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Artigo de método

Superexpressando e purificando uma nuclease tóxica de Escherichia coli

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DOI:

10.3791/68577

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29 de agosto de 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve uma metodologia para superexpressar Nsp15 recombinante, uma nuclease tóxica, em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação da proteína marcada utilizando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Esses protocolos podem ser adaptados para outras proteínas tóxicas desafiadoras.

Resumo

Escherichia coli tem sido amplamente empregada como um sistema de expressão para produzir proteínas recombinantes. No entanto, alguns tipos de proteínas recombinantes, como nucleases, podem ser difíceis de superexpressar recombinantemente em E. coli devido à sua atividade enzimática no DNA ou RNA celular. Esses efeitos tóxicos podem levar a um crescimento lento e baixos rendimentos de proteína. Um exemplo é a endorribonuclease Nsp15 de coronavírus: os rendimentos do coronavírus gama do tipo selvagem (WT) Nsp15 são muito menores do que o Nsp15 cataliticamente inativo. Para resolver esse problema, empregamos o uso de células C41 (DE3) e culturas iniciais de colônia única no mesmo dia para ajudar a reduzir a toxicidade. O Nsp15 recombinante contendo uma etiqueta N-terminal 6xHis foi superexpresso e purificado usando cromatografia de afinidade à base de cobalto seguida de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os rendimentos resultantes de proteína purificada são suficientes para ensaios bioquímicos e estudos estruturais de microscopia crioeletrônica. Essa abordagem provou ser eficaz na mitigação dos efeitos tóxicos e na obtenção de rendimentos satisfatórios de proteína para análises futuras de pesquisa.

Introdução

Escherichia coli (E. coli) é uma bactéria amplamente utilizada para produzir proteínas recombinantes. Numerosas cepas mutantes, incluindo BL21 (DE3) e seus derivados, foram desenvolvidas para expressar proteínas-alvo1. O processo é normalmente conduzido por uma bacteriófago codificada T7 RNA polimerase e induzido com isopropil ß-D1-tiolactopiranosídeo (IPTG), um análogo da lactose que ativará o operon lac liberando o repressor lac 1,2,3. Por não ser hidrolisável, há expressão contínua de mRNA e maior produção de proteínas3.

Embora esse tipo de sistema seja conveniente e consistente para muitas proteínas, alguns tipos de proteínas recombinantes induzem toxicidade em E. coli, levando a baixos rendimentos de proteína. A toxicidade da presença de proteína recombinante afetando negativamente as bactérias pode ser devida à expressão de vazamento antes da indução ou estresse para as bactérias na indução 3,4. O resultado é uma diminuição na taxa de crescimento e viabilidade das bactérias5. A supressão da expressão permeável pode desempenhar um papel importante na expressão bem-sucedida de proteínas tóxicas. Cepas de expressão de E. coli com plasmídeos pLysS (ou seja, BL21 (DE3) pLysS, C41 (DE3) pLysS, etc.) suprimem a expressão de vazamento expressando uma lisozima T7 que inibe a polimerase T7 antes da indução 6,7. Outras cepas, como as cepas C41 (DE3) e C43 (DE3), contêm mutações que reduzem a atividade da polimerase T7 reduzindo seus níveis de mRNA e removem as proteases lon e ompT 1,4,8,9,10. Suprimir a expressão de vazamento ou reduzir a taxa de produção de proteínas recombinantes (via regulação da polimerase T7 ou diminuição das temperaturas) ajuda a aumentar o rendimento de proteínas tóxicas 1,9.

As nucleases são frequentemente proteínas tóxicas e difíceis de expressar ao usar um sistema de expressão de E. coli devido à sua atividade enzimática em relação ao DNA celular ou RNA1. Por exemplo, a endorribonuclease Nsp15 encontrada em coronavírus e outros nidovírus é tóxica para as bactérias, resultando em uma taxa de crescimento mais lenta e baixos rendimentos 11,12,13,14,15,16,17. Devido ao seu papel catalítico, clivando 3 'de uridinas no RNA viral, acredita-se que o Nsp15 atue em seu próprio mRNA e no mRNA celular quando expresso de forma recombinante, o que resulta em desregulação do metabolismo e expressão de proteínas recombinantes11 , 14 . Para Nsp15, a oligomerização é necessária para a atividade enzimática. Estudos anteriores de beta-coronavírus (como SARS e SARS-CoV-2) Nsp15 demonstraram que a enzima oligomeriza principalmente em um homohexâmero em solução, sendo a forma monomérica inativa 16,18,19,20. Quando mutado para formar apenas monômeros, aumentos significativos no rendimento foram observados14. Além disso, ao mutar um dos resíduos catalíticos dentro da tríade catalítica para uma alanina, foi observada uma expressão melhorada nas mesmas condições que o WT, apoiando ainda mais que a toxicidade de Nsp15 para E. coli é impulsionada por sua atividade de nuclease 13,16,17. Neste protocolo, mostramos a diferença no rendimento entre o WT gamma-coronavirus (Infectious Bronchitis Virus) Nsp15 e uma versão catalítica morta obtida pela mutação de um dos resíduos catalíticos de histidina (H223A).

