Artigo de método

Extração de histonas de amostras clínicas para perfilamento epigenético por espectrometria de massa

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 de novembro de 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo permite a extração eficiente de histonas de várias amostras clínicas para análise subsequente de modificações pós-traducionais por LC-MS/MS. Ao facilitar a detecção robusta de modificações chave de histonas, serve como uma ferramenta valiosa para o perfil epigenético abrangente em grandes coortes clínicas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extensas evidências experimentais apoiam o papel dos mecanismos epigenéticos no aparecimento, progressão e recidiva do câncer. Entre elas, variantes de histonas e suas modificações pós-traducionais (PTMs) regulam a organização e dinâmica da cromatina, além da acessibilidade do genoma, influenciando assim processos-chave baseados no DNA, como transcrição, replicação e reparo de danos no DNA por meio do chamado código histona. Padrões desregulados de PTM de histonas são frequentemente observados em cânceres, com alguns marcadores que já demonstraram servir como biomarcadores diagnósticos e prognósticos. Assim, novas metodologias que permitem um perfil PTM de histonas imparcial e abrangente em amostras clínicas são altamente valiosas para caracterizar as paisagens epigenéticas dos tumores. Aqui, apresentamos um protocolo para a extração eficiente de histonas de amostras clínicas, incluindo biópsias congeladas instantaneamente, congeladas à temperatura de corte ideal (OCT) e biópsias com parafina fixada em formalina (FFPE). Essa abordagem fornece proteínas de histonas em quantidade e qualidade suficientes para a subsequente análise de baixo para cima por cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS). Esse fluxo de trabalho permite a detecção e quantificação robusta de modificações chave de histonas, especialmente acetilações e metilações de lisina em amostras primárias de tumor, fornecendo uma camada molecular adicional para a caracterização do câncer.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No núcleo das células eucarióticas, histonas se unem ao DNA para formar os nucleossomos, as unidades estruturais fundamentais da cromatina. Cada nucleossomo consiste em aproximadamente 146 pb de DNA enrolado em torno de um octâmero composto por duas cópias das histonas centrais H2A e H2B, junto com dois dímeros das histonas H3 e H4. Além disso, uma histona ligadora H1 também está presente e facilita a organização da cromatina de ordem superior ao ligar tanto o estiramento do nucleossomo quanto do DNA ligador entre osnucleossomos 1. Histonas são decoradas por uma grande variedade de modificações pós-traducionais (PTMs) que estão presentes principalmente em suas caudas N-terminais. Essas modificações incluem metilação, vários tipos de acilação (acetilação, propionilação, butirilação, etc.), fosforilação, SUMOilação, ubiquitilação, ADP-ribosilação e crotonilação, entre as quais a metilação de lisina e arginina e a acetilação de lisina são as maiscaracterizadas 2. Os tipos, localizações e combinações específicas de modificações de histona criam o que é conhecido como código de histona. Este código consiste em várias modificações pós-traducionais (PTMs) nas caudas N-terminais das histonas, que são adicionadas e removidas por enzimas modificadoras específicas das histonas. Essas modificações são então reconhecidas pelas proteínas efetoras, levando a alterações na estrutura da cromatina, como compactação ou descondensação, influenciando em última instância vários processos biológicos, incluindo reparação de danos ao DNA, replicação e, particularmente, transcriçãogênica 3,4.

A metilação do DNA e as PTMs de histonas estão entre as características epigenéticas mais estudadas nocâncer 3. Evidências experimentais recentes mostraram alterações nos níveis de várias PTMs de histonas em vários tipos de câncer. Notavelmente, a perda de H4K20me3 e H4K16ac foi relatada como sinais do câncer, já que seus níveis foram encontrados como reduzidos em praticamente todos os tumores em comparação com os tecidosnormais. Nosso grupo identificou a perda de H3K14ac como uma possível marca do câncer ao quantificar sua redução em vários tipos de câncer em comparação com contrapartes normais usando abordagens baseadas em espectrometria de massa(EM). Além disso, diversos estudos destacaram o valor prognóstico das PTMs de histonas, mostrando que alterações em seus níveis globais, avaliadas principalmente por imunohistoquímica em biópsias de pacientes, correlacionam com progressão do câncer, classificação histológica e resposta terapêutica 6,7,8. Portanto, a análise de PTM de histonas em amostras de câncer é importante para a identificação de novos biomarcadores diagnósticos e prognósticos, bem como potenciais alvos dos chamadosepifármacos 8.

