Artigo de método

Caracterização por imagem ao vivo dos movimentos do centrômero durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana

DOI:

10.3791/68569

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24 de outubro de 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

Neste artigo

Resumo

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O movimento cromossômico durante a prófase meiótica é um fenômeno pouco compreendido que é fundamental para a formação de esporos. Este protocolo descreve um método para adquirir, analisar e quantificar os movimentos do centrômero durante a prófase meiótica em meiócitos masculinos de Arabidopsis thaliana .

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A meiose é uma divisão celular, essencial para a reprodução sexuada. Durante a prófase meiótica, os cromossomos homólogos de origem materna e paterna se reconhecem e se associam, processo que é facilitado por seus movimentos rápidos no nucleoplasma. Os movimentos meióticos da prófase dependem da ligação dos cromossomos ao envelope nuclear e das forças citoplasmáticas transmitidas aos cromossomos através do envelope nuclear. Nas plantas, a acessibilidade limitada e a fragilidade dos meiócitos masculinos dentro das anteras tornam as abordagens de imagem ao vivo e a análise do movimento cromossômico tecnicamente desafiadoras. De fato, esses movimentos são muito rápidos e analisá-los requer encontrar as condições ideais de aquisição. Aqui, um método eficiente para capturar movimentos cromossômicos rápidos durante a prófase meiótica masculina em Arabidopsis thaliana é descrito, em filmes de lapso de tempo, seguindo os movimentos de centrômeros marcados com fluorescência. Baseia-se na dissecção de antera e aquisição de imagens por meio de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), em 3D e ao longo do tempo. A aquisição de pilhas z meióticas a cada 7 s permite resolução suficiente para reconstruir e analisar as trajetórias dos centrômeros marcados. Os dados extraídos são posteriormente processados, permitindo a análise quantitativa desses movimentos cromossômicos. O desenvolvimento de modelos a partir desses dados é essencial para entender o mecanismo do movimento cromossômico rápido, incluindo a natureza e a intensidade das forças que impulsionam esse processo.

Introdução

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A meiose é um processo biológico fundamental que garante a transmissão fiel do material genético de uma geração para a seguinte. O processo de meiose é dividido em duas rodadas sucessivas de divisão celular, meiose I e meiose II. A meiose I é precedida por uma longa prófase durante a qual os cromossomos homólogos se reconhecem e se emparelham. Durante essa prófase estendida, ocorrem vários processos biológicos. Além do emparelhamento de cromossomos homólogos, esses cromossomos também passam por um processo chamado sinapse. A sinapse envolve a formação de um complexo proteico conhecido como complexo sinaptonêmico, que conecta os cromossomos homólogos ao longo de seu comprimento. O complexo sinaptonêmico promove recombinação homóloga, seguida pela troca de material genético entre cromossomos homólogos e formação de cruzamentos. Estes estabelecem uma conexão física entre cromossomos homólogos, facilitando seu alinhamento adequado e segregação equilibrada 1,2.

Durante o reconhecimento cromossômico homólogo, sabe-se que os movimentos cromossômicos rápidos da prófase (RPMs) desempenham um papel crucial. Estudos realizados em várias espécies modelo mostraram que, durante o leptoteno, os cromossomos se ligam ao envelope nuclear (NE). Eles estão conectados ao citoesqueleto citoplasmático através do NE, através do complexo proteico LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton)3. As forças geradas no citoplasma são transmitidas aos cromossomos através do complexo LINC, permitindo o movimento cromossômico.

O estudo dos RPMs é essencial para a compreensão dos mecanismos fundamentais da meiose, particularmente aqueles envolvidos no reconhecimento de cromossomos homólogos. No entanto, estudar esses movimentos requer experimentos específicos de imagens ao vivo. A maioria dos estudos de imagem ao vivo em A. thaliana se concentra em tecidos somáticos e órgãos vegetativos. Esses estudos foram conduzidos para determinar como as células dão origem aos órgãos4. Tais estudos foram conduzidos em meristemas5e raízes6. Recentemente, algumas equipes desenvolveram técnicas para observar o desenvolvimento floral, incluindo a meiose, em tempo real em A. thaliana durante períodos de vários dias 7,8. No entanto, esses protocolos também podem ser exigentes e difíceis de configurar para um grande número de amostras.