Aqui descrevemos uma metodologia passo a passo para superexpressar Nsp15 recombinante em um sistema de expressão C41 (DE3), seguido de purificação de proteínas por cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. Um His-tag N-terminal 6x com cromatografia de afinidade de metal imobilizado à base de cobalto (IMAC) é empregado para isolar a proteína. A purificação adicional é realizada via SEC para separar Nsp15 por estado oligomérico e isolar as espécies hexaméricas ativas. Essa abordagem oferece um método para superexpressar e purificar nucleases tóxicas para estudos bioquímicos e estruturais.

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Protocolo

1. Preparação para tampão e reagentes

  1. Reagentes de superexpressão
    1. Prepare 1 L de meio 2xTY combinando 16 g de triptona, 10 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio (NaCl) e 900 mL de água deionizada em um frasco defletor de 2 L. Autoclave o balão durante pelo menos 30 min num ciclo líquido.
      NOTA: São necessários pelo menos 2L de mídia 2xTY por purificação.
    2. Preparar estoque(s) de antibióticos apropriado(s) para o plasmídeo. Para Nsp15-pET-14b, faça 15 mL de ampicilina 100 mg / mL dissolvendo 1,5 g de ampicilina com água deionizada em um tubo cônico de 15 mL. Conservar as reservas de antibióticos a -20 °C até serem necessárias.
    3. Prepare 250 mL de meio de ágar Caldo de Lisogenia (LB) combinando 2,5 g de triptona, 1,25 g de extrato de levedura, 2,5 g de NaCl, 3,75 g de agarose e 250 mL de água deionizada em um frasco de vidro de 500 mL. Esterilize a solução em autoclavagem por pelo menos 30 min em um ciclo líquido e esfrie até que esteja quente ao toque.
    4. Prepare placas de ágar LB suplementadas com ampicilina, transferindo 25 mL do meio quente de ágar LB para um frasco Erlenmeyer esterilizado de 250 mL (25 mL por placa a ser feito). Adicione 25 μL de ampicilina 100 mg / mL para cada 25 mL de meio e agite para combinar o conteúdo. Usando uma pipeta sorológica, adicione 25 mL de mistura de mídia a uma placa de Petri de plástico estéril; Evite introduzir bolhas.
      1. Evite a contaminação limpando a bancada do laboratório com 20% de etanol e acendendo um bico de Bunsen para manter a esterilidade ao despejar as placas.
      2. Deixe as placas esfriarem antes de guardá-las a 4 °C até o uso posterior.
    5. Prepare 15 mL de IPTG 1 M dissolvendo 3,574 g de IPTG com água deionizada em um tubo cônico de 15 mL. Conservar a -20 °C até ser necessário. Evite ciclos repetidos de congelamento/descongelamento alíquotas em três alíquotas de 5 mL.
  2. Reagentes de purificação
    NOTA: Todos os reagentes devem ser preparados pelo menos um dia antes da purificação
    1. Prepare 250 mL de tampão de lise (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 5% de glicerol, 5 mM de imidazol) e armazene a 4 ° C.
    2. Prepare 15 ml de tampão de eluição (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM de NaCl, 5% de glicerol, 250 mM de imidazol) e conserve a 4 °C até ser necessário.
    3. Prepare 250 mL de tampão de clivagem (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% de glicerol) e armazene a 4 ° C até que seja necessário.
    4. Prepare 1 L de tampão SEC (20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MnCl2) e filtre através de um filtro PES de 0,22 μm usando filtração a vácuo. Conservar a 4 °C com FPLC.
    5. Prepare 15 mL de cloridrato de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenossulfonil 1 M (AEBSF) dissolvendo 3,595 g de AEBSF com água deionizada em um tubo cônico de 15 mL. Faça alíquotas de 1 mL em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e armazene a -20 ° C até que seja necessário.
    6. Opcional: Prepare a mistura mestre de tampão de carregamento em gel de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) diluindo 200 μL de solução estoque (250 mM Tris pH 6,8, 8% SDS, 0,1% azul de bromofenol, 40% de glicerol, 100 mM DTT) em 400 μL de água deionizada.
    7. Prepare tubos de amostra de gel para rastrear a purificação. Transfira 30 μL de 1x tampão de carga para cada tubo.
    8. Prepare 1 L de tampão de corrida 10x Tris-Glycine dissolvendo 30 g de base Tris, 144 g de glicina e 20 g de SDS, em 1000 mL de água deionizada. Para uma solução 1x, diluir 100 mL da solução 10x em 900 mL de água deionizada em um frasco de 1 L. Armazene ambos os reagentes em temperatura ambiente até uso posterior.