Métodos muito comuns para a análise de PTMs de histonas em linhagens celulares e amostras clínicas dependem de técnicas baseadas em anticorpos, como imuno-sedimentação, imunohistoquímica e ensaio de imunossorvie ligado a enzimas (ELISA)9. No entanto, métodos baseados em anticorpos apresentam várias limitações, incluindo reatividade cruzada ou, inversamente, mascaramento deepitopos 10. A reatividade cruzada ocorre quando anticorpos se ligam a alvos não intencionais com epítopos semelhantes, levando a possíveis falsos positivos, enquanto o mascaramento de epítopos refere-se à detecção falhada de um epítopo específico (um PTM ou variante de histona, neste caso) devido à presença de outras modificações nos resíduos vizinhos. Além disso, a quantidade de tecido necessária para a análise de modificação de histonas usando anticorpos é frequentemente alta, já que apenas um número limitado de PTMs pode ser detectado simultaneamente, então várias fatias de tecido devem ser processadas para análisesmultiplexadas 11. A espectrometria de massa (EM) surgiu como o método preferido para perfilar PTMs e variantes de histonas, superando as limitações das abordagens baseadas emanticorpos 5,8. A EM baseia-se na detecção de uma diferença de massa (Δm, delta de massa) entre as massas teóricas e medidas experimentalmente de peptídeos e proteínas. É imparcial, abrangente e quantitativa, pois permite a identificação e quantificação de PTMs e variantes sem exigir conhecimento prévio de seu local. Isso torna a EM particularmente valiosa para a análise sensível e precisa das alterações das PTMs de histonas em câncer e outras condiçõespatológicas.

Aqui descrevemos um protocolo otimizado para extração de histonas a partir de amostras clínicas, aliado ao perfilamento baseado em EM de PTMs de histonas, posteriormente chamado de fluxo de trabalho epi-proteômico. As biópsias dos pacientes são armazenadas principalmente como amostras frescas congeladas (FF), amostras congeladas com temperatura de corte ideal (OCT) e amostras embutidas com parafina fixadas em formol(FFPE) 12. Enquanto biópsias frescas são congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido ou isopentano pré-resfriado sem a adição de qualquer meio depreservação 13, as biópsias congeladas em OCT contêm um meio crioprotetor de imersão solúvel em água, composto principalmente por álcool polivinílico e polietilenoglicol, que facilita a fatiagemde tecidos 14. Amostras de FFPE, por outro lado, fixadas em formalina e embutidas em parafina, representam o método de armazenamento mais comum para amostras clínicas, pois podem ser armazenadas em temperatura ambiente por vários anos, evitando manutenções custosas em temperaturas baixas ouultrabaixas 15. Por serem livres de aditivos de conservação, as biópsias congeladas a snap podem ser processadas diretamente para extração de histonas, enquanto biópsias congeladas por OCT e FFPE exigem etapas iniciais de remoção do meio de incorporação/fixação. As amostras de FFPE também precisam de extensa descruzamento de proteínas e recuperação de antígenos.

Este protocolo descreve métodos detalhados para extrair histonas de amostras clínicas frescas congeladas, embutidas em OCT e FFPE, garantindo quantidade e qualidade suficientes para análise posterior da EM, levando em consideração os desafios específicos associados a cada tipo de preservação de amostra (passo 1). Histones purificados de amostras clínicas são separados por eletroforese em gel proteico em condições de desnaturalização (SDS-PAGE), seguido por uma etapa de derivatização e digeridos enzimaticamente para gerar peptídeos de comprimento adequado (4-15 aminoácidos) para análise de espectrometria de massabottom-up 16 (passo 2). Mais especificamente, as histonas são digeridas com uma estratégia semelhante à ArgC, na qual a tripsina, que geralmente corta no C-terminal das lisinas (K) e argininas (R) não modificadas, é induzida a cortar apenas no C-terminal das argininas, devido a uma acilação química anterior de lisinas não modificadas e monometiladas com anidrido propiônico (PRO). Em seguida, peptídeos de histonas digeridos semelhantes ao Arg-C são acilados em suas caudas N-terminais pela adição de feno-isocianato (PIC). Essa derivação adicional aumenta a hidrofobicidade peptídica e permite melhor separação de péptidos curtos de histonas por cromatografia líquida de alta performance em fase reversa (RP-HPLC), melhorando a identificação e quantificação dos peptidoformasisobáricos 17,18 (passo 3). No geral, os métodos descritos aqui destacam o poder do perfil de histonas baseado em EM em estudos de epigenética do câncer.

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Protocolo

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Biópsias de tecidos frescos congelados e congelados por OCT foram obtidas sob consentimento informado de pacientes submetidos a cirurgia no Instituto Europeu de Oncologia (Milão), enquanto biópsias FFPE foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia no Istituto Neurológico Carlo Besta (Milão). Este estudo foi aprovado pelo Comitê Ético do Instituto Europeu de Oncologia (Estudo UID 2550) e pelo Istituto Neurologico Carlo Besta (Estudo CET 39/24).

