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Análise do enriquecimento de vitamina A a 13C em amostras biológicas por cromatografia gasosa-combustão-espectrometria de massa de razão isotópica

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DOI:

10.3791/68571

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14 de novembro de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve a análise de amostras de soro, leite materno e fígado para enriquecimento de 13C de retinol e ésteres de retinil para aplicações de traçadores. A cromatografia líquida de alta eficiência é usada para purificar e quantificar as concentrações de retinol, e a cromatografia gasosa-combustão-espectrometria de massa de razão isotópica (GC-C-IRMS) é usada para analisar os extratos purificados.

Resumo

A vitamina A é fundamental para a saúde, mas a avaliação do status de vitamina A é um desafio. A vitamina A circulante no sangue é controlada homeostaticamente e muitas vezes não reflete deficiência ou excesso de vitamina A. O uso de 13C-vitamina A permite rastrear e quantificar os estoques totais de vitamina A do corpo e informações adicionais sobre farmacocinética e metabolismo. Este protocolo descreve a extração, purificação e determinação do enriquecimento isotópico de 13C de vitamina A em amostras de soro, leite materno e tecido usando cromatografia gasosa-combustão-espectrometria de massa de razão isotópica (GC-C-IRMS). A análise usando GC-C-IRMS fornece valores de enriquecimento sensíveis e precisos, particularmente para amostras com enriquecimentos de 13C próximos aos níveis de abundância natural. Isso permite flexibilidade nos desenhos de estudo para usar doses de traçador menores e amostragem farmacocinética de longo prazo. Resumidamente, ao soro de 0,4 a 1 mL, o etanol é adicionado para precipitar proteínas, o C-23 β-apo-carotenol é adicionado como padrão interno e o hexano é usado para extrair retinóides. O extracto é subsequentemente ressuspenso em metanol e purificado por HPLC. A fração de retinol é então ressuspensa em hexano e injetada no sistema GC-C-IRMS. A % do átomo (At%) é calculada diretamente em referência ao dióxido de carbono, que é calibrado em relação a um padrão de sacarose usando um analisador elementar. Outros tipos de tecido que foram analisados por GC-C-IRMS incluem leite materno e fígado após a saponificação. Técnicas de extração em fase sólida podem ser usadas para auxiliar na purificação dessas ou de outras matrizes complexas. Além disso, um analisador elementar pode ser conectado ao IRMS para analisar amostras de alimentos para um teor total de 13C.

Introdução

A vitamina A (VA) é um micronutriente essencial necessário para a visão, função imunológica, diferenciação celular e regulação metabólica. Otimizar o status de AV continua sendo um desafio de saúde global, pois a deficiência ou o excesso podem prejudicar os resultados de saúde. A avaliação precisa do status da AV é fundamental para estudos clínicos ou populacionais que orientam as intervenções apropriadas. No entanto, a concentração de retinol sérico por si só é um biomarcador e ferramenta de diagnóstico pobre porque é regulada homeostaticamente em uma ampla gama de estoques corporais totais (TBSs) e é afetada por inflamação e outras deficiências nutricionais 1,2.

Os traçadores marcados isotopicamente transformaram drasticamente a pesquisa de VA, permitindo a avaliação quantitativa de TBSs usando o teste de diluição de isótopos de retinol (RID) 3,4,5. Para RID, um marcador VA enriquecido em 13C ou 2H é administrado, equilibra-se com os estoques corporais e a relação traçador-traçador (TTR) de retinol sérico (ou plasmático) é medida usando MS. Uma equação de diluição isotópica é aplicada com suposições específicas relacionadas ao metabolismo do VA para calcular TBSs 5,6.

Várias combinações de cromatografia e EM podem ser usadas para determinar o TTR do retinol sérico (por exemplo, GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). A precisão analítica é fundamental para estimativas precisas de RID porque os TBSs são inversamente proporcionais ao TTR. O LC-MS/MS é adequado para aplicações de alto rendimento ao usar traçadores fortemente rotulados e doses de traçador relativamente altas. Os métodos típicos de LC-MS/MS relatam desvios padrão relativos de retinol (RSDs) de 3-6% para intra-ensaio e <8% para inter-ensaio7, mas há dados limitados sobre a exatidão e precisão dos TTRs. Em contraste, a espectrometria de massa de razão isotópica de cromatografia gasosa-combustão-isótopo (GCCIRMS) oferece precisão excepcional para enriquecimento de 13C-retinol, com RSDs típicos de abundância de isótopos 13C/12C de ~0,02-0,05 8,9. Isso permite a determinação precisa das concentrações do traçador em amostras onde os enriquecimentos são baixos. O uso do IRMS para aplicações RID permite um sinal analítico adequado usando menos massa traçadora e menos átomos marcados no traçador, economizando custos associados às doses traçadoras.