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para imagens de células vivas e análise da dinâmica cromossômica durante a meiose em A. thaliana. Através do uso de microscopia confocal, uma técnica simples para preparação de amostras, em conjunto com a marcação fluorescente dos cromossomos, o movimento cromossômico foi capturado com alta resolução espacial e temporal em curtos períodos de tempo. O protocolo descreve a preparação do tecido vegetal para imagens, a otimização dos parâmetros de imagem para minimizar a fototoxicidade e maximizar a qualidade da imagem, bem como o processamento de imagens e análise de dados. Este método permite a quantificação precisa da dinâmica do centrômero durante a meiose, o que é crucial para entender o comportamento cromossômico subjacente à formação bem-sucedida de gametas. Esse conhecimento tem implicações diretas para a agricultura, particularmente na melhoria dos programas de melhoramento de culturas, facilitando o estudo dos processos de emparelhamento e recombinação cromossômica que afetam a fertilidade e a diversidade genética.

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Protocolo

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Este protocolo utiliza plantas transgênicas de A. thaliana expressando os transgenes GFP-CENH3 e NUP54-RFP 9,10. O marcador CENH3 permite rastrear o movimento dos centrômeros. O marcador NUP54 marca os poros nucleares e, assim, ajuda a distinguir o núcleo. Outros marcadores podem ser usados, mas estes devem ser resistentes ao fotobranqueamento, pois a amostra é continuamente iluminada. Para garantir que o marcador não seja submetido a fotobranqueamento, realize o experimento sob as mesmas condições de laser e parâmetros de aquisição e verifique se o sinal permanece estável durante a aquisição da imagem. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Crescimento e cultura de plantas

  1. Semeie as sementes diretamente em vasos na estufa.
  2. Coloque os vasos em uma estufa nas seguintes condições: 16 h dia/8 h noite, 20 °C, 70% de umidade.
  3. Deixe as plantas se desenvolverem na estufa por aproximadamente 4 semanas. As plantas devem atingir um estágio em que tenham 5/6 hastes de flores (ver Figura 1A).

2. Dissecando anteras e preparando a lâmina

  1. Prepare uma lâmina de vidro, coloque um espaçador (adesivo dupla face com perfuração de 9 mm de diâmetro, 0,12 mm de profundidade) no centro, tendo o cuidado de remover as películas protetoras de cada lado. Este espaçador irá segurar a amostra e criar espaço entre a lâmina e a lamínula.
  2. Deposite 8 μL de água da torneira no centro do espaçador.
  3. Usando uma pinça, pegue uma inflorescência de uma das hastes principais (veja a Figura 1B) (não use inflorescências pequenas das hastes emergentes).
  4. Coloque a inflorescência em uma nova lâmina sob um estereomicroscópio equipado com uma régua. Selecione botões florais com aproximadamente 0,5 mm de comprimento (Figura 1C).
  5. Usando agulhas afiadas, abra suavemente os botões, separando as sépalas e pétalas para manter apenas as anteras. Tome cuidado para não danificar as anteras nem deixá-las secar.
  6. Transfira delicadamente os cachos de antera para a água na cavidade espaçadora. Para evitar a desidratação, faça isso imediatamente após remover as sépalas e pétalas.
  7. Deposite vários cachos de antera dentro da cavidade espaçadora.
  8. Cubra a lâmina com uma lamínula, evitando bolhas de ar. Para fazer isso, adicione 8 μL de água em uma lamínula e vire cuidadosamente a lamínula com a gota de água na cavidade espaçadora. Certifique-se de que os cachos de antera estejam imersos em um total de 16 μL de água e que a lamínula esteja bem colada ao espaçador (ver Figura 1D; Figura 2).

3. Observação de lapso de tempo de microscopia confocal – Configuração de imagem

NOTA: A maneira de configurar os parâmetros de imagem depende do sistema confocal usado. Para obter mais considerações sobre os parâmetros de imagem, consulte a seção Discussão . As imagens foram adquiridas usando CLSM e uma lente de imersão em água de 20x. O uso de uma objetiva de imersão em água fornece uma melhor correspondência do índice de refração, pois a amostra biológica é montada em água.