1. Extração de histonas de tecidos derivados do paciente (Figura 1A)

NOTA: Para analisar histonas de populações representativas de células tumorais e reduzir a variabilidade entre amostras, é recomendável usar biópsias clínicas com célula tumoral de pelo menos 50% e sem áreas necróticas e/ou infiltração imune extensa.

  1. Enriquecimento de histonas a partir de tecidos frescos congelados (duração estimada: 60 min)
    NOTA: Todos os passos devem ser realizados no gelo.
    1. Descongele o tecido no gelo e corte um pedaço de aproximadamente 20-30 mg, geralmente correspondendo a cerca de 2mm3 de tecido.
    2. Transfira a amostra para um tubo de 1,5 mL e triture o tecido em pequenos pedaços usando tesoura (Tabela de Materiais).
    3. Adicione 1 mL de Núcleo Isolante (Tabela 1) recém-suplementado com os inibidores de protease listados na Tabela de Materiais. Misture bem depois.
    4. Transfira a amostra para um homogeneizador de Dounce (Tabela de Materiais).
      NOTA: Na presença de grandes pedaços de papel, use uma ponta p1000 (ao cortar a ponta com tesoura) para coletar melhor a amostra.
    5. Homogeneize o tecido usando primeiro o pilão SOLTO e depois o pilão TIGHT (Tabela de Materiais) até que os pedaços de tecido se tornem invisíveis a olho nu.
    6. Filtre a amostra homogeneizada através de um peneirador celular de 100 μm (Tabela de Materiais) para remover detritos de tecido.
    7. Pipete vigorosamente para cima e para baixo com um p200 para dissolver a membrana plasmática e transferir a amostra para um novo tubo de 1,5 mL.
    8. Faça pellets nos núcleos celulares por centrifugação a 2.300 x g por 15 minutos a 4 °C usando uma centrífuga de bancada (Tabela de Materiais).
    9. Descarte o sobrenadante e resuspenda os pellets nucleares em 50-100 μL de Núcleo Isolante de Tampon, suplementado com SDS de 0,1% para dissolver a membrana nuclear (Tabela de Materiais).
    10. Adicione 250 U de nuclease Benzonase para digerir os ácidos nucleicos, misture bem e incube por 2 minutos a 37°C (Tabela de Materiais).
      NOTA: Se a amostra ainda estiver viscosa, a sonicação também pode ser realizada em banho-maria (ajuste: 10 min 30s LIGADO/30s DESLIGADO; potência: alta; temperatura: 4 °C). Após essa etapa, as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  2. Enriquecimento de histonas a partir de amostras OCT (duração estimada: 90 min)
    NOTA: Este protocolo foi otimizado para quatro/cinco seções OCT de 10 μm de espessura, correspondendo a 20-60 mg de tecido. No entanto, o número de seções de tecido depende do tipo de biópsia clínica e da área total do tecido. Considerando a escassez de amostras clínicas, a extração de uma quantidade menor de tecido inicial pode ser realizada, mesmo que isso possa resultar em uma menor detecção de modificações nas histonas.
    1. Coloque quatro ou cinco seções de tecido com 10 μm de espessura, correspondentes a aproximadamente 20-60 mg de tecido, em um tubo de 1,5 mL.
    2. Lave as seções com 1 mL de EtOH 70% gelado (Tabela 1) por 2 minutos em uma roda giratória (Tabela de Materiais) a 4 °C.
    3. Centrifuge a 16.000 x g por 2 minutos a 4 °C em uma centrífuga de bancada.
    4. Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 um total de 3 vezes.
    5. Reidrate as amostras em 1 mL de água duplamente destilada (ddH2O) com rotação (Tabela de Materiais) por 2 minutos a 4 °C.
    6. Centrifuge a 16.000 x g por 2 min a 4 °C em uma centrífuga de bancada (Tabela de Materiais).
    7. Repita os passos 1.2.5 e 1.2.6 duas vezes com 1x PBS (Tabela de Materiais).
    8. Prossiga para a etapa 1.1.2 do protocolo de enriquecimento a partir de amostras frescas congeladas.
  3. Extração de histonas a partir de amostras de FFPE (duração estimada: 8 h)
