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Artigo de método

Organoides da córnea derivados de iPSC específicos para pacientes para investigar distúrbios corneanos associados à anirídia

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DOI:

10.3791/68556

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28 de julho de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo para gerar organoides da córnea a partir de iPSCs derivados de pacientes com anirídios, criando um modelo específico para cada paciente para estudar distúrbios corneanos. Esses organoides imitam características estruturais e funcionais importantes, fornecendo uma plataforma in vitro confiável para investigar mecanismos de doenças, testar tratamentos potenciais e avançar abordagens regenerativas personalizadas para doenças oculares anteriores.

Resumo

Aniridia é um raro distúrbio congênito dos olhos marcado pela ausência parcial ou completa da íris, e frequentemente está associado à opacificação da córnea e à deficiência de células-tronco limbares. As mutações genéticas subjacentes, que afetam principalmente o gene PAX6, interrompem tanto o desenvolvimento quanto a função da córnea. As características oculares mais comuns, além dos defeitos da íris, são nistagmo, hipoplasia foveal, catarata, glaucoma e ceratopatia associada à anirídia (AAK). Embora os modelos in vivo ofereçam insights valiosos sobre a patologia da anirídia, modelos in vitro derivados de pacientes são cruciais para investigar os mecanismos da doença e avaliar terapias potenciais. Neste estudo, apresentamos um modelo AAK in vitro usando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas do paciente. Nosso protocolo envolve a diferenciação gradual de iPSCs em células semelhantes a epiteliais corneanas, dentro de organoides tridimensionais auto-montados, que imitam o microambiente corneano nativo. Por meio da otimização das condições de cultura diferenciada, geramos com sucesso organoides corneanos que abrigam populações celulares corneanas distintas, recapitulando os principais atributos estruturais e funcionais da córnea humana.

Introdução

A córnea é um tecido avascular e transparente que forma a camada mais externa do olho, consistindo principalmente em três camadas: uma camada epitelial externa, uma camada estromal contendo uma matriz extracelular rica em colágeno povoada por ceratócitos, e uma camada celularendotelial 1. A córnea desempenha um papel essencial na visão ao proteger as estruturas oculares internas e refratar a luz.

Aniridia é um distúrbio panocular congênito raro, causado principalmente por mutações heterozigotas no gene caixa pareada 6 (PAX6), um regulador mestre do desenvolvimento ocular, caracterizado pela ausência parcial ou completa daíris 2. Além da hipoplasia ou ausência da íris, a maioria dos pacientes desenvolve anomalias progressivas da córnea, coletivamente chamadas de ceratopatia associada à anirídia (AAK), que incluem defeitos epiteliais, disfunção das células-tronco limbares, alterações estromais e opacação progressiva da córnea, levando em última instância à visão. A AAK afeta aproximadamente 78%–90% dos pacientes com anirídia, com gravidade crescenteao longo do tempo 3. Nosso objetivo era estabelecer um protocolo detalhado e reprodutível para gerar organoides da córnea a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de anirídios, a fim de modelar alterações corneanas relevantes para doenças in vitro. Embora modelos animais e estudos ex vivo tenham fornecido insights valiosos sobre a patogênese dos anirídios, diferenças específicas de espécie e acesso limitado ao tecido do paciente restringem sua relevância translacional.

Organoides humanos derivados de iPSC emergiram como sistemas in vitro poderosos para modelar o desenvolvimento humano e doenças 4,5. Organoides corneais, em particular, possibilitam a geração de estruturas tridimensionais semelhantes a tecidos que se assemelham mais à arquitetura corneal nativa, incluindo organização epitelial estratificada, interações estromais – epiteliais e deposição de matriz extracelular, em comparação com culturas monocamadas bidimensionais convencionais, que carecem de organização espacial, interações fisiológicas célula – célula e complexidade microambiental 4,5. Diversas estratégias de diferenciação, incluindo abordagens baseadas em SEAM e orientadas por progenitores oculares, foram relatadas como geradoras de tecidos semelhantes à córnea a partir dosiPSCs 6. Essas abordagens normalmente envolvem uma fase inicial de indução da linhagem ocular, seguida por especificação progressiva de tecidos e seleção de populações heterogêneas de progenitores oculares. A criação de organoides da córnea oferece a oportunidade de estudar diferentes tipos celulares presentes no tecidocorneano 7,8. Além disso, os organoides da córnea derivados de iPSC dos pacientes com anirídios possibilitam o estudo do fundo genético da doença e oferecem uma oportunidade única para estudar os anirídios.