  1. Configure o microscópio excitando o GFP a 488 nm e detectando-o com um detector híbrido entre 494 nm e 547 nm.
    NOTA: O ganho de deslocamento do detector híbrido foi definido como 100. O RFP é excitado a 561 nm e detectado com um detector híbrido entre 584 e 629 nm. O ganho de deslocamento do detector híbrido foi definido como 130. A velocidade de varredura é de 400 Hz e a varredura é bidirecional. Uma média de linha de 2 é aplicada. Os dois canais foram adquiridos simultaneamente para minimizar o tempo de aquisição. A potência do laser foi ajustada para 15% para o laser de 488 nm e 30% para o laser de 561 nm.
  2. Localize a antera usando iluminação de campo claro.
  3. Usando o canal de campo claro, determine o estágio meiótico com base na forma das células.
    NOTA: Os estágios de zigoteno ou paquiteno são necessários para observar RPMs. A variação do foco ao longo do eixo Z permite a estimativa da forma 3D da célula. No estágio de leptoteno, os meiócitos exibem uma forma distintamente quadrada e o nucléolo é posicionado no centro do núcleo, tornando-os facilmente identificáveis. Durante os estágios de zigoteno e paquiteno, os meiócitos começam a adotar uma forma trapezoidal e o nucléolo migra em direção ao envelope nuclear. No estágio de diploteno, os meiócitos exibem uma morfologia totalmentearredondada 10.
  4. Visualize a antera no software. O sinal RFP também é um bom indicador do estágio meiótico das células.
    NOTA: Os meiócitos no estágio zigoteno / paquiteno exibem marcação NUP54 em forma de meia-lua, correspondendo a um agrupamento de poros nucleares em um território restrito do NE nesses estágios ( Figura 3A ). Se necessário, gire a antera para que ela fique localizada horizontalmente (veja a Figura 3).
  5. Defina um tamanho de imagem de 400 px por 150 px, com um zoom digital de 4, centralizando a antera na imagem.
  6. Defina a espessura da amostra a ser fotografada para obter o maior número possível de meiócitos intactos. No entanto, é importante limitar o número de z-slices para minimizar o tempo de aquisição. Para uma espessura de 15 μm, são feitas 16 fatias em Z. As pilhas Z foram adquiridas com um tamanho de passo de 1,04 μm.
  7. Para realizar aquisições contínuas, defina o intervalo de tempo como zero na seção de tempo . Com o microscópio e os parâmetros descritos acima, o tempo de aquisição para 16 fatias é de cerca de 6 a 8 s. A duração mínima de aquisição é de 2 min, mas pode ir até 20 min.
  8. Inicie a aquisição.

4. Análise de imagem – Rastreamento de movimento do centrômero

NOTA: A reconstrução dos movimentos do centrômero requer um software de análise de imagem capaz de rastrear o movimento 3D. O software atribuirá um objeto a um sinal fluorescente, com base nos parâmetros definidos, em cada momento de aquisição. Em seguida, a ferramenta de rastreamento analisa automaticamente os objetos em movimento e cria um gráfico de linhagem.

  1. Pré-processamento de imagem
    1. Para facilitar a análise dos movimentos, realize o processamento de imagens pós-aquisição. Por exemplo, um processo de extração de informações adaptativas (algoritmo de deconvolução) pode ser usado para revelar estruturas e detalhes finos e melhorar a qualidade da imagem.
  2. Rastreamento global de centrômeros
    1. Rastreie todos os centrômeros da imagem: use um módulo de ponto para rastrear automaticamente os pontos (ao longo do tempo).
    2. Escolha o canal de origem, verde neste caso. Indicar o diâmetro XY, 1 μm, para o centrómero marcado com GFP-CENH3. A detecção de objetos identifica todos os objetos na imagem (Figura 3B).
    3. Modifique a qualidade da detecção com base na intensidade do sinal usando o gráfico na parte inferior da janela de controle.
    4. Use um algoritmo de rastreamento de movimento auto-regressivo para traçar as trajetórias (Figura 3C). A visualização de todas as trajetórias facilita a identificação de meiócitos de tecidos somáticos (Vídeo 1).
  3. Rastreando centrômeros em um único meiócito
    NOTA: Usando um software de visualização 3D, verifique os núcleos e as trajetórias e analise apenas os núcleos que estão intactos e não foram cortados em nenhum ponto durante a aquisição. A análise de um meiócito aparado resulta em dados errôneos.
    1. Rastreamento automático de centrômero
      NOTA: Ao analisar um único núcleo, o processo é reiniciado desde o início.
      1. Use o módulo spot para rastrear pontos (ao longo do tempo) no núcleo selecionado, definindo uma Região de Interesse (ROI) correspondente usando a opção Segmentar apenas uma Região de Interesse e rastrear pontos (ao longo do tempo).
      2. Selecione um ROI que inclua adequadamente o núcleo em todas as três dimensões e ao longo do tempo. (Figura 4A).
      3. Use os mesmos parâmetros de toda a antera para detecção de centrômero (Figura 4B) e rastreamento (Figura 4C).
      4. Em um gráfico de linhagem (Figura 4F), todas as trajetórias são indicadas. As trajetórias fora do meiócito analisado podem ser removidas (Figura 4C). Selecione as faixas e exclua-as usando a tecla Delete no teclado. Eles podem ser facilmente identificados usando o visualizador 3D do software.
    2. Correção manual de rastreamento de centrômero
      NOTA: Na maioria dos casos, as trajetórias precisam ser corrigidas manualmente porque o software de rastreamento não consegue diferenciar entre centrômeros que estão muito próximos uns dos outros.
      1. Use o modo Editar para excluir ou adicionar um objeto. Certifique-se de que o objeto seja adicionado no plano correto.
      2. Conecte manualmente os novos objetos no modo Editar trilhas usando o gráfico de linhagem, após uma análise pessoal cuidadosa e completa da célula em 3D. A Figura 4E,G mostra as trajetórias corrigidas na imagem do meiócito e no gráfico linear, respectivamente. O vídeo 2 mostra as trajetórias de um meiócito após a correção.
      3. Exportando dados
        1. Exporte os dados de rastreamento para um formato de programa de planilha para facilitar o processamento e a análise de dados. Esses arquivos contêm tabelas de medição resultantes do rastreamento realizado com o software.
        2. Certifique-se de que o arquivo de planilha exportado contenha as seguintes variáveis: Tempo, que registra o ponto de tempo de cada medição; ID da faixa, que identifica exclusivamente cada faixa; Deslocamento Delta X, Y, Z, que representa a mudança de posição em três dimensões em cada ponto de tempo; e Posição X, Y, Z, que armazena a posição absoluta de cada objeto no espaço.

