Fluxo de trabalho otimizado para isolamento e cultura de longo prazo de células de glioma derivadas de pacientes que retêm as características originais do tumor

Resumo

Este estudo apresenta um protocolo padronizado para o estabelecimento de linhagens celulares de glioma derivadas de pacientes (PDGCs), garantindo sua fidelidade genética e fenotípica. O sistema de cultura aderente assistida por extrato de matriz de membrana basal aumenta o crescimento e a homogeneidade celular, tornando esses modelos valiosos para triagem de drogas e pesquisa de GBM.

Resumo

O glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais agressivo, caracterizado por alta heterogeneidade e resistência às terapias padrão. As linhagens celulares de glioma tradicionais muitas vezes não conseguem reter características genéticas e fenotípicas específicas do paciente, limitando sua relevância translacional. Para resolver isso, estabelecemos 50 linhagens celulares de glioma derivadas de pacientes (PDGCs) usando um sistema de cultura de células-tronco neurais sem soro. Este protocolo descreve a coleta, processamento e cultura de longo prazo de amostras tumorais obtidas de pacientes com GBM, garantindo a preservação das principais características moleculares. Nossa metodologia inclui dissociação enzimática de tecidos, lise de glóbulos vermelhos e cultura aderente assistida por extrato de matriz de membrana basal, o que melhora a viabilidade celular e facilita a triagem de medicamentos de alto rendimento. A caracterização de PDGCs por meio de sequenciamento do genoma completo e transcriptômico e coloração por imunofluorescência confirma sua retenção de alterações genéticas comuns de GBM e marcadores de células-tronco neurais e progenitores. Além disso, essas células exibem potencial tumorigênico em modelos de xenoenxerto. Ao otimizar as condições de cultura, este protocolo fornece uma estrutura padronizada para gerar modelos de GBM biologicamente relevantes para apoiar a descoberta terapêutica e estudos mecanísticos.

Introdução

O glioma, o tumor intracraniano primário mais comum, origina-se de células-tronco neurais ou progenitoras que sofreram mutações genéticas¹. A Organização Mundial da Saúde classifica os gliomas em graus 1-4 com base em características patológicas e moleculares, variando de baixo grau a alto grau². O glioblastoma (GBM), um glioma de grau 4, representa aproximadamente 57% de todos os gliomas e 48% de todos os tumores malignos primários do sistema nervoso central³. Os pacientes com GBM enfrentam um prognóstico ruim, com um tempo médio de sobrevida inferior a 2 anos e uma taxa de sobrevida de 5 anos de apenas 5,4%⁴. O tratamento padrão envolve ressecção segura máxima seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida⁵. Apesar dessas intervenções, o GBM permanece incurável devido à sua natureza infiltrativa e resistência inerente às terapias, criando uma necessidade urgente de novas abordagens de tratamento.

Os pesquisadores geralmente usam linhagens de células tumorais derivadas de humanos como modelos para estudar o desenvolvimento do câncer e os mecanismos terapêuticos. No entanto, linhagens celulares de glioma clássico mantidas em meio contendo soro e passadas extensivamente in vitro exibem alterações significativas nas características fenotípicas e perfis genéticos em comparação com tumores de pacientes ^6,7,8. Consequentemente, os modelos de triagem pré-clínica baseados nessas linhagens celulares muitas vezes falham em identificar alvos terapêuticos e moléculas que se traduzem efetivamente em ambientes clínicos. O sucesso do tratamento com GBM é ainda mais complicado pela heterogeneidade e plasticidade do tumor⁹. Essa heterogeneidade se manifesta não apenas nos subtipos transcriptômicos (por exemplo, proneural, mesenquimal), mas também nos diversos estados de desenvolvimento das células constituintes¹⁰. O GBM emprega mecanismos de neurodesenvolvimento e contém subpopulações de células-tronco de glioblastoma (GSC) que impulsionam a proliferação tumoral e exibem maior resistência à radioterapia e quimioterapia^11,12. A cultura de células de glioma derivadas do paciente em meio de células-tronco neurais sem soro preserva efetivamente o espectro de mutação e os padrões de expressão gênica do tumor original, mantendo as características parciais do GSC⁸.

Em comparação com os modelos de cultura de neuroesferas, a cultura aderente assistida por extrato de matriz de membrana basal promove um crescimento celular mais estável e rápido, tornando-a mais adequada para triagem química e genética¹³. Usando essa abordagem, estabelecemos 50 linhagens celulares de GBM derivadas de pacientes e as caracterizamos por meio de sequenciamento de genoma completo, sequenciamento transcriptômico e triagem de biblioteca de medicamentos da FDA para explorar possíveis estratégias terapêuticas. Este recurso avança na pesquisa de gliomas, com resultados detalhados publicados em nossos estudos anteriores¹⁴. Aqui, descrevemos a metodologia usada para desenvolver linhagens celulares de glioma derivadas de pacientes (PDGCs).

