, enquanto Grin2b é expresso moderadamente na maioria dos subtipos RGC e muitos subtipos AC (Figura 1A, B). Os níveis de expressão de Grin2c, Grin2d e Grin3b em RGCs e ACs são extremamente baixos (Figura 1A, B). A expressão de Grin3a pode ser vista em alguns subtipos de RGC e fracamente em alguns ACs (Figura 1A, B). Além do papel dos receptores NMDA, a excitotoxicidade desencadeada pelo influxo de cálcio por meio de AMPARs permeáveis ao cálcio foi descrita em vários modelos de doenças21. A expressão de subunidades do receptor NMDA pode fornecer pistas sobre por que a excitotoxicidade induzida por NMDA tem como alvo principalmente RGCs e ACs 9,10,14,22,23.

Os métodos convencionais de avaliação dos fenótipos retinianos macroscópicos induzidos por NMDA incluem coloração de hematoxilina e eosina (H&E) para detectar anormalidades histológicas, ensaio TUNEL para morte celular e coloração de imunofluorescência (IF) usando um biomarcador específico do tipo de célula 8,10,24,25,26 . No nível celular, técnicas de imagem confocal e preenchimento de corante têm sido usadas para investigar a sequência de eventos em RGCs moribundos no modelo de retina induzido por NMDA. Esses métodos forneceram informações valiosas sobre os compartimentos subcelulares dos RGCs moribundos e permitiram a identificação dos tipos de RGCs resilientes que sobrevivem sob insulto NMDA27,28.

Aqui, empregamos a coloração de fosfatase alcalina (AP) geneticamente ativada para investigar as características anatômicas e fenótipos de neurônios da retina de camundongos sob excitotoxicidade induzida por NMDA29 , 30 , 31 . A justificativa para selecionar este método se deve à sua simplicidade, custo-benefício e capacidade de obter uma visão abrangente das características anatômicas dos subtipos neuronais em toda a retina, tornando-o adequado para avaliações macroscópicas e análises comparativas em larga escala. Essa abordagem fornece novos insights sobre como os neurônios retinianos distintos e geneticamente marcados respondem ao NMDA nos níveis macroscópico e subcelular. Prevemos que essa estratégia será amplamente aplicável para avaliar mudanças morfológicas em vários modelos de doenças que afetam a arquitetura neuronal e a organização sináptica 4,26,32,33.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais seguiram a Política do Serviço de Saúde Pública dos EUA sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina McGovern da Universidade do Texas em Houston. As composições das soluções estão listadas na Tabela de Materiais.

1. Injeção de tamoxifeno

  1. Misture 30 mg de tamoxifeno com 30 μL de etanol. Em água fervente, aqueça 1 mL de óleo de semente de girassol e a mistura de tamoxifeno / etanol.
  2. Depois que o tamoxifeno se dissolver no etanol, adicione rapidamente 1 mL de óleo de semente de girassol aquecido à solução de tamoxifeno. Misture bem pipetando.
  3. Foram utilizados camundongos de ambos os sexos em várias idades entre 2 e 6 meses. Injete a solução de tamoxifeno na dose de 100 μg/g de peso corporal por via intraperitoneal usando uma seringa de insulina. Determine o número de injeções de tamoxifeno com base na linha do camundongo. Nesse protocolo, o tamoxifeno foi administrado uma vez ao dia por quatro dias consecutivos.
    NOTA: Como a solução de tamoxifeno é misturada com óleo denso, é difícil manuseá-la com uma seringa que tenha uma agulha destacável. Assim, uma seringa de insulina com uma agulha acoplada é preferida para injeção de tamoxifeno.
  4. Alojar o rato em grupos de no máximo 5 em gaiolas ventiladas individualmente. até a injeção de NMDA.

