In situ Detecção de células metabolicamente ativas em tecido de carcinoma hepatocelular usando imagem de criossecção baseada em MTT

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo simples para detectar as células metabolicamente ativas no tecido do carcinoma hepatocelular usando imagens de criossecção baseadas em MTT. Este método pode também ser utilizado para detectar células ativas in situ noutros tecidos ou órgãos.

Resumo

Evidências emergentes, incluindo estudos anteriores, destacam uma subpopulação de células dentro dos tecidos do carcinoma hepatocelular (CHC) que exibem atividade metabólica superior e resistência ao estresse. Essas células são os principais impulsionadores da progressão do tumor e da resistência à terapia. No entanto, os métodos existentes para detecção de células viáveis in situ geralmente comprometem a integridade do tecido, alteram a viabilidade celular ou são tecnicamente exigentes. Este estudo apresenta uma abordagem nova, simples e não destrutiva para detecção in situ de células metabolicamente ativas em tecidos de CHC por meio da redução dependente de mitocôndrias de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) em cristais de formazan insolúveis. Ao otimizar o tamanho do fragmento de tecido (1 × 1 × 0,2 cm³), as condições de cultura (20% FBS, 1 mg / mL de MTT e 3 h de incubação com redemoinho intermitente) e os parâmetros de criossecção (20 μm de espessura, fixação de 4% de PFA e contracoloração DAPI), o mapeamento espacial de células viáveis de CHC foi alcançado em 5 h. Este protocolo econômico não requer equipamento especializado e mantém a arquitetura do tecido, permitindo a identificação espacial de aglomerados de células de alta viabilidade e resistentes ao estresse em regiões de superfície. As limitações incluem perda progressiva de viabilidade além de 6 h e deslocamento do cristal durante o seccionamento, que pode ser mitigado por meio da suplementação de FBS e congelamento controlado. Este método fornece uma plataforma prática para o isolamento de células únicas de subpopulações resistentes à terapia, avançando na pesquisa do microambiente do CHC.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC), a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, é caracterizado por alta heterogeneidade e taxas de recorrência¹. Essa heterogeneidade espacial e temporal torna certas populações de células dentro dos tecidos tumorais mais ativas do que outras no metabolismo, proliferação, progressão, tolerância ao estresse e resistência a medicamentos. A detecção in situ de células viáveis dentro dos tecidos do CHC tem profundo significado clínico e biológico, pois essas células abrangem subclones em proliferação, populações resistentes à terapia e células iniciadoras de metástases. Essas células viáveis podem servir como impulsionadores críticos de recorrência tumoral, evasão imunológica e falha terapêutica².

No entanto, as tecnologias atuais de perfil espacial (por exemplo, transcriptômica espacial) requerem instrumentação especializada e estão associadas a altos custos, enquanto as análises tradicionais em massa muitas vezes ignoram a heterogeneidade espacial das células viáveis e suas interações dinâmicas com os componentes estromais³. Por exemplo, células HCC viáveis residuais pós-ressecção exibem perfis metabólicos distintos que não podem ser fielmente recapitulados em sistemas celulares dissociados⁴. Assim, o avanço das tecnologias de detecção espacialmente resolvidas é imperativo para desvendar a interferência funcional entre as células tumorais viáveis e seu microambiente, informando estratégias terapêuticas de precisão. Embora métodos convencionais como citometria de fluxo ou imuno-histoquímica (IHQ) tenham sido utilizados por nosso grupo para detectar as células viáveis no CHC, eles requerem dissociação ou fixação tecidual, perdendo o contexto espacial e dificultando a análise das interações célula-célula ^5,6. Assim, o desenvolvimento de tecnologias não destrutivas e de alta resolução para detecção in situ de células viáveis é fundamental para elucidar os mecanismos de resistência ao CHC e orientar as terapias de precisão.