Este manuscrito descreve uma análise de 13C-retinol do sangue, leite materno e tecidos usando GC-C-IRMS. Dependendo da amostra biológica que está sendo testada, a análise do retinol marcado com 13C usando GC-C-IRMS começa com um dos vários métodos de extração potenciais para isolar os compostos apolares que incluem o retinol marcado. Para amostras de soro, isso envolve uma extração líquido-líquido adicionando etanol e hexano e coletando a fração hexana. Se testar o leite materno, as amostras são primeiro saponificadas com hidróxido de potássio, seguido por uma extração líquido-líquido semelhante ao soro. Essas amostras de leite materno também são purificadas usando cartuchos de extração em fase sólida para reduzir a quantidade de outros lipídios restantes. Se for extraída de um tecido (por exemplo, fígado), a amostra é moída com sulfato de sódio anidro para remover a água, extraída com cloreto de metileno e filtrada em um balão volumétrico ou de fundo redondo para evaporação rotativa. Uma alíquota é seca, ressuspensa em etanol, saponificada e extraída usando o mesmo método do leite materno. Estas soluções apolares de cada amostra são secas em azoto e reconstituídas em metanol para purificação e quantificação em cromatografia líquida de alta resolução (HPLC).

A sensibilidade do IRMS permite a determinação do enriquecimento em amostras com baixo enriquecimento de amostra, como amostras farmacocinéticas para aplicações de modelagem matemática de longo prazo ou amostras de tecido extra-hepático para rastreamento preciso do metabolismo do VA. O teste de RID pareado de dose única foi proposto para avaliar o status de AV antes e depois da intervenção para determinar a eficácia em indivíduos teóricos10, o que poderia ser uma abordagem promissora se validada em humanos. O IRMS é capaz de detectar traçadores VA próximos aos valores de enriquecimento natural, o que permitiria longas janelas de acompanhamento e flexibilidade nos protocolos de amostragem.

O leite materno demonstrou ser uma abordagem de amostragem alternativa menos invasiva para avaliação do status de AV1. O retinol do leite materno pode ser usado como fonte de amostragem para o teste de RID e mostrou forte correlação com valores de RID derivados do soro em mulheres na Zâmbia com baixos estoques de VA11. Para amostras de tecidos e leite materno, as técnicas de extração em fase sólida podem auxiliar na purificação dessas amostras em matrizes complexas. O IRMS também tem sido usado para discriminar fontes alimentares de VA e determinar as contribuições dietéticas relativas usando mudanças na abundância natural de 13C do retinol sérico 9,12,13. Um analisador elementar também pode ser usado com o IRMS para analisar amostras de alimentos quanto ao conteúdo total de 13C e compará-lo com o enriquecimento de VA.

Ao usar rótulos de 13C, é fundamental entender o enriquecimento de retinol de 13C na linha de base, devido à ocorrência natural de 13C (~ 1,1% do carbono total), que pode variar com as fontes de VA consumidas por indivíduos e populações. Portanto, para obter a melhor precisão no nível individual, recomenda-se uma amostra de sangue basal. Para avaliações populacionais, uma estimativa de base populacional pode ser gerada usando um subgrupo selecionado aleatoriamente ou indivíduos separados do mesmo grupo populacional14.

Protocolo

1. Extração de retinol de amostras biológicas

NOTA: Todos os procedimentos de manuseio e extração de amostras são realizados sob luz amarela ou filtrada por UV para minimizar a degradação.