5. Análise dos dados

NOTA: Esta parte descreve o fluxo de trabalho de análise de dados usando scripts R11 executados no RStudio12. Eles podem ser recuperados do repositório Data INRAE em: 10.57745/V1NNFI. Todas as figuras são geradas usando ggplot213 para visualizar as métricas computadas. Os scripts executam sequencialmente as seguintes etapas: O meiomove-sub-config. O script R é executado primeiro para inicializar o ambiente R, carregar as bibliotecas necessárias e definir variáveis globais. O link para o script é: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Leitura e seleção de dados
    NOTA: O script a ser usado é armazenado como: meiomove-sub-loader.R."
    1. Reúna todos os arquivos individuais do Excel contendo dados de rastreamento e mescle-os em um único arquivo consolidado.
    2. Salve o arquivo mesclado no formato TSV (valores separados por tabulação) para garantir a compatibilidade com outras etapas de processamento de dados.
    3. Calcule as posições x, y, z acumulando os valores de deslocamento ao longo do tempo, garantindo que a trajetória espacial de cada objeto rastreado seja reconstruída com precisão. Isso foi feito para compensar um bug no software que exportava posições XYZ incorretas.
  2. Limpeza de dados
    NOTA: O script a ser usado é armazenado como: meiomove-sub-clean.R."
    1. Remova as trilhas curtas, definidas como aquelas com duração mínima de 50 s. Essas trilhas não contêm pontos de dados suficientes para uma análise significativa, pois podem introduzir ruído ou imprecisões.
    2. Identifique e exclua trilhas onde a posição (X, Y, Z) permanece constante ao longo do tempo, pois elas indicam artefatos ou estruturas estáticas que não são relevantes para a análise.
    3. Filtre os valores de deslocamento ausentes (entradas NA) para garantir a integridade dos dados e evitar erros computacionais em etapas posteriores.
    4. Detecte e exclua trilhas onde os valores de deslocamento obtidos do software de análise de imagem diferem significativamente daqueles recalculados, garantindo consistência e confiabilidade nos dados de rastreamento.
  3. Corrigindo o desvio celular meiótico
    NOTA: O script a ser usado também é armazenado como: meiomove-sub-clean.R."
    1. Considere a possível deriva durante a aquisição, distinguindo entre centrômeros meióticos e somáticos. Esta etapa garante que os movimentos observados correspondam a processos biológicos e não a artefatos experimentais.
    2. Aplique a correção de desvio ajustando as posições das células meióticas em relação às células somáticas, que servem como uma referência estável.
  4. Geração de saída
    NOTA: O script a ser usado é armazenado como: meiomove-sub-metrics.R."
    1. Calcule a velocidade instantânea em cada passo de tempo para rastrear variações na velocidade de movimento ao longo do tempo.
    2. Calcule o ângulo de giro, que representa a mudança na direção do movimento entre etapas de tempo consecutivas, fornecendo informações sobre os padrões de trajetória. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Saída 1).
    3. Calcule a taxa de alcance usando celltrackR14, que quantifica a distância que um objeto rastreado se move em relação à sua posição inicial, dando uma indicação do comportamento exploratório. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Saída 2).
    4. Calcule a velocidade média de cada trilha individual para resumir as características de movimento durante todo o período de observação. Calcule o ângulo de giro médio por pista para analisar a direcionalidade geral do movimento e os padrões comportamentais. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Saída 3).
    5. Determine a posição do centróide em cada passo de tempo para cada trilha de célula. O centróide é a média das posições do centrômero em um determinado meiócito.
    6. Calcule o tamanho do centróide em cada passo de tempo, que fornece uma medida da dispersão espacial dos centrômeros em torno de sua posição média. Variações do tamanho do centróide ao longo do tempo fornecem informações sobre a consistência global entre as trilhas do centrômero. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Saída 4).
    7. Calcule a correlação cruzada de velocidade para analisar as relações entre a dinâmica de movimento de diferentes objetos rastreados, revelando possíveis comportamentos coordenados. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Saída 5).
    8. Calcule o deslocamento quadrático médio (MSD) para cada trilha, uma métrica chave que quantifica a distância quadrada média percorrida pelos centrômeros em determinados intervalos de tempo (defasagens de tempo) para caracterizar o tipo de movimento.
      NOTA: Ao examinar como o MSD evolui com o aumento do intervalo de tempo, pode-se inferir se o movimento é predominantemente difusivo ou confinado, fornecendo assim informações sobre o comportamento dinâmico subjacente. O resultado é armazenado como: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Saída 6).