2. Injeção de solução NMDA nos olhos do camundongo

  1. Prepare 20 mM de solução NMDA em 1x PBS estéril. Lave o Nano-injetor com uma agulha 35G acoplada usando 100% de etanol 20x e, em seguida, lave com água ultrapura estéril mais 20x. Encha o Nano-injetor com 1 μL de solução NMDA.
  2. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal de cetamina / xilazina em mistura de solução 1X PBS (80/10 mg por kg de peso corporal). Avalie a inconsciência pela resposta reflexa de retirada ao beliscão da cauda e do dedo do pé.
  3. Coloque o mouse anestesiado em um estereomicroscópio. Posicione o mouse com o olho direito voltado para cima e o nariz apontando para o lado direito. Aplique uma gota de solução de cloridrato de proparacaína a 0,5% no globo ocular direito para anestesia local.
  4. Use uma agulha de injeção estéril 30G para perfurar o limbo na posição de 7 horas, criando um pequeno orifício. Monitore a localização e direção da agulha sob o estereomicroscópio. Certifique-se de que o tamanho da agulha de injeção seja ligeiramente maior do que a agulha de nanoinjeção para permitir uma inserção fácil.
  5. Remova cuidadosamente a agulha de injeção do globo ocular e descarte-a adequadamente. Use o estereomicroscópio para orientação, insira a agulha de nanoinjeção no vítreo através do limbo em um ângulo de 45°.
  6. Injete lentamente 1 μL de solução NMDA no vítreo. Após a injeção, mantenha a agulha de nanoinjeção no vítreo por aproximadamente 10 s para evitar a saída da solução injetada.
  7. Retire cuidadosa e lentamente a agulha de nanoinjeção do olho. Aplique pomada oftálmica de eritromicina a 0,5% na córnea do olho injetado.
  8. Coloque o mouse em uma gaiola em uma almofada de aquecimento. Monitore o mouse a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia. Alojar o rato durante uma a duas semanas até à colheita do tecido.

3. Coleta de tecido e coloração de fosfatase alcalina (AP)

  1. Eutanasiar o camundongo com asfixia por CO2, seguida de luxação cervical. Corte cuidadosamente os músculos que se conectam ao globo ocular e ao nervo óptico com uma tesoura Vanna.
  2. O globo ocular foi então captado com uma pinça e transferido para tubos separados de 2,0 mL marcados.
  3. Fixe os globos oculares em formalina tamponada neutra a 10% por 10 min em temperatura ambiente. Monte as retinas em um filtro de membrana de nitrato de celulose, conforme descrito abaixo.
    1. Transfira os globos oculares para placas de Petri de 10 cm contendo 1x PBS. Segure qualquer tecido muscular preso ao globo ocular usando uma pinça. Crie um orifício no limbo usando uma agulha de injeção 30G. Insira a ponta da tesoura Vanna no orifício e corte ao redor da ora serrata. Remova a lente da ocular usando uma pinça.
    2. Faça 3-4 cortes na ocular e use uma pinça para segurar o EPR e remova suavemente o EPR da retina.
    3. Corte um pequeno pedaço de filtro de membrana de nitrato de celulose e mergulhe-o em 1x PBS. Coloque a retina isolada no filtro. Empurre suavemente uma área periférica da retina com a ponta de um pincel fino para prender a borda da retina ao filtro.
    4. Segure a borda do filtro e puxe-o lentamente para fora do PBS 1x, garantindo que a retina permaneça presa e achatada no filtro. Coloque a retina/filtro em uma toalha de papel por 1 min para ajudar a prender a retina anexada ao filtro.
    5. Transfira a retina/filtro de volta para uma placa de Petri com 1x PBS. Remova cuidadosamente quaisquer detritos, cabelos e vítreos da retina usando uma pinça e/ou um pincel fino, tanto quanto possível. Para distinguir as retinas injetadas e não injetadas, apare os filtros em diferentes formas.
  4. Transfira a retina/filtro de volta para uma placa de Petri. Fixe a retina em formalina tamponada neutra a 10% por 5 min em temperatura ambiente com agitação suave.
  5. Preparar um banho-maria a 65 °C. Pré-aqueça 30 mL de 1x PBS em um copo de vidro de 50 mL. Transfira a retina/filtros diretamente para o PBS 1x pré-aquecido. Incube retinas a 65 ° C por 30 min.
    NOTA: O tratamento térmico inativa a atividade AP endógena, o que causa manchas de fundo na retina. É crucial tratar a retina na solução aquecida para eliminar efetivamente esse fundo.
  6. Após o tratamento térmico, transfira as retinas para uma placa de Petri de 30 mm contendo tampão AP (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2).
  7. Incube as retinas no tampão AP à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave.
    NOTA: Esta etapa troca o tampão na retina de 1x PBS para tampão AP, evitando a precipitação química durante o desenvolvimento da cor.
  8. Substitua o tampão AP por solução de coloração (30 μL de 10 mg / mL BCIP e 60 μL de 10 mg / mL NBP em 10 mL de tampão AP).
  9. Coloque a placa de Petri em uma caixa que exclua a luz. Desenvolva a reação AP à temperatura ambiente por 1 a 2 dias com agitação suave até que a intensidade da coloração AP seja satisfatória para a imagem.
  10. Pare a reação lavando as retinas com 1x PBS por 5 min, 2x, em temperatura ambiente com agitação suave.
  11. Fixe as retinas com formalina tamponada neutra a 10% por 10 min em temperatura ambiente com agitação suave.
  12. Lave as retinas com 1x PBS por 5 min, 3x, em temperatura ambiente com agitação suave. Desidrate as retinas incubando-as em etanol a 30%, seguido de etanol a 50% por 30 min cada em temperatura ambiente com agitação suave.
  13. Use um pincel fino para remover suavemente as retinas do papel de filtro. Desidrate as retinas sem filtro em etanol a 70% por 30 min, seguido por duas incubações de 30 min em etanol a 100% em temperatura ambiente com agitação suave.
  14. Limpar as retinas numa placa de Petri de vidro com uma solução de limpeza de benzato de benzila/álcool benzílico (2:1, v/v) durante 30 min a 2 h à temperatura ambiente com agitação suave.
    NOTA: Este procedimento de limpeza não deve ser realizado durante a noite, pois a incubação prolongada pode resultar na perda da coloração AP. A solução de limpeza pode derreter o plástico, portanto, o procedimento deve ser realizado em um recipiente de vidro.
  15. Para montar as retinas em uma lâmina de vidro, aplique fita dupla-face na lâmina para criar uma plataforma para a lamínula e a retina. Coloque as retinas na lâmina, preencha o espaço com solução de limpeza, aplique a lamínula e sele a lâmina com esmalte para prender a retina e a lamínula.
  16. Imagem das retinas coradas com AP usando um microscópio Zeiss Apótomo.

