Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Resumo

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Resumo

O protocolo apresenta um método para integrar um sistema de biorreator construído internamente com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) hiperpolarizada de ¹³C para medir o metabolismo do piruvato em células vivas em tempo real. O protocolo descreve a construção de um sistema de biorreator que permite o tempo preciso de injeção de substrato hiperpolarizado e aquisição de sinal de RMN, mantendo um ambiente de cultura de células estável. O método detecta de forma confiável a conversão metabólica de piruvato em lactato dentro de uma janela de medição de 60 s, mantendo uma relação sinal-ruído suficiente durante todo o processo. A capacidade de mistura in situ do sistema acelera a detecção do sinal de RMN e reduz as perdas de relaxamento T₁. O protocolo também inclui instruções detalhadas para a preparação de géis de alginato para encapsular células e colocá-las dentro do biorreator. O método proposto apresenta melhor reprodutibilidade e precisão cinética em comparação com os métodos convencionais, indicando potenciais aplicações em estudos de metabolismo do câncer e triagem de drogas. Refinamentos adicionais do sistema, como a adoção de matrizes de gel alternativas, podem melhorar sua versatilidade em vários estudos biológicos.

Introdução

A RMN hiperpolarizada, particularmente por meio da polarização nuclear dinâmica (DNP), aumenta significativamente a intensidade do sinal de RMN¹ e permite o rastreamento em tempo real das alterações metabólicas com sensibilidade muito aprimorada ^2,3. Esta técnica foi aplicada com sucesso em vários sistemas biológicos, incluindo levedura ^4,5, modelos de células cancerígenas ^6,7,8 e microrganismos ^9,10. Também tem sido usado para monitorar as principais vias metabólicas, como glicólise^11,12, homeostase redox^13,14 e regulação do pH^15,16. Além da pesquisa básica, a RMN hiperpolarizada é agora utilizada em imagens clínicas por meio de ressonância magnética, permitindo a avaliação metabólica da escala celular para a escala de corpo inteiro¹⁷. Esses desenvolvimentos ressaltam a crescente demanda por protocolos acessíveis que facilitem o uso mais amplo de RMN hiperpolarizada em diversos contextos biológicos.

Apesar de sua versatilidade, a implementação de medições metabólicas em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada permanece tecnicamente desafiadora. Os sistemas convencionais geralmente dependem de configurações complexas e específicas do laboratório que carecem de reprodutibilidade e são difíceis de operar sem ampla experiência 8,18,19,20. Isso representa uma grande barreira para os pesquisadores que pretendem adotar essa tecnologia para pesquisa biológica ou translacional. Em comparação com métodos alternativos, como imagem óptica ou espectrometria de massa, a RMN hiperpolarizada de ¹³C permite o monitoramento não invasivo e resolvido no tempo de reações metabólicas específicas sem amostragem destrutiva. Ele fornece informações bioquímicas diretas com precisão temporal, tornando-o adequado para estudos dinâmicos do metabolismo celular.

Para abordar essas limitações, este estudo apresenta um protocolo prático e reprodutível projetado especificamente para permitir que os pesquisadores realizem medições de RMN hiperpolarizada do metabolismo de células vivas com o mínimo de obstáculos técnicos. Descreve-se um método abrangente para a medição básica do metabolismo do piruvato em células vivas. Embora este protocolo possa ser aplicado a outras sondas marcadas ^{com 13}C, o piruvato é particularmente adequado devido à sua rápida absorção celular, vias metabólicas bem caracterizadas e seu papel central no metabolismo celular. O procedimento consiste em: (i) preparação de amostras de células, (ii) encapsulamento em géis de alginato, (iii) hiperpolarização usando um polarizador DNP e (iv) medição de RMN ^{de 13}C em tempo real em um espectrômetro de 400 MHz (Figura 1). Além disso, os principais parâmetros para a construção do sistema de biorreator são fornecidos para garantir a reprodutibilidade e compatibilidade com o hardware de RMN padrão. O protocolo é otimizado para facilitar a implementação usando componentes disponíveis comercialmente e destina-se a ajudar os pesquisadores, especialmente aqueles novos na técnica, a determinar sua adequação às suas necessidades experimentais.