  1. Extração do soro
    1. Pipete 1 mL de soro (ou tanto quanto disponível) em um tubo de ensaio de vidro de 13 x 100 mm (ou tamanho semelhante). Registre o volume de soro usado.
      NOTA: Recomenda-se o uso de uma pipeta de deslocamento positivo.
    2. Adicione 1,5x o volume de etanol à prova de 200.
    3. Adicione 25 μL do padrão interno, como C-23 β-apo-carotenol (sintetizado a partir de retinal totalmente trans, abs = 0,9)9. Tampe a amostra e misture por vórtice por 15 s.
    4. Adicione 1 mL de hexano, misture em vórtice por 15 s e centrifugue por 2 min (~ 1.300 × g) em temperatura ambiente.
    5. Usando uma pipeta Pasteur, pipete cuidadosamente a camada superior de hexano em um novo tubo de ensaio de vidro (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    6. Repita as etapas 1.1.4 e 1.1.5 2x, agrupando os três extratos hexanos no segundo tubo. Coloque o extrato hexano acumulado sob um fluxo suave de nitrogênio até secar.
    7. Adicione 100 μL de metanol à amostra seca e tampe imediatamente. Agite a solução para cima e para baixo nas laterais do tubo e, em seguida, misture a amostra por vórtice por 15 s.
    8. Colocar as amostras num congelador a -80 °C durante, pelo menos, 5 min.
      NOTA: As amostras podem permanecer armazenadas nesta etapa a -80 °C até o dia seguinte.
  2. Extração de amostras de leite materno
    1. Descongele as amostras de leite completamente e inverta suavemente várias vezes para garantir que as amostras sejam uniformes. Em um tubo de centrífuga com tampa de rosca de vidro de 10 mL, meça uma alíquota de 0,5-1,5 mL (padrão 1,0 mL) de leite e registre o volume usado.
    2. Adicione 1,5x o volume de etanol 200 proof (contendo 0,1% de hidroxitolueno butilado (w:v)), misture com um vórtice por 15 s.
    3. Adicione 25 μL do padrão interno, como C-23 β-apo-carotenol (sintetizado a partir de retinal totalmente trans, abs = 0,9)15. Tampe a amostra e misture por vórtice.
    4. Adicione 0,8x o volume da amostra de leite de hidróxido de potássio 50:50 em água (preparado como w:v, por exemplo, 50 g de KOH dissolvido em 50 mL de água), misture por vórtice por 15 s.
      NOTA: KOH: a água deve ser preparada em recipientes de plástico (por exemplo, HDPE).
    5. Saponifique as amostras durante 1 h em banho-maria a 45 °C e misture brevemente com um vórtice de 15 em 15 minutos.
    6. Adicione água fria deionizada ou de osmose reversa no mesmo volume do volume inicial de leite.
    7. Adicione 1 mL de hexano, misture em vórtice por 15 s e centrifugue por 2 min (~ 1.300 × g) em temperatura ambiente.
    8. Usando uma pipeta Pasteur, pipete cuidadosamente a camada superior de hexano para um novo tubo de ensaio de vidro (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    9. Repita as etapas 1.2.7 e 1.2.8 mais duas vezes, agrupando hexano no segundo tubo.
    10. Retirar cada amostra por meio de extração em fase sólida (SPE); comece conectando os cartuchos SPE necessários (PE 500 mg / 3 mL de -NH2) ao coletor de vácuo.
    11. Condicione cada cartucho passando 3 x 2 mL de hexano em cada cartucho, nunca permitindo que o nível de solvente caia abaixo do topo do material de embalagem. Colete o hexano em um tubo de vidro de 16 x 75 mm e descarte-o adequadamente.
    12. Carregue as amostras em cartuchos e puxe com o vácuo até que o solvente esteja um pouco acima do nível do material de embalagem. Enxágue cada cartucho com 3 x 2 mL de hexano da mesma maneira que na etapa 1.2.11. Descarte o solvente residual e substitua os tubos de coleta de vidro por novos do mesmo tamanho, rotulados com o sample ID.
    13. Lave o retinol com 3 x 2 mL de cloreto de metileno, coletando essa fração.
    14. Secar o eluído sob azoto e reconstituir em 100 μl de metanol (grau MS). Misture a amostra por vórtice e gire o solvente em todos os lados do tubo. Centrífuga por 20-30 s.
    15. Colocar as amostras num congelador a -80 °C durante, pelo menos, 5 min.
      NOTA: As amostras podem permanecer armazenadas nesta etapa a -80 °C até o dia seguinte.
  3. Extração de amostras de fígado
    1. Em um funil de vidro com 8 cm de diâmetro, dobre e coloque um papel de filtro Whatman #1 de 15 cm em forma de cone. Colocar um balão volumétrico de 50 ml sob o funil.
    2. Descongele o tecido e pese 0,5 g, ou a quantidade de amostra disponível. Registre o peso do tecido usado.
    3. Transfira as amostras para um almofariz e pilão e triture com aproximadamente 5 g de sulfato de sódio.
    4. Adicione 250 μL de um padrão interno, como C-2315.
      NOTA: Formas esterificadas de vitamina A (ou seja, acetato de retinila, butirato de retinila) não devem ser usadas porque a amostra acabará sendo saponificada, tornando o padrão indistinguível do retinol endógeno.
    5. Em uma capela de exaustão, despeje 10-15 mL de cloreto de metileno no almofariz com a amostra de fígado moída e misture delicadamente usando o pilão.
    6. Despejar cloreto de metileno através do papel de filtro no balão volumétrico.
    7. Repetir as etapas 1.3.5 e 1.3.6 mais duas vezes, garantindo que o solvente total no balão volumétrico permaneça abaixo da linha.
    8. Use uma pipeta Pasteur para enxaguar o conteúdo restante da argamassa no funil com cloreto de metileno. Continuar a adicionar cloreto de metileno ao funil com a pipeta Pasteur até que o solvente no balão volumétrico atinja a linha. Tampe o balão volumétrico e, enquanto prende a tampa no lugar, inverta o balão várias vezes.
    9. Despeje aproximadamente 10 mL do extrato de cloreto de metileno em um Erlenmeyer de 25 mL. Transfira 5 mL da solução para um tubo de centrífuga de vidro de 10 mL com tampa de rosca. Secar a amostra sob uma corrente suave de azoto gasoso.
    10. Reconstituir a amostra em 2 ml de etanol + 0,1% de hidroxitolueno butilado e vórtice para misturar a amostra.
    11. Adicione 0,8 mL de hidróxido de potássio 50:50 (w:v) em água e misture em vórtice por 15 s.
    12. Saponifique as amostras durante 1 h em banho-maria a 45 °C e misture brevemente com um vórtice de 15 em 15 minutos.
    13. Adicione 0,1 mL de água fria deionizada ou de osmose reversa.
    14. Adicione 1 mL de hexano, misture por vórtice por 15 s e centrifugue por 2 min (~ 1.300 × g).
    15. Usando uma pipeta Pasteur, pipete cuidadosamente a camada superior de hexano para um novo tubo de ensaio de vidro (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm).
    16. Repita as etapas 1.3.14 e 1.3.15 mais duas vezes, agrupando hexano no segundo tubo.
    17. Seque o hexano acumulado sob azoto e reconstitua em 100 μL de metanol (grau MS). Misture a amostra por vórtice e agite o solvente em todos os lados do tubo. Centrifugue por 20-30 s e coloque as amostras em um freezer a -80 °C por pelo menos 5 min.
      NOTA: As amostras podem permanecer armazenadas nesta etapa a -80 °C até o dia seguinte.