No protocolo atual, tanto as linhas iPSC do tipo selvagem quanto as derivadas de anirídia são submetidas a uma estratégia de diferenciação idêntica e multi-estágio, envolvendo exposição sequencial à diferenciação (DM), diferenciação retiniana (RDM) e meios de diferenciação corneal (CDM) durante um período prolongado de cultivo de semanas. Um passo experimental crítico é a transição da cultura aderente para as condições de suspensão, durante as quais regiões selecionadas semelhantes à córnea são mantidas para promover a auto-organização epitelial.

Embora essa abordagem suporte a geração reprodutível de estruturas epiteliais semelhantes à córnea adequadas para modelagem comparativa de doenças, ela não recapitula totalmente características complexas in vivo , como inervação neural ou organização completa do nicho limbal, que devem ser consideradas ao avaliar a aplicabilidade do método.

Nesse contexto, descrevemos um protocolo padronizado para gerar organoides da córnea a partir de iPSCs derivados de pacientes portadores de mutações PAX6 associadas à anirídia. Importante destacar que a própria estratégia de diferenciação não é modificada entre linhas do tipo selvagem e derivadas de anirídia; em vez disso, fenótipos específicos da doença emergem do contexto genético específico do paciente dentro de um arcabouço experimental uniforme.

No geral, esse método fornece uma plataforma robusta e reprodutível para estudar o desenvolvimento corneano e os mecanismos associados à doença da anirídia, podendo servir como base para futuros estudos mecanicistas e translacionalistas.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do comitê de ética. O estudo foi registrado no banco de dados Human Pluripotent Stronco Registry (hPSCreg), e as aprovações éticas foram documentadas sob o Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation (MESRI; IE-2018-967)9. Os iPSCs são designados com os códigos AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) e WT (de doadores de saúde). Além disso, o comitê de ética da Universidade Hacettepe aprovou o uso desta pesquisa, conforme indicado pelo número de referência 16969557-1213. As linhas celulares humanas usadas neste estudo exigiram autorização regulatória nacional no momento da aquisição. A aprovação foi concedida sob um marco de consórcio no qual um dos autores esteve envolvido. Embora o presente manuscrito não esteja diretamente relacionado a esse projeto do consórcio, os materiais biológicos utilizados foram obtidos e autorizados dentro desse quadro ético. Portanto, a aprovação desta universidade foi devidamente citada para garantir total transparência regulatória. Todos os detalhes relacionados aos materiais, reagentes e equipamentos utilizados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Todos os procedimentos experimentais foram realizados dentro de um gabinete de fluxo laminar (BSL-2) para manter um ambiente estéril. Essa configuração garante que todos os materiais e equipamentos usados no estudo sejam adequadamente esterilizados, minimizando assim o risco de contaminação e garantindo a integridade dos resultados experimentais.