Para detectar e exibir rapidamente as células viáveis em tecidos de CHC in situ sem tratamento destrutivo, foi desenvolvido um método simples de cultura de tecidos baseado em brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Resumidamente, os tecidos finos frescos do CHC (aproximadamente 1 × 1 × 0,2 cm³) foram primeiro cultivados em meio DMEM por 3 h contendo 20% de soro fetal bovino (FBS) e MTT (1 mg / mL). Em seguida, após a fixação do paraformaldeído a 4% (PFA) e montagem contendo DAPI, lâminas de tecido congelado embebidas em OCT (20 μm de espessura) foram submetidas a observação microscópica sob luz brilhante ou UV. As células viáveis exibirão coloração roxa, vermelho-púrpura ou preto-púrpura. Usando este protocolo, detectamos com sucesso as células viáveis nos tecidos do CHC em 5 h. Enquanto isso, esse método preserva a microarquitetura 3D, é compatível com a análise multiômica downstream e é simples, além de economizar tempo e custo. No entanto, esse método apresenta certas limitações. Os processos de várias etapas de lavagem, seccionamento e cultura podem induzir deformação estrutural e apoptose nos tecidos, especialmente em amostras metabólicas altas, como o tecido HCC neste estudo. Além disso, o aumento da espessura das fatias de criossecção compromete a clareza e o nivelamento das observações microscópicas.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e aprovados pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado de Quanzhou (No. FJMU IACUC2021257). Os tecidos do CHC foram removidos cirurgicamente e coletados no Quanzhou First Hospital, afiliado à Fujian Medical University, com o consentimento informado dos pacientes. Este experimento requer medidas de proteção padrão, incluindo o uso de jaleco de laboratório, máscara descartável e luvas.

1. Preparação de tecidos

1. Coloque uma placa de Petri estéril de 9 cm no gelo. Adicione 30 mL de tampão fosfato salino (PBS) gelado.
2. Transfira imediatamente o tecido HCC humano ressecado cirurgicamente para o PBS.
3. Agite suavemente o prato por 5 s para remover os contaminantes do sangue. Aspire PBS usando uma pipeta estéril.
   NOTA: Repita três vezes.
4. Transfira o tecido para a tampa da placa de Petri.
   NOTA: Os tecidos aderem facilmente à tampa da placa de Petri não umedecida para melhor manuseio posteriormente.
5. Apare o tecido em aproximadamente 1 × 1 ×^{0,2 cm 3} fragmentos usando uma lâmina cirúrgica estéril (nº 11).
   NOTA: O comprimento e a largura dos fragmentos podem ser alterados, mas a profundidade deve ser inferior a 0,2 cm.
6. Retorne os fragmentos para um prato fresco de 9 cm cheio de 30 mL de PBS gelado.
7. Agite suavemente o prato por 5 s para remover os contaminantes do sangue. Aspire PBS usando uma pipeta estéril.
   NOTA: Repita a etapa 1.7 três vezes. Um fragmento de tecido fervido em PBS (95 °C, 10 min) foi definido como controle negativo. Execute todas as etapas em condições estéreis.

2. Cultura de tecidos

1. Adicione 1,8 mL de meio de cultura completo DMEM (pré-aquecido a 37 ° C) contendo glicose (concentração final = 4,5 g / L) e L-glutamina (concentração final = 2 mM) em cada poço de uma placa de 6 poços. Em seguida, adicione 0,6 mL de FBS (concentração final = 20% v/v) e 0,6 mL de estoque de MTT (concentração final = 1 mg/mL) em cada poço de uma placa de 6 poços.
2. Transfira os fragmentos de tecido para poços usando uma pinça estéril.
3. Coloque a placa de 6 poços na incubadora. Incubar durante 3 h a 37 °C com 5% de CO₂.
   NOTA: Gire suavemente a placa por 3 s a cada 30 min. A incubação pode ser encerrada assim que a superfície dos fragmentos de tecido ficar roxa ou preto-púrpura.

3. Terminação e fixação

1. Aspirar o meio MTT. Lave os fragmentos de tecido com solução salina gelada.
   NOTA: Repita cinco vezes.
2. Adicione 2 mL de formalina tamponada neutra a 4% (NBF) em cada poço de uma placa de 6 poços.
3. Coloque o prato na geladeira a 4 °C por 1 h.