Protocolo

Este protocolo utiliza amostras de tecido e sangue de glioma derivado do paciente obtidas por meio de colaborações hospitalares. Todos os procedimentos de amostragem e protocolos experimentais receberam aprovação do Comitê de Ética do Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (KY 2020-093-02 e KY 2014-021-02). Os pacientes fornecem consentimento informado assinado antes da cirurgia, e todas as informações de identidade passam por anonimização antes que as amostras sejam transferidas para o laboratório. Os pesquisadores devem obter a aprovação de seu comitê de ética institucional e obter o consentimento do paciente antes de implementar este protocolo.

1. Preparação antes do processamento da amostra

1. Esterilize tesouras, pinças e outros instrumentos em autoclavagem.
2. Prepare o meio de cultura PDGC combinando 47,5 mL de DMEM/F12, 500 μL de N2, 1 mL de B27, 500 μL de 100x Penicilina/Estreptomicina, 250 μL de 100x substituto de glutamina, 100 μL de HEPES 2,5 M, 100 μL de glicose a 30%, 50 μL de β-mercaptoetanol 50 mM, 1,5 mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) 1 μg/mL, e 1,5 mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) 1 μg/mL.
3. Prepare 1x tampão de lise de glóbulos vermelhos (ACK) dissolvendo 8,29 g de cloreto de amônio, 1 g de bicarbonato de potássio e 37 mg de EDTA em água e, em seguida, diluindo para 1 L.
4. Coloque instrumentos esterilizados, tampão PBS, recipientes de resíduos, tubos de centrífuga e outros suprimentos em um gabinete de biossegurança e realize a desinfecção UV por 30 min.
5. Coloque o nitrogênio líquido em um recipiente isolado.

2. Coleta de amostras de pacientes

NOTA: Realize todos os procedimentos de coleta de tecidos sob condições estéreis estritas para evitar a contaminação bacteriana das culturas de células subsequentes. Mantenha a técnica asséptica durante todo o fluxo de trabalho.

1. Colete amostras de sangue no pré-operatório e extirpe o tecido tumoral do cérebro do paciente. Para tumores grandes e altamente infiltrativos, onde é difícil distinguir o tumor do tecido normal circundante, maximize a ressecção do tecido peritumoral, preservando as áreas cerebrais funcionais críticas. Separe aproximadamente 500-2.000 mm³ do tecido central do tumor e coloque em tubos de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de meio de preservação hipotérmico.
2. Feche os tubos de amostra, coloque-os em uma caixa de gelo e transporte-os rapidamente para o laboratório para processamento.
   NOTA: Certifique-se de que o intervalo entre a coleta e o processamento da amostra não exceda 6 h a 4 °C. Durante a coleta da amostra, exclua cuidadosamente o tecido queimado e as áreas de necrose tumoral. A superfície das incisões teciduais é frequentemente queimada pela faca elétrica usada durante a cirurgia, o que pode comprometer a viabilidade celular na cultura.

3. Processamento de amostras de sangue

1. Centrifugue tubos de amostra de sangue a 1.000 × g por 10 min e descarte a camada superior de plasma.
2. Transfira os glóbulos brancos restantes e a camada de glóbulos vermelhos para um tubo de centrífuga de 50 mL. Adicione 10 mL de 1x ACK e incube em temperatura ambiente por 5 min para lisar os glóbulos vermelhos.
3. Adicione 40 mL de PBS para interromper a lise, misture delicadamente e centrifugue a 1.000 × g por 10 min.
4. Descarte o sobrenadante, adicione 3 mL de 1x ACK e incube em temperatura ambiente por 5 min para uma segunda etapa de lise dos glóbulos vermelhos.
5. Adicione 12 mL de PBS para interromper a lise, misture delicadamente e centrifugue a 1.000 × g por 10 min.
6. Descarte o sobrenadante, ressuspenda o pellet de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em 1 mL de PBS, transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 510 × g por 10 min.
7. Rejeitar o sobrenadante, congelar o pellet PBMC em azoto líquido e conservar a -80 °C.