1. Geração de organoides de córnea derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC)

  1. Manutenção e cultura inicial de células-tronco pluripotentes humanas induzidas por pacientes de anirídia (AAK1, AAK2, AAK3)10 sob meios condicionados livres de alimentação (Figura 1)
    1. Prepare o seguinte com antecedência: Revestir um poço em uma placa de 6 poços com 1 mL de uma solução de matriz extracelular (ECM) gelada a uma concentração de 0,1 mg/mL. Esse procedimento de revestimento deve ser feito no gelo, não para solidificar o ECM, e deve ser deixado incubar a 37 °C por uma duração mínima de 30 minutos, seguindo as instruções do fabricante para garantir o preparo adequado do substrato.
    2. Descongelar uma alíquota criopreservada de 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). Não descongele completamente as células congeladas; em vez disso, deixe a suspensão celular congelada no criovial descongelar até que aproximadamente metade do volume permaneça congelada.
    3. Transfira imediatamente a suspensão parcialmente descongelada para 1 mL de meio de manutenção completo em temperatura ambiente (RT) contendo 10 μM inibidor de proteína quinase associada à Rho (ROCK), pré-aliquotado em um tubo de 15 mL. Não use nenhuma pipeta durante a transferência.
    4. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos e descarte o sobrenadante.
    5. Em seguida, ressuspenda as células em 1 mL de meio de manutenção completo contendo 10 μM inibidor de ROCK.
    6. Determine a densidade celular com exclusão do azul de tripano. Conte as células usando um hemocitômetro após a coloração de viabilidade com azul de tripano. Brevemente, misture 20 μL de suspensão de célula 1:1 com 20 μL de azul tripano 0,4%, seguido pela adição de 60 μL de PBS, resultando em uma diluição final 1:5 da suspensão original da célula. Dessa mistura, carregue 10 μL na câmara do hemocitômetro. Conte células viáveis (tripano azul–negativo) em quatro grandes quadrados. Calcule o número médio de células por quadrado e multiplique por 5 (fator de diluição por suspensão celular) e 10.000 para determinar a concentração final da célula (células/mL).
      Células/mL = (Média de células por quadrado) x 5 x 104
    7. Semeie as células em um poço ECM pré-revestido em uma placa de 6 poços, garantindo uma densidade celular de 2 x 104 células/cm 2 por poço.
    8. Observe a morfologia e a fixação celular usando microscopia de contraste de fase com ampliação de 10x. Em seguida, incube as placas de 6 poços a 37 °C com 5% de CO₂ para garantir condições ideais de crescimento.
      NOTA: O inibidor de ROCK deve ser usado apenas durante a noite durante a passagem ou descongelação das células. Durante as trocas diárias de substrato, adicione o meio suavemente ao longo da parede do poço. Evite aquecer o meio de manutenção completo em banho-maria; em vez disso, equilibre o meio em temperatura ambiente por 15 minutos antes do uso.
  2. Fase de diferenciação espontânea (Dia 0 – 2)
    1. Prepare o meio diferenciador (DM) misturando o seguinte: Reposição Sérica KnockOut 8% (KSR), 1x aminoácidos não essenciais (NEAA), 1x Glutamax, 1x Penicilina-Estreptomicina e Mistura Modificada de Médio/Nutrientes F-12 Ham (DMEM/F-12) da Dulbecco's Modified Medium.
    2. Quando as culturas de hiPSC atingem aproximadamente 70%–80% de confluência, para induzir diferenciaçãoespontânea 8, aspire suavemente e descarte completamente o meio, substituindo-o diariamente por 1 mL de DM fresco por poço até o Dia 3, quando a fase de diferenciação retiniana é iniciada conforme o cronograma experimental.
  3. Fase de diferenciação da retina (Dia 3 – 47)
    NOTA: O meio de diferenciação retiniana é usado por períodos prolongados para permitir a formação de populações heterogêneas de progenitores oculares.