Protocolo

1. Configuração do biorreator (Figura 2A-B)

1. Montagem do tubo de RMN
   1. Use um tubo NMR com tampa de rosca (10 mm de diâmetro, comprimento 178 mm) com uma tampa aberta para inserção da tubulação.
   2. Prepare um septo de frasco de silicone/PTFE (9 mm de diâmetro) e insira um tubo PEEK através dele para vedação hermética (Figura Suplementar 1).
   3. Insira o septo com tubo PEEK quimicamente resistente (diâmetro interno 1.0 mm, diâmetro externo 1.6 mm, espessura da parede 0.3 mm, comprimento 1 m) na abertura da tampa modificada.
   4. Coloque o septo entre o tubo de RMN e sua tampa aberta e prenda-o fechando firmemente a tampa. Essa configuração mantém o septo no lugar e fornece uma vedação suficiente para evitar vazamentos durante a perfusão ou injeção.
2. Configurando a tubulação de entrega média (Figura 2C)
   1. Conecte o tubo PEEK às portas de entrada e saída do tubo de RMN para permitir a perfusão contínua. Prenda as conexões usando um conjunto de conexões sem flange para evitar vazamentos.
3. Instalando os componentes de aquecimento médio
   1. Conecte a tubulação PEEK a uma bomba peristáltica ajustável a uma vazão estável de aproximadamente 0,2 mL/min, garantindo a circulação contínua do meio por meio de um kit de circulação externa. Colocar o reservatório médio num banho-maria regulado para 37 °C para manter a temperatura.
4. Adicionando componente de prevenção de vazamento de gel
   1. Corte uma esponja densa para caber no diâmetro do tubo de RMN. Insira a esponja no fundo do tubo para evitar vazamento de gel de alginato, permitindo o fluxo médio.
5. Fabricação e inserção do componente de fixação de esponja impresso em 3D (Figura 2D-F)
   1. Imprimir em 3D um suporte cilíndrico (diâmetro externo 9,1 mm, comprimento 20 mm, com um orifício central de 1,5 mm de diâmetro) usando uma resina fotopolimérica compatível com impressão 3D estereolitográfica. As especificações de projeto são fornecidas no Arquivo Suplementar 1 anexo.
   2. Insira um capilar de vidro borossilicato (diâmetro externo de 1.5 mm, diâmetro interno de aproximadamente 0.9 mm, comprimento de 90 mm) através do orifício pré-formado do suporte impresso em 3D.
   3. Prenda a esponja à plataforma no suporte usando resina curável por UV com propriedade de resistência à água. Catalise por 30 s sob luz UV para garantir a solidificação.
   4. Insira o suporte montado com esponja no tubo de RMN.

2. Preparação celular (iniciar 2 semanas antes da medição)

1. Descongelar rapidamente as células congeladas (SCCVII ou HeLa) num banho-maria a 37 °C. Transfira aproximadamente 1 × 10⁶ células para 10 mL de meio RPMI-1640 suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino e 1% (v / v) de penicilina-estreptomicina.
2. Cultive células a 37 ° C com 5% de CO₂ e passe-as a cada 2-3 dias assim que a confluência de 70% a 80% for atingida. Continue cultivando por aproximadamente 2 semanas para obter ~ 4 x 10⁷ células, estimadas a partir de cinco placas de 10 cm crescidas até aproximadamente 90% de confluência (cada uma produzindo ~ 8 x 10⁶ células).