4. Processamento de tecido tumoral

1. Remova a solução de preservação de tecido do tubo de amostra e lave o tecido em PBS para remover coágulos sanguíneos visíveis e tecido necrótico. Faça uma segunda lavagem de PBS no tecido restante.
2. Corte a porção de tecido mais intacta e fixe durante a noite em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 ° C.
   NOTA: O tamanho do tecido fixado é de aproximadamente 10 mm. Ignore esta etapa se a amostra for pequena.
3. Corte 2-4 pequenos pedaços de tecido, transfira para um tubo de centrífuga de 1,5 mL, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C.
   NOTA: O tamanho de pequenos pedaços de tecido normalmente varia de 5 a 10 mm, dependendo da quantidade de DNA e RNA necessária para o sequenciamento.
4. Coloque o tecido tumoral restante em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e pique em uma pasta fina usando uma tesoura, mantendo o gelo.
5. Adicione 1-3 mL de solução de descolamento celular e transfira o tecido picado para o tubo de digestão. Digerir o tecido utilizando um dissociador de tecidos a 37 °C durante 16 min.
6. Adicione 3x o volume de PBS para interromper a digestão e transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga com um filtro de células de 70 μm. Moa suavemente o tecido através do filtro com uma pequena haste para maximizar a coleta de células. Centrifugar a 510 × g durante 10 min e retirar o sobrenadante.
7. Adicione 1-3 mL de 1x ACK e incube em temperatura ambiente por 5 min para lisar os glóbulos vermelhos. Adicione 4x o volume de PBS para interromper a lise, misture delicadamente e centrifugue a 510 × g por 10 min para remover o sobrenadante.
8. Ressuspenda as células em meio PDGC e semeie parte da suspensão celular em placas de cultura. Colocar as placas numa incubadora hipóxica a 37 °C. Congele as células restantes em meio de cultura contendo 10% de DMSO.
   NOTA: Normalmente, para amostras de tecido medindo aproximadamente 10-20 mm, semeamos cerca de 1/3 a 1/10 da suspensão celular em um prato de 6 cm com 3 mL de meio de cultura, e as células restantes são criopreservadas em 2-4 frascos, dependendo do rendimento celular.
9. Revestir as placas adicionando extrato de matriz de membrana basal ao PBS gelado na proporção de 1:100 e incubar as placas à temperatura ambiente em uma incubadora agitada por 2 h. Descarte o PBS antes de adicionar o meio de cultura PDGC.
   NOTA: Execute todas as passagens e culturas celulares subsequentes usando placas revestidas com extrato de matriz de membrana basal.
10. Após 2 dias, transfira as células cultivadas para placas revestidas com extrato de matriz de membrana basal para permitir a adesão e o crescimento celular.

5. Cultura e passagem de células

1. Assim que as células aderirem às placas de cultura, remova as células não aderentes e substitua ou complemente o meio de cultura a cada 2-3 dias.
   NOTA: A capacidade de adesão varia entre as diferentes células. Mesmo na presença de extrato de matriz de membrana basal, uma pequena fração de células pode permanecer não aderente, como o BNI7-11, que requer cultura contínua em suspensão. Além disso, algumas células exibem um padrão de crescimento semi-aderente, como o BNI20. Portanto, a observação cuidadosa do estado celular é essencial. Para células não aderentes, pode-se notar um aumento nas células suspensas. Se os agregados celulares aparecerem como estruturas escuras semelhantes a algodão e não mostrarem mudanças significativas ao longo do tempo, eles normalmente são incapazes de expansão a longo prazo.
2. Quando as células atingirem a confluência, adicione uma solução de dissociação celular para separar as células. Termine a dissociação com 3x PBS e centrifugue a 250 × g por 3 min. Passe as células na proporção de 1:2 a 1:4. Congele as células restantes em meio de cultura contendo 10% de DMSO.
3. Continue passando por pelo menos 10-20 gerações para estabelecer uma linha celular estável.
   1. Documente a morfologia celular com imagens durante cada passagem e registre os números das passagens. Rotule claramente o congelamento inicial da célula com informações detalhadas (por exemplo, números de passagem).
   2. Assim que a linhagem celular se estabilizar, colete 2-3 tubos de pellets celulares (300.000-1.000.000 células/tubo) e armazene a -80 °C.