2. Purificação e quantificação de amostras usando cromatografia líquida de alta eficiência

  1. Preparar o sistema de HPLC 1 com uma coluna C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) e um detector UV-Vis regulado para 325 nm.
  2. Prepare a fase móvel de acetonitrila 92: 8: água medindo os volumes de acetonitrila e água separadamente e, em seguida, despejando a água na acetonitrila. Filtre a vácuo a solução misturada para remover o gás dissolvido.
  3. Ligue o sistema de HPLC 1, execute uma purga de solvente na HPLC, se necessário, e defina a taxa de fluxo para 1 mL / min por pelo menos 15 min para equilibrar totalmente o sistema.
  4. Injete padrões no sistema HPLC.
    1. Para quantificar as concentrações de retinol, injetar 25 μL de solução de padrão interno C-23 e registar o resultado 3x para comparar com as amostras.
    2. Injete um padrão de retinol para determinar o tempo exato de retenção do sistema usado para orientar a coleta de frações e a quantificação do retinol.
  5. Preparar o sistema de HPLC 2 (os componentes são os mesmos do sistema 1). Se estiver usando um sistema HPLC para ambas as etapas, substitua a coluna usada para a purificação primária por uma segunda coluna idêntica para minimizar o transporte potencial de compostos das amostras.
  6. Para o sistema 2, filtre o metanol a vácuo, purgue a fase móvel da HPLC e, em seguida, execute 0,7 mL / min por 20 min para equilibrar.
  7. Retirar as amostras uma de cada vez do congelador a -80 °C e centrifugar a 1.300 × g durante 30 s à temperatura ambiente.
  8. Injetar a amostra completa na HPLC, evitando qualquer material peletizado. Comece a gravar se quantificar o retinol.
  9. Colete o pico de retinol em um pequeno tubo de vidro (12 x 75 mm ou 13 x 100 mm) à medida que o solvente passa pelo detector. Colete a porção intermediária do pico para maximizar a pureza, normalmente valores de absorbância superiores a 0,1 unidades de absorbância (Figura 1), que podem ser ajustados dependendo da concentração de retinol da amostra. Aguarde até que o pico do C-23 elua e pare a gravação.
  10. Secar a amostra sob uma corrente suave de azoto.
  11. Adicione 100 μL de metanol (grau MS) à amostra seca e tampe imediatamente. Agite a solução para cima e para baixo nas laterais do tubo e, em seguida, misture a amostra por vórtice por 15 s. Colocar as amostras num congelador a -80 °C durante, pelo menos, 5 min.
    NOTA: As amostras podem permanecer armazenadas nesta etapa a -80 °C até o dia seguinte.
  12. Retire as amostras uma de cada vez do congelador a -80 °C. Centrifugar a 1.300 × g durante 30 s.
  13. Injetar a amostra completa no sistema HPLC 2, evitando qualquer material peletizado.
  14. À medida que o pico de retinol elui, colete o solvente à medida que ele passa pelo detector em um pequeno frasco de vidro (<1 mL) com fundo cônico e deslize suavemente o sample frasco para dentro de um tubo de ensaio de 12 x 75 mm.
  15. Ligue o concentrador de vácuo e deixe o condensador esfriar por 20 min.
  16. Coloque as amostras em uma formação equilibrada no carrossel, ajuste a configuração de calor para zero e o vácuo para 05.1, feche a tampa e pressione run.
    NOTA: As amostras normalmente levam de 10 a 20 minutos para secar. É importante para o cromatógrafo de fase gasosa que todo o metanol tenha sido removido das amostras.
  17. Depois de seco, transfira o frasco para HPLC para um frasco âmbar de 4 mL com tampa de rosca e reconstitua a amostra com 4-7 μL de hexano.
    NOTA: Isso é normalmente de 7 μL, mas é reduzido quando a amostra é determinada como uma concentração baixa durante a purificação. As amostras de fígado podem ser muito mais concentradas, portanto, reconstituam-se em um volume maior. Apontar para entre 75 ng/μL e 400 ng/μL.
  18. Injete 1-5 μL no GC-C-IRMS para obter um sinal adequado, com base na concentração da amostra necessária para injetar aproximadamente 75 ng de retinol.