2. Superexpressão de Nsp15

NOTA: Todos os reagentes e materiais devem ser mantidos o mais estéreis possível para evitar o risco de contaminação.

  1. Transformação
    1. Remova as células de E. coli C41 (DE3) de -80 ° C para descongelar por 10 min no gelo. Pipetar 1 μL de DNA plasmidial em um tubo contendo as células C41. Deixe incubar sentando-se no gelo por 30 min.
      NOTA: Embora as concentrações de plasmídeos possam variar, para os dados descritos aqui, 10-20 ng de DNA foram adicionados por transformação. O protocolo comercial para células C41 (DE3) recomenda 10-50 ng de DNA por transformação. Este protocolo é aplicável a qualquer plasmídeo que utilize o sistema promotor T7; no entanto, aqui um plasmídeo pET14b publicado anteriormente que codifica Nsp15 otimizado para códon, com um local TEV seguindo a tag N-terminal 6xHis e o local de clivagem da trombina, foi modificado substituindo SARS-CoV-2 Nsp15 pela sequência IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1, 5989-6324)19.
    2. Colocar o tubo num bloco de calor a 42 °C durante 45 s para dar um choque térmico nas células e absorver os plasmídeos. Incube o tubo no gelo por 2 min.
    3. Pipetar 200 μL de meio de recuperação (SOC ou outro meio rico) no tubo que contém as células C41(DE3) e plasmídeos. Agitar a 210 rpm durante 1 h a 37 °C.
    4. Remover as placas de ágar LB suplementadas com ampicilina a 4 °C e colocá-las numa incubadora sem agitação regulada para 37 °C.
    5. Pipetar bactérias na placa de ágar. Usando um espalhador estéril, espalhe as células na placa de ágar. Coloque a placa em uma incubadora sem vibração ajustada para 37 °C para crescer por 14-16 h.