6. Operações experimentais subsequentes

1. Para amostras fixadas em PFA, após fixação durante a noite, desidratar as amostras por meio de uma série graduada de soluções de etanol por imersão sequencial em etanol a 60%, etanol a 70%, etanol a 80%, etanol a 90%, etanol a 95% e duas trocas de etanol a 100%, cada uma por 40 min. Em seguida, limpar as amostras em duas trocas de xileno, cada uma por 40 min, e depois infiltrar com duas trocas de solução de parafina, cada uma por 40 min. Por fim, incorpore as amostras desidratadas e infiltradas em blocos de parafina para posterior seccionamento e coloração¹⁵.
2. Para pellets PBMC, tecido tumoral ou amostras de células tumorais armazenadas a -80 °C, extraia DNA e RNA para vários estudos ômicos, incluindo sequenciamento do genoma completo, sequenciamento do exoma, sequenciamento de RNA em massa e sequenciamento de RNA de célula única, conforme necessário.
3. Use linhagens celulares PDGC estáveis para o estabelecimento de modelos de xenoenxerto de camundongo, triagem de drogas de alto rendimento, pesquisa de mecanismos e outros experimentos relacionados.
   1. Para estabelecer o modelo de xenoenxerto ortotópico intracraniano de PDGCs, dissocie e conte as células e, em seguida, ressuspenda-as em uma mistura 1:1 de extrato de matriz de membrana basal e PBS gelado até uma concentração final de 100.000 células/μL. Injete 5 μL da suspensão celular estereotaxialmente no estriado esquerdo de camundongos imunodeficientes de 6 a 8 semanas de idade usando uma microsseringa e um instrumento estereotáxico padrão. Defina as coordenadas de injeção em relação ao bregma da seguinte forma: +0,5 mm ântero-posterior (AP), -1,9 mm médio-lateral (ML) e -3,6 mm dorsal-ventral (DV).
   2. Gerar PDGCs que expressam luciferase e estabelecer xenoenxertos intracranianos para imagens de bioluminescência do crescimento tumoral.
      1. Empacote o gene repórter luciferase-tdTomato em partículas lentivirais e, em seguida, infecte PDGCs com o lentivírus empacotado para estabelecer uma expressão estável¹⁶.
      2. Após a infecção, classifique as células tdTomate positivo por citometria de fluxo para obter uma população celular estável expressando luciferase.
      3. Antes da imagem, injete D-luciferina por via intraperitoneal na dose de 10 μL / g de peso corporal usando uma solução de D-luciferina de 15 mg / mL. Anestesiar os camundongos com isoflurano e aguardar 10 minutos após a injeção de D-luciferina. Coloque os camundongos no sistema de imagem de bioluminescência. Defina o tempo de exposição para o modo automático durante a imagem¹⁷.

Resultados

A Figura 1 fornece uma visão geral abrangente do fluxo de trabalho do protocolo. As amostras de pacientes incluem sangue periférico e tecido central do tumor. As amostras de sangue são submetidas a centrifugação para remoção de plasma, seguida de duas rodadas de lise de ACK para obtenção de PBMCs que servem como controles para análises de sequenciamento. As amostras de tumor são lavadas com PBS para remover coágulos sanguíneos e áreas necróticas antes de serem processadas em pequenos fragmen...

Discussão

A heterogeneidade do GBM apresenta desafios significativos de tratamento. As linhagens celulares convencionais de GBM geralmente desenvolvem fundos genéticos homogêneos e perdem as características do tumor do paciente após uma cultura prolongada em meio contendo soro, limitando seu valor translacional. Otimizar as condições da cultura de GBM e padronizar os fluxos de trabalho de processamento de amostras de pacientes são essenciais para maximizar os recursos clínicos limitados em pesquis...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
70 μ filtro de células m	Falcon	352350
Solução de desprendimento de células Accutase	BioLegend	423201
Cloreto de amônio	Aladdin	60-92-4
Anticorpo anti-Sox2	Merckmillipore	AB5603
Meio de montagem antidesbotamento com DAPI	Beyotime	P0131
Anticorpo anti-Nestin	NOVUS	NB100-1604
B27 sem suplemento vitamínico	Gibco	12587010
BD FACSAria Citômetro de fluxo de fusão	BD Biosciences	/
placa de cultura de células	NEST	705001
D-Luciferina, sal de potássio	Invitrogen	L2916
DMEM / F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glicose	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	substituto de glutamina
Kit de coloração de hematoxilina-eosina	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Humano bFGF	Origene	TP750002
Novoproteína Humana EGF		C029-500μ g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	meio de preservação hipotérmica
Isoflurano	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	bioluminescência
Matrigel	Corning	356231	extrato de matriz de membrana basal
Microseringa	Suplemento Hamilton	80300
N2 Gibco		17502048
Nunclon Sphera Placa de 6 poços	de	fixação ultrabaixa	Thermo Scientific
Paraformaldeído	Sangon Biotech	A500684-0500
PBS tampão	Solarbio	P1010-100 * 2L
Penicilina / Estreptomicina	Solarbio	P8420 / S8290
Bicarbonato de potássio	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD dissociador de tecido	RWD Life Science	DSC-410
Instrumento estereotáxico padrão	RWD Life Science	68801
Tubo de processamento de amostras de tecido	RWD Life Science	SCT-100
β-mercaptoetanol	Sigma	M3148-100mL