3. Análise de amostras com GC-C-IRMS

  1. Prepare o GC com uma coluna (100% dimetilpolissiloxano, apolar, 15 m, 0,25 mm de diâmetro interno, filme de 0,25 μm) e a taxa de fluxo de hélio de 1,2 mL / min.
  2. Execute verificações do sistema para garantir que não haja vazamentos e que a fonte do IRMS esteja devidamente focada nas massas 44, 45 e 46.
    Injete 2 μL de um padrão de retinol enriquecido com 13C de 75 ng/μL todos os dias como a primeira injeção para determinar o tempo de retenção e verificar o desempenho do sistema.
  3. No software de aquisição, carregue o método do instrumento, digite o nome da amostra e pressione executar amostra. O sistema GC-C-IRMS executará uma rotina de configuração do sistema de pré-injeção. Assim que a luz verde Pronto para injetar na frente do GC acender, injete o volume predeterminado de sample no injetor PTV de vaporização de temperatura programável, remova a seringa e pressione o botão Iniciar .
  4. Opere o injetor PTV no modo PTV Splitless, com a coluna de proteção assentada na parte superior do inserto do injetor para uma injeção simulada na coluna. Defina o programa do injetor para começar com uma temperatura inicial de 50 °C, segure por 1.05 min, aumente para 200 °C a uma taxa de 14.5 °C/s, mantenha a 200 °C por 1 min, faça a transição para 300 °C a 14.5 °C/s e, em seguida, segure para purgar o injetor por 4 min com um fluxo dividido de hélio de 50 mL/min antes de retornar a 50 °C para a próxima injeção.
  5. Programe a temperatura do forno GC para uma temperatura inicial de 50 °C, mantenha por 1 min, aumente 30 °C/min para 150 °C, depois 15 °C/min para 265 °C, depois até 295 °C a 40 °C/min e segure por 2.50 min antes de esfriar para 50 °C para a próxima injeção.
  6. Certifique-se de que cada cromatograma comece com três pulsos de CO2 (99,999% de pureza), calibrados contra sacarose (IAEA-CH-6). Resultados de acesso no software de aquisição.
  7. Após cada injeção, inspecione cada cromatograma para verificar se o pico de retinol está presente e se a integração é apropriada. Use o software para integrar automaticamente os picos de retinol o máximo possível para minimizar o possível viés das integrações manuais. Utilize configurações padrão de detecção de inclinação inicial e final de 20 mV/s.
    NOTA: Uma amplitude de pico de 200 mV ou inferior é muito pequena para fornecer uma medição precisa da relação de 13C.
  8. Exporte dados de cromatograma para um programa de planilha. Inclua as seguintes categorias de dados essenciais: nome da amostra, tempo de retenção de pico, amplitude de pico na massa 45 e AT%.
    NOTA: Os dados exportados podem ser especificados usando um método de exportação definido. O valor δ é benéfico para facilitar a interpretação, mas não é necessário para cálculos.