3. Preparação do gel de alginato

1. Preparação da solução de alginato
   1. Dissolva o pó de alginato de sódio de grau de pesquisa biológica em água deionizada para preparar uma solução a 2% (p / v). Incubar a solução durante a noite a 25 °C ou mais com uma agitação suave de ponta a ponta. Use um rotador de tubo ajustado em aproximadamente 10-20 rpm para evitar bolhas e garantir uma dissolução uniforme.
2. Encapsulamento de células em gel de alginato
   1. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% (v / v) ao prato de 10 cm. Incline o prato para cobrir toda a superfície e aspire o excesso de tripsina-EDTA.
   2. Incubar a cápsula a 37 °C durante 2 minutos.
   3. Adicione 10 mL de meio de cultura ao prato. Pipete suavemente para cima e para baixo para separar as células. Colete toda a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL.
   4. Pegue aproximadamente 10 μL da suspensão e conte o número de células usando um contador de células. Normalmente, cerca de 1 × 10⁷ células são necessárias para os procedimentos subsequentes, mas o número real deve ser confirmado por medição.
   5. Centrifugue a suspensão de células restante a 120 × g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 4 mL de solução de alginato a 2% (p / v). Pipete lentamente para minimizar a geração de bolhas.
3. Formação de gel por reticulação de cálcio (Figura 3)
   1. Adicione 10 mL de solução de CaCl₂ 50 mM a um tubo de centrífuga de 50 mL ( Figura 3A ).
   2. Pegue 300 μL da mistura de alginato celular em uma seringa de 0,5 mL equipada com uma agulha de 30 G e 10 mm e prenda-a na tampa do tubo da centrífuga ( Figura 3B ).
   3. Feche bem a tampa do tubo da centrífuga com a seringa fixada a ela e centrifugue todo o conjunto suavemente a 200 × g por 5 min. Remover a solução sobrenadante após centrifugação e ressuspender o gel carregado com células no meio (figura 3C-D).
4. Carregando o gel no tubo de RMN
   1. Transfira o gel encapsulado em células para o tubo de RMN usando uma pipeta Pasteur. Insira o acessório de esponja e certifique-se de uma vedação firme.
   2. Pré-aqueça o reservatório médio (contendo 5% (v / v) D₂O) preparado na etapa 1.3.2 em banho-maria a 37 ° C e circule-o a uma taxa de aproximadamente 500 μL / h para estabilizar as condições.
   3. Certifique-se de que não haja vazamentos antes de inserir o tubo de RMN no ímã. Enquanto mantém o tubo PEEK reto, insira o tubo NMR no ímã. Ajuste o tamanho do gel, o número de grânulos e a velocidade de pipetagem de acordo com o tipo de célula e os requisitos experimentais.

4. Preparação da sonda hiperpolarizada usando um polarizador DNP (Figura 4)

1. Preparação do frasco de amostra
   1. Adicione 18 μL de ácido pirúvico [^1-13C] (14,2 M) dopado com 25 mM OX063 a um frasco de amostra. Conecte o frasco ao caminho do fluido do sistema polarizador DNP.
2. Polarização da amostra
   1. Insira o frasco na unidade de furo do polarizador DNP (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). Aplique irradiação de microondas a aproximadamente 188 GHz (22 mW) por 60-80 min.
3. Sinal de monitoramento durante a polarização
   1. Use o espectrômetro de RMN de estado sólido embutido no sistema DNP para monitorar a intensidade do sinal de ¹³C. Registre os dados do sinal a cada 5 minutos usando o software de RMN (SPINit).
4. Dissolver e preparar a solução hiperpolarizada
   1. Dissolva rapidamente a amostra polarizada em 3,2 mL de tampão de dissolução pré-aquecido (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg / L EDTA). Certifique-se de que a solução atinja a temperatura biológica (308-313 K, pH ~ 7) antes de transferir para medição de RMN.
      NOTA: Tenha cuidado ao manusear componentes de alta pressão. Pré-aqueça o tampão de dissolução a ~461 K para garantir uma transferência eficiente e a integridade da amostra.