    NOTA: O protocolo descrito foi desenvolvido para quatro seções FFPE de 10 μm de espessura, correspondendo aproximadamente a 20-60 mg de tecido. Para a maioria das análises de modificações de histonas em MS, essa quantidade é excessiva e representa um ponto de partida seguro quando o material não é limitante. No entanto, também pode ser usado menos material inicial, o que é particularmente relevante considerando a quantidade frequentemente pequena de tecido disponível ao analisar amostras clínicas. O uso de menos material inicial, embora viável, normalmente reduz a robustez da quantificação para modificações de histonas de baixa abundância (por exemplo, H3K27ac ou peptídeos H3K27/K36 multimetilados), e esse efeito pode variar dependendo do tipo de tecido, assim como de amostra para amostra. No entanto, nosso laboratório já demonstrou anteriormente que o perfilamento PTM baseado em EM pode ser realizado com sucesso a partir de áreas de tecido microdissecadas a laser de amostras de câncer de mama (FFPE), correspondendo a apenas 1.000 células18.
    1. Coloque quatro seções de FFPE de 10 μm de espessura, correspondentes a aproximadamente 20-60 mg de tecido, em um tubo de 1,5 mL.
    2. Adicione 1 mL de agente dissolvente de parafina à amostra e ao vórtice (Tabela de Materiais) na velocidade máxima por 30 s, até que a parafina esteja completamente dissolvida.
      ATENÇÃO: Os reagentes dissolventes de parafina são mutagenos, cancerígenos e inflamáveis, portanto devem ser usados sob um capuz químico.
      NOTA: A dissolução da parafina é alcançada quando as peças de parafina não são mais visíveis a olho nu, e o agente dissolvente da parafina tem uma cor esbranquiçada e homogênea.
    3. Centrifuge 16.000 x g por 3 minutos em RT em uma centrífuga de bancada e descarte o sobrenadante. Para evitar aspiração indesejável da amostra durante a remoção do sobrenadante, a bomba de vácuo/pipetas pode ser tapada com uma ponta menor (por exemplo, pontas p200, p10).
    4. Repita os Passos 1.3.2 e 1.3.3 mais três vezes (4 vezes no total) para garantir a remoção completa da parafina. Alternativamente, pese a amostra completamente desparafinizada para obter uma leitura indicativa da quantidade de tecido processada.
    5. Adicione 1 mL de solução de EtOH a 95% (Tabela 1) e vórtice na velocidade máxima por 30 s, para garantir a ressuspensão completa dos tecidos.
    6. Centrifuge 16.000 x g por 3 minutos em RT em uma centrífuga de bancada e descarte o sobrenadante. Alternativamente, pese a amostra desidratada para ter uma medida indicativa da quantidade de tecido seco processada.
    7. Repita as etapas 1.3.5 e 1.3.6 com 70%, 50% e 20% de EtOH (Tabela 1) e ddH2O para reidratar a amostra.
    8. Adicione 200 μL de buffer de extração (Tabela 1).
      NOTA: Se houver pedaços maiores de tecido presentes, corte-os em pedaços menores com tesoura. Dependendo da quantidade de tecido, volumes menores/maiores de tampão de extração podem ser adicionados para garantir a lise correta da amostra. Para pellets particularmente pequenos ressuspensos em volume de buffer de extração inferior a 100 μL, a sonicação pode ser realizada usando um dispositivo de sonicação (Tabela de Materiais) (30 s ON/30 s DESLIGADO de potência: alta, 10 ciclos).
    9. Homogeneize tecido no buffer de extração por sonicação usando um sonificador digital (Tabela de Materiais) com uma microponta de 3 mm (>15 ciclos, 5s LIGADO/2 min DESLIGADO, potência: 15-30%).
      NOTA: As amostras podem ser consideradas devidamente homogeneizadas quando não há partículas de tecido visíveis na solução e o tampão de extração apresenta uma cor uniforme, não turva. Mantenha as amostras em RT durante os ciclos de sonicação. O gelo pode causar precipitação de SDS no tampão de extração, prejudicando assim a homogeneização dos tecidos. A sonicação adequada é crucial para alcançar a lise completa dos tecidos e a extração de proteínas. Coloque a microponta na altura correta no tubo da amostra (ela não deve tocar o fundo do tubo, liberando partículas plásticas, e não deve estar na interface do buffer de extração de ar, criando espuma e bolhas).
    10. Após a homogeneização, incube as amostras a 95 °C por 45 minutos em um termomisturador. A cada 15 minutos, abra a tampa dos tubos para permitir que o formaldeído evapore.
    11. Incube amostras a 65 °C por 4 horas em um termomisturador. Abra a tampa a cada 20-60 minutos para permitir a evaporação do formaldeído.
    12. Centrifuge 16.000 x g por 1 minuto em RT em uma centrífuga de bancada e transfira o sobrenadante para um novo tubo.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C neste ponto.