4. Criosecção

1. Seque os fragmentos suavemente em papel absorvente limpo.
2. Coloque o tecido em um criomoldor cheio de composto OCT.
   NOTA: Certifique-se de que o tecido esteja totalmente coberto com composto OCT.
3. Congele o tecido em uma geladeira de baixa temperatura a -80 °C por 20 min.
4. Monte o bloco congelado em um mandril de criostato a -20 °C.
5. Cortar cortes de 100 μm a -20 °C até que a superfície do tecido fique exposta.
   NOTA: A superfície do tecido exibe uma coloração semelhante a roxa.
6. Recolha fatias de 20 μm utilizando lâminas revestidas com adesivo.
   NOTA: As fatias de tecido devem se apresentar em um tom de roxo, vermelho-púrpura ou preto-púrpura.
7. Fixe as fatias em paraformaldeído (PFA) a 4% em temperatura ambiente por 2 min.
8. Enxágue suavemente as lâminas com PBS por 1 min.
   NOTA: Repita três vezes.

5. Montagem

1. Aplique 1 gota de meio de montagem contendo DAPI (concentração final: 1 μg/mL)..
2. Cubra com uma lamínula.
3. Sele as bordas com esmalte.
   NOTA: As lâminas com bordas seladas podem ser armazenadas a 4 °C no escuro se a microscopia não for realizada imediatamente.

6. Microscopia

1. Visualize depósitos de formazan roxo, vermelho-púrpura ou roxo-escuro (células viáveis) com ampliação de 20× sob campo claro usando microscopia de campo claro.
2. Detectar DAPI azul (núcleos) sob iluminação UV usando microscopia de fluorescência.
3. Mescle canais de campo claro e fluorescência para correlação espacial.
   NOTA: O software usado aqui é o NIS Element F (versão 4.00.06).

Resultados

Este estudo detectou com sucesso células metabolicamente ativas no tecido HCC sem interromper a arquitetura do tecido. Em primeiro lugar, as imagens de campo claro (Figura 1A) mostraram que a superfície do tecido exibia cobertura celular densa e empilhamento multicamadas de células na lâmina, confirmando a integridade arquitetônica preservada do tecido HCC durante a cultura e processamento. Notavelmente, aglomerados de células dentro de regiões superficiais exibiram depósitos distintos de fo...

Discussão

As metodologias atuais para detecção de células viáveis in situ ainda enfrentam limitações multifacetadas. A IHQ e a imunofluorescência (IF), que são amplamente utilizadas para identificar marcadores de proliferação ou proteínas relacionadas à apoptose, sofrem com a ruptura da integridade da membrana induzida pela fixação de formaldeído⁷. Além disso, a penetração de anticorpos em seções de tecido espesso é abaixo do ideal⁸. Sondas ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
-80 ° Freezer C (vertical)	Thermo Fisher Scientific	TSX60086V
Bancada limpa (fluxo laminar vertical)	AIRTECH	SW-CJ-1FD
Incubadora CO2 (165 L)	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i (por exemplo, 51030400 / 51033559)
Coverslip (24 e mais vezes; 50 mm, #1.5)	CITOGLAS (Citotest)	0341-3610
Placa de Petri de cultura (90 mm)	NINHO	752001 (exemplo)
Meio de montagem contendo DAPI	Beyotime	P0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (glicose alta, com piruvato)	Invitrogen (Gibco)	11995-065
FBS (Qualificado, origem nos EUA)	Invitrogen (Gibco)	A3160501
Microscópio fluorescente	Nikon	Série ECLIPSE Ti2
Microtomo congelante (criostato)	Leica	CM1950
Lâminas de microscópio (simples, 25 e vezes; 75 mm)	CITOGLAS (Citotest)	0317-0001
Reagente MTT (pó)	Beyotime	ST316
Esmalte (transparente)	Beyotime	—
NBF (Formalino Buffer Neutro)	Beyotime	—
Composto OCT	SAKURA (Sakura Finetek)	4583
Microscópio óptico (vertical)	Nikon	Série Ci do ECLIPSE (por exemplo, Ci-L)
PBS (500 mL)	Beyotime	C0221A
PFA, 4% em PBS (fixativo)	Beyotime	P0099
Ponta de pipeta (1 mL, ligação baixa)	KIRGEN	KG1313-L
Ponta de pipeta (200 & micro; L)	Axígeno (Corning)	T-200-Y (a granel) / T-200-Y-R-S (racked, estéril)
Pipettor (canal único)	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette F2 (cat# específico da faixa)
Bisturi	HISSTIC	O modelo varia (por exemplo, referência do fornecedor 100022208326)
Pinça	HISSTIC	Modelos variam