    1. Prepare o meio de diferenciação retiniana (RDM) misturando o seguinte: 8% KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2% B27, 1x Penicilina-Estreptomicina e DMEM/F-12.
    2. Após 2 dias de diferenciação espontânea, renove o meio de cultura diariamente, aspirando cuidadosamente o meio DM e substituindo-o por 1 mL de meio RDM fresco por poço. Continue com isso por um total de 30 dias.
      NOTA: Um aumento significativo na densidade celular é esperado durante esse período de 30 dias. É essencial fazer observações microscópicas da densidade celular em diferentes áreas de cada poço. Para evitar o levantamento celular, é preciso evitar lavar a lavagem e tomar cuidado durante as trocas de meio. Adicione a mídia através da parede do poço. Equilibre o meio em RT por 15 minutos antes do uso.
    3. No Dia 32, as células atingem um estado aparente de confluência e formam agregados 2,5D em múltiplas camadas. Nessa etapa, inicie a transição para a cultura por suspensão raspando suavemente todo o poço usando uma ponta de pipeta de 1000 μL. Durante esse processo, fragmente a camada celular em pequenos agrupamentos.
      NOTA: Embora todas as células sejam liberadas da superfície da cultura, agregados 2.5D multicamadas são preferencialmente coletados e transferidos para cultura em suspensão (Figura Suplementar 1), pois seu enriquecimento promove uma automontagem mais rápida e a formação de organoides maiores em comparação com células individuais ou fragmentos monocamadas.
    4. Imediatamente após a raspagem, colete os aglomerados celulares resultantes e transfira-os para placas de cultura de 6 poços de baixa ligação contendo RDM para estabelecer condições de cultivo em suspensão.
    5. Mantenha as células em cultura em suspensão por mais 15 dias, com substituição diária do meio usando 2 mL de RDM fresco por poço. Durante os primeiros 2 dias de cultivo em suspensão, evite a mudança de médio para evitar a perda de pequenos agrupamentos celulares. Durante a cultura em suspensão, as células se autoorganizam gradualmente e dão origem a estruturas 3D, transparentes, semelhantes à córnea, monitoradas regularmente por microscopia de contraste de fase em ampliações 4x e 10x.
  4. Fase de diferenciação corneal (Dia 48 – 90)
    1. Prepare o meio de diferenciação corneal (CDM) misturando o seguinte: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 1x N2-MAX, 1x Insulina-Transferrina-Selênio, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF e DMEM/F-12.
    2. Após os primeiros 15 dias (do Dia 32 ao Dia 47) de cultura de suspensão em placas de baixa fixação (37 °C, 5% CO₂), substitua o RDM por CDM mantendo os agregados sob condições de suspensão no Dia 47. Atualize o CDM dia sim, dia não, com 2 mL por poço, garantindo que os organoides estejam sempre totalmente submersos no meio de cultura. Durante esse período, estruturas primordiais corneanas (CP) transparentes e em forma de bolha emergem progressivamente.
    3. Continuar a cultura em suspensão em CDM até o Dia 90, permitindo uma maturação adicional e segregação espacial de regiões de CP transparentes a partir de compartimentos de tecido mais opacos.
    4. No Dia 90, separe mecanicamente regiões transparentes de CP dos compartimentos de tecido mais opacos usando pinças e pinças esterilizadas quando se pretendem análises específicas de CP a jusante.
      NOTA: O isolamento mecânico das regiões de CP é realizado quando análises exigem especificamente estruturas enriquecidas em CP. Se outros compartimentos de tecido ou arquitetura organoide geral forem de interesse, os organoides podem ser mantidos intactos para preservar a heterogeneidade estrutural.
    5. Continue a cultura em suspensão em CDM para estruturas CP isoladas ou organoides intactos, dependendo do objetivo experimental.