4. Cálculo dos estoques corporais totais de vitamina A e das concentrações hepáticas

  1. Equações de diluição de isótopos de retinol.
    NOTA: A equação de equilíbrio de isótopos preferida e a notação correspondente usada por alguns pesquisadores são baseadas nas recomendações da União Internacional de Química Pura e Aplicada16. Observamos que alguns grupos de pesquisa usam notação que tenta manter o uso histórico de fatores usados em equações RID. Também observamos que os fatores e a literatura de apoio podem diferir se eles se aplicam mais diretamente aos cálculos de TBSs ou concentrações de VA no fígado, dependendo do desenho do estudo, modelo experimental e resultados analíticos.
    1. Determinar o TTR do retinol sérico utilizando a abundância isotópica de 13C de CO2 após a combustão, de acordo com a seguinte equação:
       figure-protocol-1    
      Onde F é a abundância isotópica (também conhecida como fração de quantidade isotópica, abreviada como 'x') da dose do marcador (Fa), retinol sérico na linha de base (Fb) e retinol sérico após dosagem e mistura com o pool corporal (Fc). Os períodos de mistura usados são normalmente de 14 a 21 dias para humanos, mas podem ser mais curtos ou mais longos, dependendo do desenho específico do estudo.
    2. Use equações RID para calcular VA TBS de acordo com a seguinte equação base.
      figure-protocol-2
      Onde
      figure-protocol-3
      NOTA: Os fatores usados para absorção e armazenamento incluem i) armazenamento de dose no momento do equilíbrio (absorção de dose) normalmente estimado entre 75% e 90% para indivíduos saudáveis. A estimativa pode ser reduzida se houver inflamação. ii) Retenção de dose; Constante: e-kt; k = LN(2)/meia-vida do retinol; 32 a 136 dias para crianças; 140 dias para adultos); t = dias desde a administração (geralmente 14-21 dias); partição do traçador soro/hepático: TTRsoro / TTRfígado; 0,65-0,9 com ingestão de AV durante o período de mistura; 0,9-0,1 se estiver usando baixa dose de traçador, ingestão controlada de AV e amostragem em jejum.
      figure-protocol-4
    3. Calcule as concentrações hepáticas de VA com suposições adicionais para o peso do fígado e a fração de VA TBS no fígado.
      figure-protocol-5
      Onde
      figure-protocol-6
      A razão entre o fígado e o peso corporal é comumente estimada como uma constante específica da idade: lactentes: 4-4.2%; filhos: 3%; adultos: 2,4%; A fração TBS no fígado varia com o status de vitamina A. As estimativas usadas anteriormente são status de VA marginal ou baixo: 0,5; status adequado de AV: 0,8-0,9.

Resultados

Um exemplo de cromatograma de amostra de soro monitorado a 325 nm é fornecido para a seção 2 do protocolo (Figura 1). Dependendo do sistema específico e da coluna usada, o tempo de retenção típico para o retinol é de 4-6 min e 6-8 min para o padrão interno. A área sombreada verde mostra a faixa de coleta alvo para a fração de retinol para minimizar as impurezas. A eficiência de extração do retinol do soro é tipicamente ≥ 85%, enquanto o leite materno saponificado e as amostras de tecido tendem a ter eficiências mais baixas, com média de ~ 70-80%. Pequenas quantidades de cis-isômeros de retinol podem ser observadas eluindo pouco antes ou depois do pico principal de all-trans durante a purificação por HPLC. Nenhum isômero cis apreciável foi observado na amostra apresentada na Figura 1 , mas pode ser visto na Figura Suplementar 1 da referência17. Freqüentemente, um isômero adicional será separado durante a segunda purificação por HPLC (não mostrado) ou durante a separação por GC (Figura 2).

Exemplos de cromatogramas GC-C-IRMS para uma amostra de soro padrão e em branco são mostrados para a seção 3 do protocolo (Figura 2)9. Cada amostra inclui picos de CO2 de referência com enriquecimento de 13C calibrado para um padrão de sacarose da IEA (IAEA-CH-6).

A precisão experimental do IRMS (CV%) para abundância isotópica de 13C/C total para: 1) CO2 de referência foi de 0,012 para estabilidade e 0,031 para linearidade (n = 10 cada); 2) o padrão de retinol foi de 0,036 para estabilidade interdia e 0,022 para linearidade intradia (n = 4 cada); e 3) experimental foi de 0,073 ± 0,061 em toda a linha de base e oito grupos de tratamento dietético em gerbos (n = 46 em 9 grupos)9.

Segue-se um exemplo de como os dados séricos resultantes do GC-C-IRMS são utilizados para calcular as concentrações de TBS e VA hepáticas determinadas 14 dias após a administração da dose, utilizando a equação RID para o Método 4:

Características dos participantes do estudo:

Idade:4 anos
Peso corporal:16.0 kg
Fa (2 carbonos marcados mais abundância natural):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Dose de marcador aplicada:1,0 μmol
Tempo desde a administração:14 dias
Meia-vida VA:32 dias
Absorção:0.8
Relação TTR no soro/fígado (dieta não controlada):0.9
Fração TBS no fígado:0.8