3. Crescimento

  1. Colheita de colônia única
    NOTA: Iniciadores de colônia única no mesmo dia foram usados em vez de uma cultura inicial durante a noite para inocular células na fase de crescimento logarítmico. Para culturas noturnas, as células estão tipicamente na fase estacionária ou de morte, especialmente com proteínas tóxicas. Além disso, com tempos de cultura mais longos, contaminantes ou mutantes podem superar a nuclease tóxica.
    1. Utilizar um Erlenmeyer esterilizado de 50 ml por cada L de cultura mais 2-3 iniciadores adicionais. Rotular um dos balões com uma estrela para verificações de densidade óptica (OD). A DO recolhida deste balão representará todo o crescimento, a menos que haja uma diferença visual entre os frascos.
      NOTA: Os frascos Erlenmeyer fornecem melhor aeração do que os tubos de partida de 15 mL.
    2. Crie uma mistura principal de 2xTY mais antibióticos apropriados usando um volume de 10 mL x N número de iniciais. Para um crescimento de 4 L, faça 6 culturas iniciais. A mistura principal seria de 60 μL de estoque de ampicilina (descongelado a -20 °C) e 60 mL de 2xTY (diluição 1:1000). Agite para misturar e alíquota de 10 mL em cada Erlenmeyer.
    3. Remova a placa transformada da incubadora. Arranque uma única colônia isolada da placa usando um palito de dente estéril ou uma ponta de pipeta. Transfira o palito com a colônia para um frasco com meio. Repita até que cada frasco contenha um palito.
    4. Colocar os frascos de partida inoculados na estufa agitada a 210 rpm (37 °C). Deixe os frascos iniciais crescerem por ~ 5-7 h.
  2. Inoculação de cultura
    1. Após 5 h, verificar a DO a 600 nm (OD600) do balão marcado com uma estrela com uma microcubeta e um espectrómetro. Remover e transferir 1 ml da cultura do balão para uma microcubeta. Repita as medições periodicamente até que o OD600 atinja 0.8-1.0.
    2. 30 min a 1 h antes da inoculação (quando OD600 atingir 0,4), aquecer os frascos de 2 L 2xTY a 37 °C. O meio quente reduz o tempo de atraso após a inoculação com cultura inicial.
    3. Descongele um estoque de ampicilina de 100 mg / mL a -20 ° C. Uma vez atingido o OD600 alvo, prepare quatro frascos de 2 L com 1 L de meio 2xTY adicionando 1 mL de 100 mg/mL de ampicilina (diluição 1:1000).
    4. Para inocular, deitar o conteúdo de um balão de arranque num balão de 2 l. Repetir até que cada balão de 2 L seja inoculado. Evite derramar o palito no frasco para facilitar a coleta de células.
    5. Colocar os balões de 2 l inoculados na estufa agitada a 210 rpm (37 °C) durante 3 h antes de verificar a primeira DO600.
  3. Indução com IPTG
    1. Verifique o OD600 removendo 1 mL de meio de um frasco com uma pipeta sorológica. Repita até que o OD600 atinja 0,8-1,0.
    2. Uma vez atingido o OD600 alvo, adicionar 1 ml de 1 M IPTG para uma concentração final de 1 mM (descongelada a -20 °C) para induzir a sobreexpressão.
    3. Transferir os balões de 2 L para uma incubadora agitável a 210 rpm a 16 °C para indução durante a noite (14-16 h).
      NOTA: A temperatura mais fria retardará o crescimento das células de E. coli , reduzindo a toxicidade ao diminuir a produção de proteínas e a atividade da nuclease.
  4. Colheita
    1. Remova os frascos induzidos da incubadora agitada e despeje o conteúdo em frascos de centrífuga separados de 1 L. Equilibre as garrafas usando água deionizada. Gire as células a 4500 x g por 10 min a 4 ° C.
    2. Remova o sobrenadante e transfira o pellet para um tubo cônico de 50 mL usando uma espátula. Combine pellets em um único tubo cônico. Conservar a -80 °C até nova utilização.

4. Purificação Nsp15

NOTA: Todos os tampões e tubos devem ser mantidos no gelo. Todas as etapas de centrifugação devem ser realizadas a 4 °C. O protocolo a seguir pressupõe uma proteína marcada com His.

OPCIONAL: Após cada etapa, amostras de gel podem ser coletadas para acompanhar o progresso da purificação.