5. Configuração de RMN

1. Preparação do espectrômetro de RMN
   1. Carregue a amostra no tubo de RMN e insira-a no espectrômetro.
   2. Execute bloqueio, ajuste, correspondência e correção no console de RMN usando o procedimento automatizado com sample inserido, para otimizar a resolução espectral e a estabilidade do sinal.
2. Configurando os parâmetros de aquisição
   1. Carregue uma sequência de aquisição de pulso de ¹³C (por exemplo, zg2d) com o desacoplamento de prótons habilitado (por exemplo, 13-CPD).
   2. Defina o ângulo de inversão para 90° usando um pulso de 1 μs (P1). Defina o tempo de aquisição para 1,376 s, a largura espectral para 23.663 Hz e o número de pontos de aquisição (TD) para 65.536. Defina o atraso de relaxamento (D1) para 0 s.
   3. Defina o número de incrementos de tempo (TD1) para 150 para adquirir 150 espectros sequenciais no modo pseudo-2D. Ajuste o ganho do receptor para um valor baixo (por exemplo, ~1) para evitar a saturação do sinal de amostras hiperpolarizadas.
      NOTA: Devido à alta intensidade do sinal de RMN hiperpolarizada, defina o ganho do receptor para um valor baixo (por exemplo, ~1), que normalmente corresponde a menos de 1% do ganho máximo disponível. O ganho do receptor é um parâmetro interno e sem unidade que controla a amplificação do sinal. Valores excessivamente altos podem resultar em saturação do sinal.

6. Medição de RMN

1. Preparação para medição
   1. Preencha todo o caminho da tubulação de entrada da tubulação de entrada até o tubo de RMN com tampão de dissolução para evitar o aprisionamento de ar (Figura 2B). A tubulação de entrada é usada tanto para perfusão média quanto para injeção de sonda hiperpolarizada.
   2. Verifique cuidadosamente se não há bolhas de ar presentes na tubulação de entrada ou dentro do tubo de RMN, pois as bolhas nessa região podem interferir na aquisição do sinal durante as medições de RMN.
2. Preparação para injeção de solução hiperpolarizada
   1. Pare a bomba peristáltica para interromper temporariamente a circulação do meio antes de injetar a solução hiperpolarizada através do tubo de entrada.
   2. Inicie a aquisição espectral aproximadamente 10 s antes de dissolver o substrato hiperpolarizado para garantir que o sinal seja capturado imediatamente após a chegada ao local de detecção de RMN após a injeção.
   3. Retire 1 mL da solução com uma seringa quando ela sair do polarizador DNP.
3. Injeção da solução hiperpolarizada e confirmação do sinal
   1. Mude a válvula de três vias na entrada do biorreator para a posição B para injetar a solução hiperpolarizada no tubo de RMN.
   2. Mude a válvula de volta para a posição A após a injeção para retomar a circulação média e evitar o refluxo.
   3. Confirme a injeção bem-sucedida e a chegada do substrato observando um aumento no sinal de decaimento por indução livre (FID) no software de aquisição.

7. Tratamento e análise de dados

1. Processamento de dados espectrais
   1. Carregue o espectro de RMN resolvido no tempo no software de processamento de dados. Se os dados estiverem armazenados no formato de arquivo ser, localize e carregue o arquivo apropriado.
2. Analisando os espectros
   1. Execute a Transformação de Fourier (FT) para converter o FID bruto para o domínio da frequência. Aplique a correção de fase manual ou automaticamente. Realize a correção da linha de base para remover distorções.
3. Visualização da conversão de metabólitos
   1. Plote os sinais de curso de tempo para piruvato C1 (~ 171 ppm) e lactato C1 (~ 183 ppm).
4. Quantificação da conversão metabólica
   1. Calcule a área sob a curva (AUC) para os picos de piruvato e lactato.
   2. Determine a relação [Lactato]/[Piruvato] dividindo a AUC do lactato pela do piruvato.
      NOTA: A AUC é usada em vez da altura do pico para minimizar a influência dos artefatos de toque causados pelo grande sinal de piruvato hiperpolarizado [1-¹³C]. Os valores de AUC são obtidos pela simples soma das intensidades de sinal dentro da faixa de integração definida para cada pico.

Resultados

Neste estudo, um sistema fabricado foi acoplado à espectroscopia de RMN ^{hiperpolarizada de 13}C para medir o metabolismo do piruvato em células vivas em tempo real. Os principais sinais detectados no espectro de RMN de 1D ¹³C corresponderam ao piruvato (aproximadamente 171 ppm) e lactato (aproximadamente 183 ppm)²¹, permitindo avaliar a conversão metabólica do piruvato em lactato em condições fisiológicas (Figura 4).