Cálculo:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Retenção de dose = e-kt com meia-vida de 32 dias e tempo de amostragem de 14 dias
k= ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0,02166 x 14 = 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Para o cálculo das concentrações hepáticas de VA:
Peso do fígado (g) = 1.000 × peso corporal (kg) × 3% (estimativa para crianças)
Peso do fígado = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Concentração de VA no fígado = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Figura 1: Cromatograma HPLC da amostra de soro humano. Sistema de HPLC 1 com fase móvel isocrática 90:10 MeOH:H2O e detecção a 325 nm. O pico de retinol é coletado para valores de absorbância acima de ~ 0,1 (área sombreada em verde). O padrão interno C-23 β-apocarotenol é usado para quantificar a concentração sérica de retinol (se desejado) durante esta etapa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 2: Cromatogramas GC-C-IRMS demonstrando determinação de retinol 13 C/12 C. Cromatograma GC-C-IRMS de (A) padrão de retinol, (B) retinol purificado do soro e (C) injeção em branco adaptado de Gannon et al.9. Três traços são para massa 44 (correspondente a 12C16O2), 45 (correspondente a 13C16O2 ou 12C16O17O) e 46 (correspondente principalmente a 12C16O18O, que é usado para corrigir a massa 45 para 17O contribuição). Três picos largos antes de 200 s são picos de referência de CO2 calibrados para um material de referência de sacarose 13C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os métodos descritos para medir o enriquecimento de retinol a 13C usando GC-C-IRMS podem fornecer dados valiosos para avaliar intervenções dietéticas,18 modelagem da cinética da vitamina A,19,20,21 pesquisa clínica ou estudos populacionais incorporando RID para melhores estimativas do status de VA 22.

Neste teste, o retinol purificado de uma amostra biológica é transportado através da coluna GC por hélio de grau de pesquisa (>99,99999% de pureza) com um gradiente de temperatura, separando-o das impurezas restantes na amostra. O retinol é queimado para formar CO2 e água, e a água é removida. O CO2 é transportado para o IRMS, onde as massas 44, 45 e 46 são medidas, e o δ e AT% são determinados em relação a uma referência de gás CO2 , que é adicionalmente calibrada em relação ao padrão de sacarose (IAEA-CH-6).

Na preparação do retinol para injeção, o retinol extraído deve ser de pureza máxima para atingir proporções isotópicas reprodutíveis e maximizar a longevidade da plataforma analítica entre limpezas completas. Os solventes usados para extração devem ser do mais alto grau de pureza disponível, que geralmente é o grau MS. Todos os artigos de vidro, como tubos de extração, pipetas de Pasteur e frascos de injeção de HPLC, devem ser novos porque são difíceis de limpar adequadamente para análise de EM. É importante usar tubos de vidro e pipetas em vez de plástico para minimizar os plastificantes nos extratos que se acumulam no GC e nas colunas de combustão.

Modificações neste fluxo de trabalho de análise de amostra podem ser feitas dependendo do desenho específico do estudo e da fonte de amostragem. Por exemplo, um sistema de HPLC provavelmente poderia ser otimizado para purificação de retinol. Em nossa experiência, isso exigiria água na fase móvel e exigiria um gradiente de fase móvel ou aumentaria o tempo de secagem da amostra antes da injeção no GC-C-IRMS. Descobrimos que o uso de dois sistemas HPLC com métodos isocráticos curtos equilibra os requisitos analíticos enquanto obtém sinais claros no GC-C-IRMS (Figura 2). O uso de LC-MS/MS pode fornecer um fluxo de trabalho analítico mais simplificado para amostras de RID7. No entanto, a sensibilidade do GC-C-IRMS tem vantagens distintas de poder usar doses e quantidades de marcação de isótopos mais baixas, quantificando traçadores em pontos de tempo mais longos e analisando amostras com baixo enriquecimento de amostra.

As limitações desse método incluem a necessidade de vários instrumentos, manuseio técnico qualificado e restrições de rendimento de amostras devido a tempos de preparação de amostras mais longos. O tempo de trabalho necessário para preparar cada amostra pode ser melhorado com a implementação de uma HPLC com recursos automatizados de coleta de frações, uma vez que as etapas de purificação da HPLC utilizam métodos isocráticos, resultando em tempos consistentes de retenção de analitos. O método pode ser otimizado para usar apenas uma purificação por HPLC. Usamos dois sistemas em paralelo para aumentar o rendimento e facilitar a secagem da amostra antes da reconstituição em hexano e injeção no GC-C-IRMS.