Tabela 1: Composição do Buffer. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

2. Resolução de histonas por meio de digestão SDS-PAGE e em gel

  1. SDS-PAGE (Figura 1B; duração estimada: 2 h)
    1. Para avaliar a pureza das histonas e estimar sua quantidade, carregue 1/10 dos extratos de histona em um gel de poliacrilamida a 17% (SDS-PAGE; Tabela 1) ao lado de quantidades conhecidas de histonas recombinantes, como ilustrado na Figura 1B.
      NOTA: Em vez de carregar 1/10 de extratos de histonas, podem ser carregados 15-50 μg de proteínas, medidos por ensaios que toleram altas concentrações de detergente, como o ensaioproteico 19 do ácido bicincônico (BCA). No entanto, observe que o enriquecimento de histonas em relação ao total de proteínas pode variar significativamente entre amostras frescas congeladas, congeladas em OCT e FFPE, e a quantificação da quantidade de histonas só pode ser baseada no SDS-PAGE. 1, 0,5 e 0,25 μg de histona recombinante H3.1 (Tabela de Materiais) podem ser carregados como referência para quantificar a quantidade de histonas com mais precisão.
    2. Misture as amostras com buffer de carga de dodecil sulfato de lítio (LDS), ou com buffers de carga equivalentes para SDS-PAGE (por exemplo, buffer de Laemmli) com a adição de ditiotreitol (DTT; Tabela de Materiais) em uma concentração final de 10 mM.
    3. Desnature amostras a 95°C por 5 minutos em um termomisturador.
    4. Após a separação da proteína na SDS-PAGE, tinga o gel com coloração Coomassie (Tabela de Materiais).
    5. Estimar o rendimento de histonas por quantificação visual ou assistida porsoftware de 20 bandas de histonas em amostras clínicas em comparação com histona recombinante H3 carregada em quantidades conhecidas.
  2. Digestão em gel de histonas (Figura 2; duração estimada: 2 dias)
    NOTA: A digestão semelhante ao ArgC é empregada para análise em EM de PTMs de histonas porque a digestão padrão de tripsina gera peptídeos excessivamente curtos, devido à alta frequência de aminoácidos de lisina e arginina em sua sequência, o que dificulta a detecção de peptídeos por LC-MS e a identificação de PTM. Ao modificar quimicamente as lisinas, a clivagem tripptica nesses sítios é evitada, resultando na clivagem apenas no C-terminal das argininas, produzindo peptídeos mais longos (4-15 aminoácidos) que contêm lisinas modificadas dentro da sequência; de modo geral, esse protocolo facilita a detecção e medição de peptídeos modificados de histonas por EM e tem sido detalhadamente descrito em diversas publicações8,17,21.
    OPCIONAL: Um padrão interno (por exemplo, peptídeos fortemente marcados com spike-in, marcados sinteticamente22) pode ser misturado com amostras de histonas em uma proporção 1:1 para alcançar uma quantificação peptídica mais precisa em MS (Figura 2B).
    1. Carregue de 3 a 5 μg de amostra de histona em um gel de poliacrilamida a 17%, com base na quantificação estimada da histona realizada no Passo 2.1.5 (Figura 2B).
    2. Após o SDS-PAGE, visualize proteínas colorindo o gel com a coloração de Coomassie.
      NOTA: Para evitar contaminação que possa interferir na análise LC-MS/MS, é recomendável realizar as seguintes etapas em um ambiente sem queratina, como um exaustor dedicado, já que a queratina é um forte contaminante de EM.
    3. Bandas de gel de excisa correspondentes ao peso molecular das proteínas centrais das histonas (faixa de gel entre 10 e 18 kDa, considerando o seguinte peso molecular para cada histona central: H3 cerca de 17 kDa, H2A-H2B cerca de 14 kDa, H4 cerca de 11 kDa) usando um bisturi (Tabela de Materiais) e faixas cortadas em pedaços de aproximadamente 1mm 3 cada.
    4. Com a ajuda do bisturi, transfira as peças de gel para um tubo de 1,5 mL.
      NOTA: Para cobrir completamente as peças de gel, os volumes indicados abaixo podem ser aumentados, mantendo a estequiometria do reagente.
    5. Descomprima as peças de gel adicionando uma solução de acetonitrila (ACN) a 50% emddH 2O(Tabela 1). Coloque em um termomisturador ajustado a 1.400 rpm por 10 minutos de RT e descarte o sobrenadante depois.
    6. Repita o Passo 2.2.5 até que as peças de gel estejam completamente desmanchadas.
    7. Desidrate as partes do gel adicionando 100% de ACN (Tabela de Materiais). Incube com mistura a 1.400 rpm por 10 minutos de RT e descarte o sobrenadante depois.
    8. Repita o passo 2.2.7 até que as partes do gel fiquem brancas e duras, ficando completamente desidratadas.
    9. Seque as peças de gel por 5 minutos em RT em uma centrífuga a vácuo (Tabela de Materiais).
      NOTA: Histonas são pobres em cisteínas (apenas duas cisteínas são encontradas na histona H3 nas posições 96 e 110 (UniprotKB ID P68431), e apenas uma cisteína é encontrada na histona H2B na posição 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Além disso, essas cisteínas estão presentes em peptídeos que não podem ser detectados na digestão semelhante ao ArgC em EM de baixo para cima, de modo que adutos químicos dos grupos tiol23 não são um artefato na análise de histonas em EM, e nenhuma etapa de redução e alquilação da cisteína são realizadas no protocolo descrito.