  1. Lise celular e clarificação de lisado
    1. Ressuspenda o pellet bacteriano adicionando 2 mL de tampão de lise para cada 1,2 g de pellet. Adicione 100 μL de 1 M AEBSF para cada 10 mL de tampão de lise como inibidor de protease. Se estiver usando um pellet combinado de 4 L, adicione 100 μL de DNase I para uma concentração final de 200 U.
      NOTA: Um comprimido de coquetel de inibidor de protease livre de EDTA por L pode ser substituído como um inibidor de protease.
    2. Vortex brevemente o conteúdo do tubo por 30 s para permitir que o pellet e o tampão se misturem. Transfira o pellet em vórtice para um moedor de lenços Dounce. Com um pilão solto, homogeneizar o conteúdo (~ 10 pinceladas).
    3. Transferir a amostra homogeneizada para um copo metálico para sonicação.
      1. Para garantir que a amostra máxima seja obtida, enxágue o tubo contendo o pellet original com 5 mL de tampão de lise e vortex o tubo brevemente. Despeje o conteúdo no homogeneizador Dounce, aplique ~ 5 movimentos e transfira para o béquer de sonicação.
    4. Ao béquer de metal, adicione 75 μL de Triton X-100 para auxiliar na lise e solubilização da membrana. Coloque o béquer de metal em um banho de gelo para garantir que a amostra permaneça fria durante a sonicação.
    5. Colocar a sonda de sonicação no copo metálico e sonicar a amostra durante 6 min e 30 s com impulsos de 2 em 2 s e amplificação a 70%.
      CUIDADO: Use proteção auditiva se a sonda sonicadora não estiver incluída.
    6. Com uma pipeta serológica, transferir o lisado para um tubo de centrifugação. Ao mesmo tubo, adicione 1 M AEBSF a uma diluição de 1:100 como um inibidor de protease fresco. Clarificar o lisado por centrifugação a 26.915 x g durante 50 min.
  2. Cromatografia de afinidade por filtração por gravidade
    NOTA: A resina de cobalto diminui significativamente os aglutinantes metálicos não específicos em comparação com a resina de níquel21.
    1. Durante a sonicação, obtenha 2 mL de pasta de resina de cobalto e ressuspenda com 25 mL de tampão de lise em um novo tubo cônico. Centrifugue a resina ressuspensa por 5 min a 500 x g. Após a centrifugação, despeje o sobrenadante, tomando cuidado para não perder nenhuma resina.
    2. Repita com duas lavagens separadas de tampão de lise de 25 mL seguidas de centrifugação. Não despeje o sobrenadante da última lavagem até que esteja pronto para a ligação em lote. Quando estiver pronto, despeje o tampão de lise da última lavagem da resina e ressuspenda a resina com 10 mL de tampão de lise fresco (10 mL de tampão por 1 mL de resina).
    3. Adicione a fração solúvel ao tubo e deixe a proteína 6x marcada com His se ligar em lote à resina em um balancim por 45 min a 4 ° C.
      NOTA: Se o volume de ligação do lote exceder 50 mL, execute esta etapa em um béquer de 250 mL com uma barra de agitação a uma velocidade muito lenta a 4 °C. Transferir toda a resina para o copo quando se efectuar este passo utilizando o tampão de lise.
    4. Após a ligação dos lotes, despeje o conteúdo em uma coluna de filtração por gravidade e colete o fluxo em um Erlenmeyer de 125 mL. O conteúdo do balão deve ser qualquer proteína que não se tenha ligado à resina; O Nsp15 marcado com His será ligado à resina. Usando um frasco separado para coleta, lave a resina com 8 x 25 mL de tampão para um total de pelo menos 200 mL (~ 5x o volume original) usando uma pipeta sorológica.
      NOTA: Adicione lentamente o amortecedor na lateral da coluna, em vez de diretamente no meio, para evitar perturbar o leito de resina, o que pode levar a uma lavagem ineficiente ou irregular.
  3. Eluição de proteínas
    1. Eluir o Nsp15 marcado com His em três eluições com tampão de eluição. As eluições 1 e 2 são eluições de 2 mL e a eluição 3 é uma eluição de 1 mL.