Qualidade espectral e dinâmica de sinal
Resultados representativos de medições repetidas na mesma amostra usando células SCCVII - uma linha de carcinoma de células escamosas de camundongo frequentemente usada em estudos de ressonância magnética hiperpolarizada - são mostrados na Figura 5. A primeira medição exibiu um claro aumento no sinal de lactato, indicando conversão metabólica ativa. No entanto, medições subsequentes feitas em intervalos de 1,5 h mostraram um declínio progressivo na atividade metabólica. Essa redução dependente do tempo provavelmente reflete o estresse biológico ou a adaptação induzida pela injeção inicial de piruvato. Notavelmente, uma modulação metabólica transitória semelhante foi relatada in vivo usando ressonância magnética hiperpolarizada e EPRI, onde a oxigenação do tumor diminuiu temporariamente após a administração de piruvato²². Esses resultados demonstram que a repetibilidade dessas medições permite o rastreamento não destrutivo de mudanças metabólicas dinâmicas - uma vantagem difícil de alcançar com métodos destrutivos²³.

Para avaliar a aplicabilidade deste protocolo a outros tipos de células, medições adicionais foram realizadas usando células HeLa, uma linha de células cancerígenas humanas amplamente utilizadas. Conforme mostrado na Figura 6, as células HeLa também exibiram clara conversão de piruvato em lactato. Embora a intensidade do sinal tenha diminuído gradualmente devido ao relaxamento de T₁, a relação sinal-ruído permaneceu suficiente durante todo o período de aquisição de 60 s. Essas descobertas sugerem que o protocolo atual é amplamente aplicável e pode servir como uma ferramenta versátil para perfis metabólicos em tempo real em vários tipos de células.

Embora o decaimento rápido do sinal seja uma limitação inerente da RMN baseada em DNP, nosso sistema de mistura in situ minimiza o atraso entre a dissolução e a medição, aumentando assim a sensibilidade de detecção. Refinamentos adicionais, como a otimização da composição da matriz de gel, podem expandir a aplicabilidade desse método a uma gama mais ampla de sistemas biológicos.