2. Caracterização dos organoides corneanos

  1. Avaliação morfológica e estrutural de organoides
    1. Monitore organoides da córnea regularmente usando microscopia de campo claro em ampliações 4x e 10x. Avalie tamanho, transparência e morfologia geral em pontos de tempo definidos e documente mudanças estruturais por aquisição de imagens.
  2. Caracterização baseada em imunofluorescência
    1. Fixação organoide da córnea
      1. Prepare soluções de 4% de PFA e 30% de sacarose antes da fixação. Pegue o organoide da córnea da cultura com uma colher autoclavada. Transfira o organoide para o PFA de 4% em um tubo de 1,5 mL e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
      2. Após a incubação, descarte cuidadosamente o PFA do tubo sem danificar o organoide da córnea. Adicione 1 mL de solução de sacarose a 30% no tubo e coloque a 4 °C. Após 24 horas, prepare e etiquete tubos de 5 mL e nitrogênio líquido para fixação do OCT.
      3. Descarte cuidadosamente a solução de sacarose do tubo. Transfira o organoide para a colher estéril. Com uma pipeta de 20 μL, remova cuidadosamente o excesso de solução de sacarose do organoide.
      4. Despeje OCT na tampa do tubo de 5 mL e coloque o organoide no OCT. Use outra colher estéril para transferir o organoide para a tampa contendo OCT.
      5. Adicione OCT para cobrir a superfície do organoide da córnea. Coloque os balões no OCT com uma agulha para obter seções claras do organoide.
      6. Feche a tampa dos tubos de 5 mL e use uma pinça para mergulhar no nitrogênio líquido. Armazene as amostras em -20 °C até a secção.
      7. Separe-as com 5 μm de espessura usando um criostato e também armazene-as a -20 °C até a coloração. Mantenha espessura da seção e orientação do tecido consistentes para garantir a coloração reprodutível.
    2. Coloração IF
      1. Para preparar as seções organoides da córnea para coloração de FI, lave as lâminas 3x com PBS-T (0,3% Triton X-100) em RT por 10 minutos.
      2. Limpe o slide com papel de seda e faça uma borda com caneta PAP. Adicione uma quantidade adequada de solução bloqueante para cobrir completamente a seção do tecido (tipicamente 100 a 200 μL por lâmina, dependendo da fronteira da caneta PAP) e incube em RT por 1 hora.
      3. Aspire a solução bloqueante e faça uma borda com a caneta PAP. Adicione os 150 μl de soluções primárias de Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, as taxas de diluição estão listadas na Tabela de Materiais) na lâmina e incube-a em RT por 1 hora.
      4. Lave 2x com PBS-T (0,3% Triton X-100) na hora de descanso por 10 minutos. Faça a borda novamente com uma caneta PAP.
      5. Adicione os 150 μl de solução secundária de Ab (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, as taxas de diluição estão listadas na Tabela de Materiais) na lâmina e incube-a em RT em condições escuras por 2 horas. Lave 2x com PBS-T (0,3% Triton-X) em RT por 10 minutos. Limpe os ferrolhos e monte com solução DAPI.
      6. Para iPSCs indiferenciados, realize bloqueio e permeabilização após a fixação e prossiga com a coloração usando o mesmo protocolo. Visualize amostras coradas usando microscopia de fluorescência ou confocal em ampliações 4x e 10x.

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Resultados

Estalo das células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs)

Para avaliar a gravidade dos iPSCs humanos usados nos experimentos, realizamos imagens em campo claro, imunocoloração e análise qRT-PCR. Avaliamos a expressão de marcadores de pluripotência chave, incluindo OCT3/4, SOX2 e NANOG, que são fatores de transcrição essenciais para a manutenção da pluripotência e autorrenovação em células-tronco pluripotentes

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Discussão

A análise comparativa entre organoides controle e aqueles derivados de pacientes com anirídios revela defeitos na estratificação epitelial, deposição anómala da matriz extracelular e expressão desregulada do genePAX6 9.

A taxa de crescimento dos iPSCs derivados de diferentes amostras de pacientes com anirídia, especificamente linhas AAK1, AAK2 e AAK3, apresenta variabilidade, potencialmente refletindo a diversidade genética sub...

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Divulgações

Os autores não divulgaram.

Agradecimentos

Este estudo é financiado pelo TÜBİTAK 121N276 e pelo Programa Conjunto Europeu sobre Doenças Raras, e parcialmente apoiado pela União Europeia (Programa de Cátedra Horizon 2020 ERA, Bolsa do Projeto RareBoost nº: 952346). A A.C.K. é apoiada pela bolsa de doutorado YÖK 100/2000 e pelas bolsas TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150Dilution Range: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152Dilution Range: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010with vitamin A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol dilutions
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566Dilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APDilution Range: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLDilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057Dilution Range: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586Dilution Range: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054RDilution Range: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268Dilution Range: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576Dilution Range: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55AAdhesive, ground
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

Referências

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