    2. Realize um ensaio de Bradford "rápido e sujo" fazendo uma diluição de 1:1 do reagente de Bradford em água. Transferir 10 μL de cada eluição para tubos e inverter para misturar. A solução deve ficar azul na presença de proteína. Avalie a mudança de cor para determinar como combinar eluições.
      NOTA: Se as eluições 1 e 2 forem fortes e a eluição 3 for fraca, combine as eluições 1 e 2 e prossiga. Se todos estiverem fracos, combine os três tubos.
  4. Concentração de proteínas e clivagem de tags
    1. Transferir a amostra de eluição combinada para um concentrador MWCO de 30 kD (ou tamanho adequado para a proteína de interesse). Concentre a proteína a ≤2 mL centrifugando a 3.000 x g por 10 min. Transfira a amostra concentrada para um tubo de microcentrífuga de 2 mL. Aumente o volume final da amostra para 2 mL com tampão de clivagem, se necessário.
    2. Prepare uma coluna de dessalinização descartável (por exemplo, coluna PD-10) de acordo com as instruções do fabricante. Adicione a amostra de 2 mL à coluna. Coloque a coluna em um tubo cônico limpo de 50 mL e elua por centrifugação a 1.000 x g por 2 min.
      NOTA: Esta etapa remove rapidamente o imidazol, que interfere na clivagem da trombina, evitando a agregação induzida pela concentração ao usar concentradores MWCO para troca de tampão.
    3. Ao eluído, adicione β-Me e CaCl2, até uma concentração final de 2 mM cada. Adicione 50 μL de um estoque de trombina de 1 U / μL. Depois que todos os componentes forem adicionados, coloque o tubo em um agitador na vertical e deixe a reação incubar em temperatura ambiente por 4 h com agitação suave.
      NOTA: A clivagem noturna a 4 ° C pode funcionar para algumas proteínas; rendimentos aprimorados de Nsp15 foram observados com uma clivagem de 4 h em RT em comparação com uma clivagem noturna de 4 ° C.
    4. Reequilibre a coluna de filtração por gravidade no tampão de clivagem (lave 3x com tampão de clivagem de 25 mL). Certifique-se de que a torneira de parada esteja fechada e adicione 5 mL de tampão de clivagem para evitar que a resina seque. Armazenar a coluna a 4 °C durante o período de clivagem.
  5. Separação da proteína clivada da etiqueta His clivada e da proteína não clivada
    1. Usando uma pipeta sorológica, pipetar cuidadosamente a reação de clivagem diretamente sobre a resina e coletar o eluído em um tubo cônico de 15 mL.
    2. Lave a resina com 2 mL de tampão de clivagem e colete no mesmo tubo de 15 mL. Repita para um total de duas lavagens. Quando terminar, adicione AEBSF ao tubo para extinguir a trombina para obter uma concentração final de 10 mM.
    3. Transferir a amostra de repassagem para um novo concentrador MWCO de 30 kD. Concentre a proteína até ≤500 μL por centrifugação a 3.000 x g por 10 min. Transfira a amostra concentrada para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
  6. Cromatografia de exclusão de tamanho
    1. Execute uma coluna analítica de aumento S200 (ou outra coluna de dimensionamento apropriada para a proteína de interesse) de acordo com as especificações do fabricante. Equilibre no tampão SEC e defina o tamanho da fração FPLC para 500 μL.
    2. Transfira os tubos de fração selecionados dos picos para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e adicione 2,5 μL de DTT 1 M (concentração final de 5 mM) a cada fração para manter o Nsp15 purificado reduzido.
    3. Meça os valores A280 de cada fração usando um nanoespectrofotômetro. Esvazie o instrumento com tampão SEC antes de coletar as medições. Conservar as amostras de Nsp15 purificadas a 4 °C até nova utilização.
  7. Opcional: Verificação de purificação
    1. Aquecer os tubos de amostra de gel num bloco de calor a 95 °C durante 10 min. Centrifugue brevemente os tubos após o aquecimento para reduzir qualquer condensação. Carregue as amostras em gel/s Mini-Protean TGX 4-20% sem manchas e execute a 300 V por 17 min. Fotografe o(s) gel(is) para verificar a pureza.