Figura 1: Diagrama esquemático do fluxo de trabalho geral da cultura de células à medição de RMN hiperpolarizada. O processo começa com a cultura de células (~2 semanas), seguida pela preparação do gel de alginato (~60 min) para encapsular as células para uma medição estável. Em seguida, a hiperpolarização é realizada usando um sistema polarizador DNP (~ 60 min) e a medição de RMN é realizada usando um espectrômetro de RMN de 400 MHz (~ 5 min). As fotografias à direita mostram os instrumentos correspondentes usados neste fluxo de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Configuração do biorreator para medição de RMN hiperpolarizada. (A) Diagrama esquemático da configuração do biorreator. O meio de cultura é introduzido no tubo de RMN através da entrada A e posteriormente direcionado para o lixo. Grânulos de alginato contendo células vivas são colocados dentro do tubo de RMN. Durante as medições de RMN hiperpolarizada, a sonda hiperpolarizada é injetada através da entrada B, rotulada como entrada da sonda hiperpolarizada. (B) Fotografia de toda a configuração do biorreator, com a tubulação de entrada e saída claramente identificada. (C) Vista aproximada do interruptor da tubulação de entrada, mostrando a entrada A (perfusão média) e a entrada B (injeção de sonda hiperpolarizada). (D) Projeto CAD e (E) fotografia representativa do componente de fixação de esponja impresso em 3D colocado dentro do tubo de RMN. O componente inclui um orifício para guiar um capilar de vidro que fornece a solução de substrato hiperpolarizado e uma plataforma para segurar uma esponja. O componente em si não se encaixa firmemente na parede interna do tubo de RMN; (F) em vez disso, uma esponja é inserida ao redor dele para preencher a lacuna. Essa estrutura estabiliza o componente e permite que o meio residual flua para cima através da esponja, eliminando a necessidade de um orifício de saída adicional. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Preparação do gel de alginato. (A) Ilustração esquemática e (B) fotografia do aparelho de formação de bola de gel de alginato. A imagem à esquerda mostra toda a configuração, incluindo o tubo da centrífuga com uma seringa fixada em sua tampa modificada. A imagem superior direita mostra uma tampa com um pequeno orifício para a ponta da seringa, enquanto a imagem inferior direita mostra uma tampa com uma abertura quadrada para posicionamento estável da seringa. O tubo da centrífuga é pré-preenchido com 10 mL de solução de cloreto de cálcio, permitindo que a solução de alginato que sai da ponta da seringa seja gelificada, formando bolas de gel de alginato. (C) Imagem microscópica representativa mostrando a morfologia das bolas de gel de alginato. (D) Imagem microscópica representativa mostrando a morfologia de bolas de gel de alginato contendo células HeLa. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Representação esquemática das etapas de preparação para medição de RMN e hiperpolarização. Durante o processo de acúmulo de DNP de ~ 60 minutos, a configuração de NMR é executada em paralelo para minimizar atrasos. A preparação envolve o carregamento do grânulo de alginato no tubo de RMN, seguido de ajuste de trava de ¹H, calço e ajuste da sonda para garantir que o sistema esteja pronto para medição imediata. Após a dissolução e mistura in situ , a espectroscopia de RMN ^{de 13}C resolvida no tempo revela picos claros de piruvato e lactato. Os picos observados em aproximadamente 171 ppm, 179 ppm e 183 ppm correspondem a piruvato, hidrato de piruvato e lactato, respectivamente. Aproximadamente 4 × 10⁷ células HeLa encapsuladas em gel de alginato foram usadas para a medição da RMN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Detecção resolvida no tempo de sinais de piruvato e lactato em medições repetidas. Espectros de RMN de ¹³C hiperpolarizados da mesma amostra encapsulada em células SCCVII foram adquiridos em intervalos de 1,5 h para avaliar a viabilidade de medições não destrutivas repetidas. As intensidades máximas de piruvato (círculos abertos) e lactato (círculos preenchidos, dimensionados em 1000×) são plotadas ao longo do tempo para cada aquisição. (A) Primeira medição. (B) A segunda medição, após 1,5 h, revela uma redução acentuada na produção de lactato. (C) A terceira medição, após mais 1,5 h, confirmou baixa atividade metabólica sustentada. A análise quantitativa baseada na área sob a curva (AUC) mostrou que a relação [Lactato]/[Piruvato] diminuiu de 0,00134 (primeira medição) para 0,00019 (segunda) e 0,00027 (terceira). A concentração final de células no gel de alginato foi de aproximadamente 1,0 × 10⁷ células/mL (4 × 10⁷ células em 4 mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Conversão de piruvato em lactato em células HeLa. Sinais de RMN de ¹³C hiperpolarizados resolvidos no tempo de piruvato e lactato foram medidos em células HeLa vivas. A intensidade do sinal do piruvato é normalizada para seu valor máximo no tempo zero. A intensidade do sinal de lactato é dimensionada por um fator de 10³ para visibilidade. A análise quantitativa baseada na área sob a curva (AUC) mostrou uma relação [Lactato]/[Piruvato] de 0,00121. A concentração celular final no gel de alginato foi de aproximadamente 7,5 × 10⁶ células/mL (3 × 10⁷ células em 4 mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura suplementar 1. Imagens representativas do septo do frasco usado no sistema do biorreator. (A) Septo de silicone/PTFE (9 mm de diâmetro) antes do uso. (B) O mesmo septo em uso real, com tubo PEEK inserido através de orifícios perfurados. A elasticidade do material do septo permite que ele vede novamente ao redor da tubulação, mantendo condições herméticas durante a injeção de substrato hiperpolarizado. Clique aqui para baixar esta figura

Figura suplementar 2: Espectro de RMN de ¹³C hiperpolarizado resolvido no tempo adquirido após mistura externa. Espectro representativo resolvido no tempo do metabolismo do piruvato [^1-13C] medido usando um sistema de RMN de bancada após mistura externa de piruvato hiperpolarizado e células fora do tubo de RMN. Clique aqui para baixar esta figura