    10. Adicione 15 μL de 7,7 M de solução anidrida propiônica (PRO) (Tabela de Materiais) e 26 μL de 1 M de bicarbonato de amônio (AmBic) (Tabela de Materiais) a cada tubo e incube amostras em um termomisturador ajustado a 350 rpm por 10 minutos a 37 °C.
      NOTA: Como os anidridos dissolvidos em um tampão reativo tendem a evaporar, não prepare uma mistura master de PRO e AmBic, mas adicione-os individualmente a cada amostra, para manter constante a concentração correta de PRO em cada tubo.
    11. Cubra completamente as peças de gel adicionando 1 M AmBic (volume recomendado: 80 μL) e incube amostras misturando a 1.400 rpm por 4 horas a 37°C em um termomisturador. Remova todo o líquido depois.
      NOTA: 1 M AmBic é adicionado para manter um pH básico, ideal para catalisar a propionilação de lisinas não modificadas e monometiladas por PRO.
    12. Lave três vezes com ddH2O, incubando amostras entre as amostras em RT por 10 minutos enquanto mistura em um termomisturador a 1.400 rpm. Descarte o líquido após cada lavagem.
    13. Adicione 50% de ACN e incube em um termomisturador a 1.400 rpm por 15 minutos em RT. Descarte o líquido depois.
    14. Desidrate completamente as peças de gel adicionando 100% de ACN e incube a 1.400 rpm por 15 minutos em RT em um termomisturador. Descarte o líquido depois.
    15. Repita o Passo 2.2.14 até que as peças de gel apareçam brancas e secas.
    16. Peças de gel seco 5 minutos em RT em uma centrífuga a vácuo.
    17. Adicione a cada amostra 4 μL de solução de tripsina (Tabela 1) e 20 μL de tampão de digestão (Tabela 1) e incube por 10 minutos em gelo para permitir a absorção de tripsina em pedaços de gel.
      NOTA: Esta incubação - realizada com solução concentrada de tripsina e tampão de digestão (50 mM AmBic em ddH2O, criando um pH básico ideal para clivagem de tripsina) - permite que a enzima seja absorvida pelas partes do gel antes de sua ativação a 37 °C.
    18. Quando a tripsina concentrada for completamente absorvida, cubra completamente as peças de gel com um buffer de digestão adicional (volume indicativo: 80 μL) e incube a 37 °C durante a noite em um termomisturador.
    19. Para extrair peptídeos digeridos das partes do gel, adicione 100 μL de 100% de ACN e incube a 1.400 rpm por 20 minutos em RT em um termomisturador.
    20. Colete o sobrenadante e transfira para um novo tubo de 1,5 mL.
    21. Adicione 80 μL de 100% de ACN em pedaços de gel e incube a 1.400 rpm por 10 minutos de RT em um termomisturador.
    22. Colete o supernadante e agrupe com o coletado no Passo 2.2.20, depois concentre os peptídeos em uma centrífuga a vácuo até um volume entre 1 e 5 μL.
      NOTA: O uso de uma centrífuga a vácuo permite a evaporação do solvente orgânico (ACN). No entanto, recomenda-se não secar completamente a amostra nesta fase, pois isso pode afetar negativamente a etapa seguinte de derivatização. Se a amostra secar, resspenda-a em ddH2O de água e sonice-a em banho-maria por 5 minutos.
    23. AdicioneddH 2O a cada amostra, a um volume final de 15 μL, depois adicione 2 μL de 1 bicarbonato de trietilamônio M (Tabela de Materiais) e 3 μL de solução de isocianato de fenil (PIC) (Tabela 1) e incube a 350 rpm por 90 min a 37 °C em um termomisturador.
      ATENÇÃO: O PIC é mutagênico e cancerígeno, por isso recomenda-se manuseá-lo sob um capuz químico. Como o PIC é altamente reativo e volátil, recomenda-se evitar preparar uma mistura mestra de bicarbonato de trietilamônio e PIC, mas é recomendável adicionar cada reagente individualmente para garantir a presença exata da concentração de PIC.
    24. Adicione a cada tubo 8 μL de ácido trifluoroacético a 1% (TFA; Tabela de Materiais) para impedir a derivatização com PIC.
    25. Dilua cada amostra com 100 μL de Buffer A (Tabela 1) e carregue-as nas pontas do estágio C18 (preparadas conforme descrito no24 ou adquiridas de diferentes fornecedores).
    26. Centrifuge as amostras a 2.100 x g por 10 minutos a 4 °C em uma centrífuga de rotor oscilante para permitir que peptídeos de histona se liguem à resina C18.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas nas pontas do palco a 4 °C por vários meses.
    27. Adicione 30 μL de buffer de elução (Tabela 1) às pontas de estágio C18 e coloque as pontas em um novo tubo de 1,5 mL. Amostre em centrifugação a 1.000 x g por 10 minutos em uma centrífuga de bancada a 4 °C para eluar peptídeos de histona.
    28. Concentre as amostras em um volume entre 1 e 3 μL usando uma centrífuga a vácuo, depois adicione 1% de TFA para atingir um volume final de 6 μL.
    29. Carregue 5 μL de solução peptídica em uma microplaca de 96 poços para análise de EM (Tabela de Materiais) e a sele com um tapete de vedação (Tabela de Materiais).