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Resultados

Devido à toxicidade de Nsp15 como nuclease, um total de ~ 7 h era geralmente necessário para que as culturas iniciais atingissem um OD600 de 0,8-1,0. Uma vez inoculado, um total de ~ 3-5 h era normalmente necessário para o mesmo OD600 ideal de 0,8-1,0 para indução. Nesse caso, o tempo de duplicação parecia ser ~ 1 h. Quando um mutante morto catalítico de Nsp15 foi expresso, a duplicação para as células de E. coli parecia normal (~ 20 min), mais uma evidência de que a atividade da nuclease é...

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Discussão

Apresentamos um protocolo detalhado que resulta na superexpressão bem-sucedida em E. coli de uma nuclease tóxica e purificação usando cromatografia de afinidade e exclusão de tamanho. A implementação de culturas iniciais de colônia única de 10 mL no mesmo dia, em vez de culturas iniciais durante a noite, aumentou a consistência nos tempos de crescimento e na produção de proteínas entre os crescimentos. Optamos por usar células C41 (DE3), que contêm mutações que diminuem a ativid...

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Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo financiamento inicial da Escola de Ciências Naturais e Ambientais da Faculdade de Charleston, Pesquisa de Graduação e Atividades Criativas da Faculdade de Charleston, Pesquisa de Graduação de Verão com bolsa do corpo docente e Subprêmio SC INBRE DRP da P20GM103499.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m PES, Esterilização, Baixa Ligação a Proteínas, Sistema de Filtro, 1 LCorning431098
Inibidor de serina protease AEBSFGoldbio30827-99-7
Ágar bacteriológicoAmrescoJ637
Ä KTA vai sistema de purificaçãoCytiva29383015
Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa Concentrador MWCOMilliporeUFC903024
Ampicilina sódicaGoldbioA-301-25
Frascos de agitação defletoresNalgene F0527
Centrífuga de bancadaEppendorf 5920R
Biofotômetro plusEppendorfE-BP6132
Trombina bovinaBioPharm91-030
Reagente de corante BradfordBoston BioProdutosBPA-200
Azul de bromofenolSigma-Aldrich114931
Cloreto de cálcioSigma-AldrichC4901
Banho seco digitalBio Rad1660562
Espalhadores descartáveis, em forma de LParceiros MedSupply62-1014-1
DitiotreitolGoldbio27565-41-9
DNaseI de pâncreas bovinoSigma-AldrichD4527
Moedor de lenços de papel Douce, 40 mLWheaton357546
Colunas de crotacografia em coluna econo-colunaBio-Rad737-1532
Misturador nutating minimix EnduroContato LabnetS0600
EtanolSigma-Aldrich459844
Excella E25R Inc/Ref ShakerEppendorfNB-E25R
FastPette V2Contato LabnetPág. 2000
Rotor de ângulo fixo Fiberlite F10-4x1000 LEXThermo Fisher Científico096-041075
Rotor de ângulo fixo Fiberlite F21-8x50yThermo Fisher Científico096-084275
Gel Doc EZ ImagerBio-Rad1708270
GlicerolSigma-AlrichG5516
GlicinaBio-Rad161-0718
HEPESSigma-AldrichH3375
Agitador de placa quenteVWR12365-346
Ácido clorídricoVWRBDH3028
ImidazolGoldbioI-902-25
Isopropil-szlig;-D-tiogalactiosídeo (IPTG)Goldbio12481C25
Células de E. coli competentes para Lemo21 (DE3)Biolabs da Nova InglaterraC2528J
Cloreto de manganês (II) tetra-hidratadoSigma-AldrichM3634
Tubos de microcentrífuga, 0,5 mLVWR87003-290
Tubos de microcentrífuga, 1,7 mLParceiros MedSupply15-1151
Tubos de microcentrífuga, 2 mLAxygenMCT-200-C
Célula de eletroforese vertical tetra PROTEANBio-Rad10025025
Géis de trisglicina miniproteana, 4-20%Bio-Rad4568094
MyFuge mini centrfugeParceiros MedSupplyC1008-B
Frasco de centrífuga super-rápida Nalgene 1 LThermo Fisher Científico3141-1006
Tubo de centrífuga Nalgene oak ridgeThermo Fisher Científico31139-0050
NanofotômetroImplen3769
Incubadora sem vibraçãoContato LabnetI 5110 
Superexpressar células C41 (DE3) quimicamente competentesTecnologias de Biopesquisa60442-1
Superexpressar células C41 (DE3) quimicamente competentesSigma-AldrichCMC0017Descontinuado; As células Biosearch C41(DE3) ou células NEB Lemo21 são uma alternativa
Placas de PetriParceiros MedSupply62-1077-3
Plasmídeos (backbone pET-14b)GenscriptPedido personalizado
Micro-cubetas de plásticoFisher Científico14955127
PowerPacfonte de alimentação universalBio-Rad1645070
Agulha deslizante de precisãoBecton Dixon305198
Padrões de precisão mais proteína não coradaBio-Rad1610363
Meio de recuperação para expressão Sigma-AldrichCMR0001K
Rotor de caçamba oscilante S-4x1000EppendorfEP-S4X1
Pipeta sorológica, 10 mLFaclon357551
Pipeta sorológica, 25 mLFaclon35725
Pipeta sorológica, 5 mLFaclon35743
Pipeta sorológica, 50 mLPr1maPR-Sero-50
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888
Dodecil sulfato de sódioSigma-AldrichL3771
Hidróxido de sódioSigma-Aldrich567530
Desmembrador sônicoFisher CientíficoFB505
Centrífuga Sorvall Lynx 4000Thermo Fisher Científico75006580
Coluna Spephadex G-25 M PD-10Cytiva17085101
-MercaptoetanolMillipore444203
Copo de aço inoxidável GriffinLouça Polar13977-010-EA
Tubos Falcon estéreis, 15 mLFalcão352097
Tubos Falcon estéreis, 50 mLFalcão352098
Coluna Superdex 200 10/300 GLCytiva28990944
Seringas, 1 mLTempo de arA1
Seringas, 3 mLBecton Dixon309657
Resina de afinidade metálica TALONTakara635503
PalitosRua da CriatividadePAC3690-01
Base TrisGoldbioT-400-1
Tritão X-100MP Biomédicos807423
TriptonaProdutos de Pesquisa InternacionalT60065
VornadoPonto de referênciaBV101-G
Extrato de leveduraProdutos de Pesquisa InternacionalY20025

Referências

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

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