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Resultados

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Um protocolo rápido foi desenvolvido para visualizar os movimentos cromossômicos durante a prófase da meiose em Arabidopsis thaliana, permitindo múltiplas aquisições de lapso de tempo e, assim, a análise de um grande conjunto de dados. Meiócitos expressando um marcador GFP, permitindo a visualização de centrômeros, e um marcador RFP, permitindo a visualização do núcleo, são visualizados por um período de 4 min seguindo o protocolo descrito.

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo atual permite imagens in vivo e análise do movimento do centrômero durante a prófase meiótica em Arabidopsis thaliana. Este protocolo pode ser implementado com um microscópio confocal vertical ou invertido, tornando-o acessível à maioria dos laboratórios equipados com tecnologia confocal. Embora os sistemas confocais variem em velocidade de varredura, sensibilidade, detectores e capacidade de separar comprimentos de onda, é possível ajustar os parâmetros de ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho contou com o apoio das plataformas tecnológicas PO-Plants e PO-Cyto do Observatório de Plantas do Institut Jean-Pierre Bourgin. Esta pesquisa foi financiada pela ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042: M.G., P.A., L.C., S.L. e DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). O Instituto Jean-Pierre Bourgin beneficia do apoio da Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Área de reproduçãoTREF (Jiffy)101820/02227861
Microscópio confocalLeicaTCS SP8 AOBS (Divisor de Feixe Acusto-Óptico)
Software de confocalLeicaSoftware LAS X 3.5.0.18371
CoberturasPaul Marienfeld GmbH10705222x22 Nº1,5H
PinçasIdeal-Tek4.SA.0Pinças de alta precisão
GFP:CENH3Ravi et al. 2010Sementes de Arabidopsis thaliana usadas aqui
ggplot2  ggplot2: Gráficos Elegantes para Análise de Dados   Reference13https://ggplot2.tidyverse.org
Cabo para agulhasHammacherAlça para laço, comprimento 170 mm
ImarisInstrumentos OxfordImaris 9.7.2Análise de imagem - módulo "Spot"
LenteLeicaHC PL APO CS2 20 vezes/0,75 IMM
RelâmpagoLeicaDeconvolução AdaptativaExtração automatizada de informações inteligentes a partir de dados confocais
LuzesVEGELEDApollo LL252-Gen2
AgulhasWatkins & DoncasterPinos E3 .0124"(.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024Sementes de Arabidopsis thaliana usadas aqui
PotesTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
REquipe RCoreR: Uma linguagem e ambiente para estatísticas    Computação. Fundação R para Computação Estatística, Viena, Áustria.  Reference11https://www.R-project.org/  
RstudioEquipe Posit  RStudio: Ambiente Integrado de Desenvolvimento para R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Reference12http://www.posit.co/
SlidesCOPO DE KNITTEL10000326x76x1,0mm
EspaçadoresTermo-pescadorEspaçador de Vedação Segura, 8 poços, 9 mm de diâmetro, 0,12 mm de profundidadeCorte cada espaçador individualmente
EstereoscópiosNikonSMZ800

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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