Arquivo Suplementar 1: Projeto CAD do suporte cilíndrico. Clique aqui para baixar este arquivo

Discussão

Etapas críticas do protocolo
O sucesso deste protocolo depende de várias etapas críticas. Primeiro, é importante garantir a dissolução e transferência adequadas do piruvato de ¹³C hiperpolarizado para manter uma alta relação sinal-ruído. Para capturar a conversão metabólica precoce do piruvato em lactato, o momento da injeção da sonda hiperpolarizada e a aquisição da RMN devem ser sincronizados. Além disso, é importante manter a viabilidade celular durante todo o experimento. Desvios desses parâmetros podem resultar em redução da atividade metabólica e perda de sinal.

Modificações e solução de problemas do método
Embora este protocolo forneça uma abordagem robusta para monitoramento metabólico em tempo real, certas modificações podem melhorar sua aplicabilidade. Por exemplo, ajustar o ângulo de inversão da aquisição de RMN pode equilibrar a intensidade do sinal e o decaimento da polarização para otimizar a coleta de dados. Além disso, embora tenha sido introduzido um método para preparar géis de alginato de forma estável de um determinado tamanho, o tamanho dos géis a serem criados pode ser facilmente ajustado selecionando uma seringa ou agulha. Isso pode contribuir para a reprodução de um ambiente hipóxico²⁴ , além de impedir que as células escapem do tubo de RMN. Além disso, o gel de alginato torna-se denso e viscoso dentro do tubo de RMN, especialmente na área de medição de RMN. Se o ar entrar ao injetar o meio de cultura ou a sonda hiperpolarizada do tubo PEEK, é provável que permaneça no local de medição da RMN, o que levará a uma diminuição na qualidade do espectro.

Limitações do método
Embora as medições hiperpolarizadas tenham a vantagem de alta sensibilidade dos sinais de RMN, elas têm limitações inerentes. Devido ao relaxamento de T₁ do piruvato de ¹³C hiperpolarizado, a duração das medições metabólicas é limitada a cerca de 1 min, limitando a observação de mudanças metabólicas de longo prazo. Além disso, é difícil medir uma amostra de célula várias horas depois de ter sido medida uma vez, o que pode estar relacionado ao gotejamento de uma grande quantidade de piruvato em uma medição. Isso é o mesmo que o fato de que grupos relacionados mediram espectros um dia depois¹⁸, e o intervalo de medição precisa ser tão longo.

Importância do método em comparação com as técnicas existentes
Comparado aos ensaios metabólicos convencionais, nosso método tem uma vantagem sobre as medições finais, como espectrometria de massa e ensaios bioquímicos, pois fornece informações em tempo real sobre o metabolismo celular. Embora espectros de RMN hiperpolarizados semelhantes possam ser obtidos sem o uso de um biorreator, a capacidade de iniciar as medições imediatamente com mistura in situ é benéfica, dada a rapidez do relaxamento. Além disso, as células podem ser pré-configuradas em um ambiente estável antes da injeção, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética da análise metabólica. Essa vantagem é apoiada por um experimento suplementar (Figura Suplementar 2), onde os espectros resolvidos no tempo foram adquiridos usando um sistema de RMN de bancada após a mistura externa. Nesta configuração, um atraso de aproximadamente 30 s entre a mistura e a aquisição do sinal levou a uma perda significativa de polarização, afetando particularmente a detecção de lactato. Isso confirma que a mistura in situ melhora a fidelidade das medições cinéticas sob condições com rápido decaimento de T₁ . No entanto, vale a pena notar que a intensidade do sinal nesta configuração in situ foi menor, provavelmente devido à diluição causada pela perfusão do meio - um problema que ainda precisa ser otimizado.