3. HPLC-MS/MS e análise de dados (Figura 3)

NOTA: Os parâmetros aqui descritos são adequados para um sistema de cromatografia líquida ESAY-nLC 1200 conectado por meio de uma coluna de pulverização EASY a um espectrômetro de massa Q Exactive Plus Orbitrap (Tabela de Materiais), mas instrumentos semelhantes/equivalentes também podem ser usados, com parâmetros ad hoc.

  1. HPLC-MS/MS (duração estimada: 90 min por amostra)
    1. Injete 3 μL dos peptídeos de histona de 5 μL da etapa 2.2.29 (correspondentes a aproximadamente 0,25-0,8 μg, com base na quantificação de histonas pelo SDS-PAGE) em uma nanocoluna C18 (Tabela de Materiais) a um fluxo constante de 500 nl/min no Buffer A.
    2. Aplique um gradiente linear de 55 minutos de 10%-45% de Tampão B a uma vazão de 250 nL/min para separar os peptídeos.
    3. Adquira os dados MS/MS no modo dependente de dados (DDA) para alternar automaticamente entre MS1 e MS2 usando os pacotes de software dedicados (Tabela de Materiais).
      NOTA: Para aquisição e configurações gerais, consulte a Tabela 2.
  2. Análise de dados RAW MS
    NOTA: Neste protocolo, a quantificação das PTMs de histonas é realizada usando o EpiProfile, um script aberto (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), amigável ao usuário e adequado para análises padrão como as descritas para metilações e acetilações de lisina H3 e H4. No entanto, o EpiProfile pode ser personalizado para realizar análises de modificações menos padrão e sobre diferentes protocolos de preparação de amostras por usuários mais experientes. Por favor, note que o EpiProfile exige uma licença MATLAB paraoperar a 25.
    1. Analise os dados RAW adquiridos com o software EpiProfile 2.0 (versão PRO-PIC)25 (Tabela de Materiais) e quantifique peptídeos de histona selecionando as opções histone_normal, quando a análise for realizada sem rótulos, e histone_SILAC, ao usar o spike-in SUPER-SILAC. Defina ndebug = 0.
    2. Para cada peptídeo de histona (por exemplo, H3_3-8), calcule a abundância relativa (%RA) de cada peptidoforma modificado (por exemplo, H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) dividindo seu cromatograma de íons extraído (XIC) calculado pelo EpiProfile pela soma de todos os XICs calculados para aquele peptídeo.
      NOTA: Opcionalmente, XICs calculados pelo EpiProfile podem ser validados por meio da inspeção dos espectros da MS e quantificação manual dos peptídeos de histonas usando um layout dedicado de espectros, conforme descrito noscapítulos 18,26.
    3. Para cada peptidoforma, calcule a razão leve-pesado (L/H) dividindo o %RA de cada peptídeo nativo leve pelo %RA do peptídeo pesado correspondente derivado da mistura SUPER-SILAC, inserido em cada amostra.
    4. Transforme as razões L/H em uma escala logarítmica. Para destacar diferenças significativas na abundância de peptidoformas entre amostras, é possível realizar uma análise estatística, e as razões L/H em todas as amostras podem ser representadas visualmente como mapas de calor e gráficos de dispersão, como na Figura 4.