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Resultados

A aplicação de NMDA no vítreo induz a morte do RGC, que convencionalmente foi detectada por meio de coloração histológica ou coloração de imunofluorescência (IF) com marcadores RGC. Em nosso ambiente experimental, usando a estratégia convencional de IF com um marcador pan-RGC RBPMS, confirmamos que o número de RGCs diminuiu aproximadamente 65%, 1 semana após a injeção de NMDA (Figura 2E-G). Estudos anteriores descobriram que os RGCs que expressam Tbr2 são de fato ipRGCs

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Discussão

Neste estudo, utilizamos um sistema de marcação AP esparso geneticamente direcionado em conjunto com várias linhagens de camundongos geneticamente manipuladas para examinar eventos degenerativos induzidos por NMDA em vários subtipos RGC e AC e descobrimos vários fenótipos característicos 29,31,39. O fenótipo mais notável é a redução significativa de RGCs e ACs nas retinas injetadas com NMDA (

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do National Institutes of Health-National Eye Institute para C.A.M. (EY024376) e em parte pelo National Eye Institute Vision Core Grants P30EY028102 (UTHealth). Também reconhecemos o apoio financeiro do Stephen Lasher Endowment (UTHealth) e do Raye White Endowment (UTHealth).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pomada oftálmica de eritromicina 0,5% Bausch+Lomb24208-910-55
Cloridrato de proparacaína a 0,5% Bausch+Lomb24208-730-06
10% de formalina tamponada neutra VWR89370-094
10 cm de petrisCorning430167
10x PBSFisher CientíficoBP399Dilua em água para criar 1x PBS e autoclave. 
Tubo de 2,0 mlVWR525-1136
Agulha de injeção de calibre 30EXELINT Internacional26437
Petriche de 30 mmFalcão35208
Álcool benzílicoAcros Orgânicos447000010
Benzato de benziloAcros Orgânicos105860010
Filtro de membrana de nitrato de celuloseCytiva7188-002
LamínulaCiências da Microscopia Eletrônica72204-01
Fita dupla faceUísque escocês597020
EtanolLaboratórios Decon2716Evite Fisher Bioreagents (Cat#: BP2818) para desidratação após a coloração AP. Este reagente distorce as retinas.
FórcepsTED PELLA505
Almofada de aquecimentoO que710298-001
Seringa de insulinaBD329424
CetaminaDechra17033010110
MicroscópioZeissAxio Imager 2
EsmalteCiências da Microscopia Eletrônica72180
Injetor NanofilInstrumentos de precisão mundiaisNANOFIL
Agulha NanofilInstrumentos de precisão mundiaisNF25BL
Kit de reagentes NBT/BICPInvitrogenN6547
AnúnciosSigma-AldrichM3262
PincelKingart6650
Vidro deslizanteFisher Científico12-550-15
Microscópio estéreoMoticoDM143
Óleo de semente de girassolSigma-AldrichS5007
TamoxifenoSigma-AldrichT5648Armazene a solução de tamoxifeno a 4 & C em uma caixa à prova de luz. Use solução de tamoxifeno dentro de uma semana.
Tesoura Vanna Ferramentas de Belas Ciências15000-00
Banho-mariaLinha de Laboratório18052
xilazinaDechra17033-0099-05Nome do produto: Rompun

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Excitotoxicidade por NMDADegeneração de RGCRetina de CamundongoMorfologia CelularSobrevivência CelularResiliência CelularDoenças RetinianasFenótipos AnatômicosMarcação Celular
Exame das características anatômicas das células ganglionares da retina sob excitotoxicidade induzida por ácido N-metil-D-aspártico (NMDA)
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