Embora o GC-C-IRMS seja extremamente sensível para determinar as proporções de isótopos, ele requer mais massa total de retinol da amostra para um sinal adequado de retinol. Os requisitos de amostra dependem da quantidade de amostra e da concentração de VA da amostra. Normalmente, 75 ng de retinol são direcionados para um pico forte, permitindo variações na transferência de GC e na eficiência da combustão. Na prática, em condições ideais de operação, obtivemos sinal adequado com amostras resultando em injeções de GC-C-IRMS tão baixas quanto 25 ng. Isso corresponde a uma amostra de soro com menor volume (~0,4 mL), baixa concentração de retinol (~0,5 μmol/L) e pequenas perdas nos procedimentos de extração e purificação. No desenvolvimento analítico do método RID, uma grande melhoria foi a mudança para um injetor de PTV. A baixa temperatura inicial evita que o hexano que transporta a amostra se expanda muito rapidamente, permitindo injeções simuladas de amostras na coluna. A injeção direta na coluna maximiza o sinal do retinol com a desvantagem de uma forma de pico um pouco pior e manutenção mais constante.

O leite materno foi proposto como substituto das amostras de soro no teste RID. Isso foi validado em mulheres lactantes da Zâmbia que em grande parte tinham baixos estoques de VA11. Ainda não foi validado em mulheres que têm uma maior ingestão de AV pré-formada, como se encontraria em países de alta renda ou em populações que consomem múltiplas fontes de AV, incluindo ingestão alimentar, fortificação de alimentos e suplementação.

A avaliação da AV no leite materno tem várias vantagens sobre outros indicadores bioquímicos do status da AV. A coleta de leite materno costuma ser mais fácil do que o sangue porque os flebotomistas não são necessários, e a coleta de leite materno geralmente é considerada menos invasiva para os indivíduos23. O uso de amostras casuais de leite materno é conveniente e requer apenas 5 mL de leite. Além disso, as amostras não precisam ser processadas imediatamente, o que reduz o tempo de manuseio da amostra, principalmente em configurações de campo. No entanto, a padronização da coleta de amostras para amostras de leite materno completo é crítica, pois as concentrações de gordura e retinol são maiores no leite posterior do que no leite anterior, e as concentrações de gordura do leite e retinol tendem a variar com a hora do dia e o intervalo desde a última mamada 1,24. Para amostras casuais, a concentração de retinol é melhor expressa por g de gordura do leite. A gordura do leite deve ser determinada idealmente logo após a coleta usando o método do crematócrito25. As amostras devem ser protegidas da luz. Alíquotas (normalmente 1 a 5 ml) para análise por HPLC têm de ser preparadas no momento da colheita, uma vez que o leite não é homogéneo após a congelação e descongelação.

Existem duas circunstâncias principais em que a medição do enriquecimento de 13C do VA no fígado pode ser possível e de interesse. A situação mais comum é ao utilizar retinol marcado com 13C em estudos com animais quando o fígado é coletado. Os TBSs calculados de VA serão comparados com a concentração de VA no fígado, conforme determinado por HPLC / UPLC, mas o enriquecimento de 13C dos estoques hepáticos também é útil para determinar como o marcador é distribuído em circulação em relação aos estoques de longo prazo. Além disso, em algumas circunstâncias únicas, é possível obter amostras de biópsia hepática de humanos que deram consentimento e também tomaram uma dose rotulada de vitamina A 26,27. Essas amostras também são úteis para validação e teste de mistura de 13C-retinol. O processamento de amostras de fígado começa com a trituração de uma amostra medida com sulfato de sódio anidro para reter a água e quebrar o tecido. Este é então extraído com 50 mL de cloreto de metileno através de papel de filtro. Uma fração é seca sob nitrogênio e reconstituída em etanol com 0,1% de hidroxitolueno butilado adicionado como conservante. A amostra é saponificada e extraída com o mesmo procedimento usado para o leite materno.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo NIH-R01 DC019357 e pelo Projeto de Pesquisa Coordenada da AIEA E43035.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Material de Referência 13C rastreável à escala VPDB-LSVEC (Sucrose)Agência Internacional de Energia AtômicaAIEA-CH-6 Nome do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia: RM 8542
Acetonitrilo (grau HPLC)Fischer ScientificUN1648
Etanol (puro 200 proof, anidro e ge; 99.5%)Sigma459836
Pipetas pasteur de vidroQualquer
Tubos de ensaio de vidroQualquer
Hélio (graça de pesquisa, (>99,9995% pureza)Qualquer
HexanosSigma178918
Metanol (grau MS)VWRMSPP-A-456
Armamgamassa e pestel, cerâmicaQualquer
Pipeta de deslocamento positivo 3-25 & micro; LGilsonFD10002
Pipeta de deslocamento positivo 10-100 & micro; LGilsonFD10004
Pipeta de deslocamento positivo 50-250 & micro; LGilsonFD10005
Pipeta de deslocamento positivo 100-1000 & micro; LGilsonFD10006
Hidróxido de potássioFisher ScientificUN1813
Papel filtro qualitativo #1 150 mmWhatman1001-150
Chaminés separatóriasQualquer
Sulfato de sódio, anidroFischer ScientificS415-212
Frascos volumétricos (50 mL)Qualquer

Referências

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