Tabela 2: Lista das configurações de Aquisição e da configuração geral empregada para LC-MS/MS com o sistema utilizado neste protocolo. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

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Resultados

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Realizamos extração de histonas de amostras frescas congeladas e congeladas de câncer de mama OCT e de amostras de meningioma FFPE seguindo o protocolo mencionado acima. Como ilustrado na Figura 1A, para amostras congeladas, removemos o OCT, quando presente, e homogeneizamos as amostras em um tampão de isolamento de núcleos contendo um detergente suave (0,1% passo Triton 1.1), permitindo o isolamento dos núcleos. Em seguida, extraímos histonas com a adição d...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método descrito aqui oferece um fluxo de trabalho simples e robusto para isolar histonas de amostras clínicas armazenadas como biópsias congeladas frescas, congeladas em OCT e FFPE para o perfil de suas paisagens de modificação por meio de análise de EM. O protocolo subsequente de preparação da amostra via separação SDS-PAGE e digestão em gel PRO-PIC com tripsina garante a remoção eficaz de detergentes, sais e outros contaminantes daEM33 e alcança uma quantifica...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos cirurgiões e clínicos do Instituto Europeu de Oncologia e do Instituto Neurológico Carlo Besta por fornecerem biópsias de tecido congelado FF, OCT e FFPE. Agradecemos a Roberta Noberini pela discussão científica e metodológica durante a preparação do manuscrito e por nossos financiamentos: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (número da bolsa IG-2023-28767) e Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Químicos
Histolemon RS para HistologiaCarlo Erba4549122,5 L
Acetonitrila (ACN)Carlo Erba4123411L
Bicarbonato de amônio (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Persulfato de acômio (APS)WDR1.012.010.500500 g
Inibidor da protease da aprotininaSigma Aldrich & nbsp;A11535 mg
Nuclease benzonaseMerkE101425 KU
Bisacrilamida 30% 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Buffer A 0,1% ácido fórmico em ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Buffer B 0,1% ácido fórmico / 80% acetonitrila em ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
Resina C18Merck66883-UDiâmetro de 47 mm
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Ditiotreitol (DTT) WDR441496P25 g
EtanolCarlo Erba4146082,5 L
Leupeptina   Inibidor de proteaseSigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′,N′-Tetrametil etilendiamina (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
Buffer de amostra LDS do NuPAGEInvitrogenNP00074x
PBS - Soro salino tamponado com fosfato & nbsp;MicrogemTL1006500 mL
Fenoianato (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Inibidor de protease de fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)Sigma Aldrich & nbsp;P76261 g
Anidrido propiônico (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Histona Recombinante H3.1 HumanoBiolaboratórios da Nova InglaterraM25031 & micro; g/& micro; L
Tripsina de grau sequenciantePromegaV5113100 ug
Inibidor de histona deacetliase do butirato de sódio (NaBut)MerckB58875 g
Dodecilsulfato de sódio (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Bicarbonato de trietilamônioSigma AldrichT7408100 mL
Ácido trifluoroacético (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Detergente Triton X-100Sigma-Aldrich X100RS5 g
Kits / Equipamentos/Software
Microplaca de 96 poçosCorningPCR-96-FS-CNão pirogênica, livre de Rnase/Dnase
EquilíbrioKern19024
Centrífuga de bancadaLaboratório de Biofúgio HareusPico, 23396
Dispositivo de Sonicação BioruptorDiagenodo
Sonificador Digital Branson 250Emerson
Filtro celular 100 & micro; mFalcão352360
Concentrador plusEppendorf5305000509
Dounce Homogeneizador (ex.g  Dounce, Wheaton...)Dounce, Wheaton1 mL de moedor de tecidos
Cromatografia Líquida EASY-nLC 1200Thermo Fisher Scientific
Coluna HPLC C18 EASY-SprayThermo Fisher ScientificES9022 & micro; m, 100  Å, 75 µ m x 25 cm
Script EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Software de Fijihttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Mecanismo de busca MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Pilão A (solto)Dounce, Wheaton
Pestel B (apertado)Dounce, Wheaton
Sistema LC-MS/MS Orbitrap Q Exactive PlusThermo Fisher Scientific
Roda giratóriaThermo Fisher Scientific11496548
BisturiKiato13010
TesouraThermo Fisher Scientific15207266
Tapete de VedaçãoCorningAM-96-PCR-RDAutomação compatível
Centrífuga de rotor oscilanteBeckman coulterAllegra X-15R
Compacto termomisturadorEppendorf5350
VórticePBIVibromix
Software XcaliburThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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