Importância e potenciais aplicações
Este método pode abrir caminho para aplicações na compreensão das propriedades metabólicas de diversas formas de vida. A medição em tempo real dos fluxos metabólicos permite que os pesquisadores avaliem dinamicamente os efeitos dos inibidores metabólicos. A integração dessa abordagem com outras técnicas de medição pode aumentar ainda mais a precisão da análise do metabolismo intracelular.

Prevemos um fluxo de trabalho experimental prático no qual a metabolômica destrutiva e de alto rendimento é usada para identificar vias candidatas, seguida de validação em tempo real usando RMN de ¹³C hiperpolarizada para avaliar a função enzimática e a dinâmica do fluxo em células vivas. Essa abordagem permite a detecção direta de respostas metabólicas transitórias em condições fisiológicas - algo difícil de alcançar usando imunoensaios ou sensores de fluorescência, que normalmente medem os níveis de metabólitos estáticos ou requerem sondas exógenas. Embora a imagem de fluorescência e os imunoensaios sejam indispensáveis para localização espacial e triagem de alto rendimento, respectivamente, a RMN hiperpolarizada fornece uma leitura funcional complementar que captura a cinética da reação de maneira não destrutiva. Essa estratégia não apenas facilita insights mecanicistas no nível celular, mas também serve como uma ponte para aplicações diagnósticas na escala de tecido ou organismo. Em particular, a capacidade de capturar mudanças metabólicas funcionais em tempo real pode apoiar a detecção precoce de distúrbios metabólicos e respostas terapêuticas em sistemas biológicos complexos.

Também houve progresso no desenvolvimento de sondas metabólicas direcionadas a diversas vias metabólicas e substratos sintéticos projetados para enzimas específicas, expandindo as possibilidades de pesquisa metabólica^25,26. Além disso, avanços nas técnicas de hiperpolarização, como a entrega de substratos hiperpolarizados diretamente do polarizador para a RMN através de um túnel magnético²⁷- podem melhorar a retenção do sinal e expandir as aplicações potenciais desse método na pesquisa biomédica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
[1-13C] ácido pirúvico	Cambridge Isot ope Laboratories, Inc.	CLM-8077
Impressora 3D	Elegoo	Saturno 2
Cloreto de cálcio	Nacalai Tesque, Inc.	06729-55
D2O	Sigma-Aldrich	151882
Kit de Circulação Externa para Bomba	COMO UM	1-4141-02
Soro fetal bovino	Gibco	10270106
Conjunto de conexões sem flange	GL Sciences Inc.	6010-46390
Capilar de vidro com núcleo	Narishige	GDC-1.5	Diâmetro interno ~0,9 mm, comprimento 90 mm
Bomba de circulação magnética	COMO UM	1-4141-01
MestReNova	Pesquisa Mestrelab		Software de processamento e análise espectral de RMN
Minha seringa de injeção	Corporação Nipro	8277	0,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 peças
OX063	Oxford Instruments Co. Ltd.  e Polarize IVS Co. Ltd.	-
Tubo PEEK	COMO UM	3-780-05
penicilina-estreptomicina	Nacalai Tesque, Inc.	26252-94
Mini Bomba Peristáltica Bio	ATTO	1221200	Tipo de alta precisão e ampla vazão para fluxo médio estável
Resina	Siraya Tecnologia	Preto Esfumaçado
RPMI-1640 Médio	Nacalai Tesque, Inc.	30264-85
Septo do frasco de silicone/PTFE	GL Sciences Inc.	1030-50009
Alginato de sódio 80-120	Corporação Química Pura FUJIFILM Wako	194-13321
Software SPINit	RS2D		Software de RMN no polarizador DNP
Esponja	-	-	Esponja comercialmente disponível cortada no tamanho para estabilização do gel
Torneira de três vias	COMO UM	3-6247-04
Topspin	Bruker		Software de aquisição e processamento de dados de RMN
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Científico	07086-74
Resina curável por UV	BONDIC	BD-SKCJ
Banho-maria	COMO UM	1-5832-41	Robô Térmico Série TR TR-1α para manter 37 ° Temperatura C
Tubo de RMN com tampa de rosca Wilmad	Sigma	Z271977	Frequência 400 MHz, diâmetro 10 mm, L 178 mm.