Usando ferramentas de optogenética LEXY e LINuS e análise automatizada de imagens para quantificar a dinâmica de transporte nucleocitoplasmático em células vivas

Resumo

Este protocolo descreve como configurar e realizar com eficiência análises automatizadas de dados de imagem de células vivas obtidos do rastreamento do transporte nucleocitoplasmático por meio de ferramentas optogenéticas.

Resumo

O transporte nucleocitoplasmático (NCT) é essencial para a manutenção da homeostase celular, e sua interrupção está envolvida em várias doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos e esclerose lateral amiotrófica. Isso ressalta a necessidade de desenvolver ferramentas para monitorar e quantificar a NCT. Dentre essas ferramentas, as sondas optogenéticas rápidas e reversíveis, LEXY (light-inducible nuclear export system) e LINuS (light-inducible nuclear location signal), permitem a medição da dinâmica do NCT em células vivas.

As publicações originais descrevem a segmentação manual e a quantificação do sinal da sonda fluorescente no núcleo e no citosol após a transfecção das construções LEXY e LINuS em imagens de células vivas. No entanto, tanto a transfecção quanto a segmentação manual limitam o número de células que podem ser analisadas e estão sujeitas a imprecisões devido a possíveis erros dependentes do usuário. Embora a alta velocidade e reversibilidade fornecidas pela optogenética devam, em princípio, permitir alta sensibilidade na detecção de mudanças na dinâmica do NCT, isso depende dos parâmetros de aquisição e análise de um número suficiente de células.

Portanto, estabelecemos vetores lentivirais que expressam LEXY e LINuS para criar linhagens celulares estáveis, testamos marcadores de imagem ao vivo e condições de controle e implementamos um pipeline de análise de imagem semiautomatizado que permite a análise de centenas de células. Este método de análise usa o software de acesso aberto FIJI, é acessível a iniciantes em bioinformática e não requer configurações avançadas de computador. Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo para configurar o LEXY como um exemplo dessas ferramentas optogenéticas para monitorar a exportação nuclear, desde a preparação das amostras até a aquisição de imagens de células vivas e análise automatizada, enquanto demonstramos como adaptar o protocolo para outras condições, controles ou modelos em qualquer laboratório. Todos os plasmídeos e linhagens celulares utilizados neste protocolo serão disponibilizados à comunidade científica, aumentando ainda mais a acessibilidade do método.

Introdução

A importância do transporte nucleocitoplasmático (NCT) para regular as principais vias celulares e manter a homeostase celular tem sido bem estudada nos últimos anos¹. Em conseqüência, várias ferramentas foram geradas para estudar a dinâmica das NCTs ^2,3,4. Entre essas ferramentas, as sondas optogenéticas LINuS⁵ e LEXY⁶, publicadas respectivamente em 2014 e 2016, fornecem uma maneira poderosa de monitorar NCT em células vivas. Essas ferramentas, projetadas para seguir a exportação induzível (LEXY) ou importação (LINuS) de um repórter fluorescente, são induzíveis pela exposição à luz azul e reversíveis.

Em resumo, essas duas pequenas sondas usam as propriedades do domínio LOV2 da proteína fototropina-1 da planta Avena sativa⁷. Na ausência de luz azul, a hélice Jα do domínio LOV2 é fotoenjaulada e incorporada ao núcleo da proteína. Como a hélice Jα pode responder ao estímulo de luz, a iluminação por luz azul induz uma mudança conformacional e o subsequente desacoplamento da hélice Jα do domínio LOV2. Os autores do LEXY e do LINuS usaram essa sensibilidade à luz para fundir um Sinal de Localização Nuclear (NLS) ou um Sinal de Exportação Nuclear (NES) à hélice Jα, para LINuS e LEXY, respectivamente (Figura 1). A ferramenta resultante é uma sonda que se transloca para o núcleo (LINuS) ou para o citosol (LEXY) após a iluminação da luz azul.

Para rastrear as sondas com imagens fluorescentes, um repórter fluorescente mCherry também foi adicionado às construções. Finalmente, um NES fraco (para LINuS) ou NLS (para LEXY) foi adicionado ao sistema para garantir que as sondas não estivessem em sua localização final antes da iluminação da luz azul, o que impediria a observação da translocação LEXY ou LINuS entre o núcleo e o citosol.

Figura 1: Representação das sondas LEXY e LINuS. Ambas as sondas consistem em uma proteína mCherry fundida ao domínio LOV2 sensível à luz. A diferença entre as duas ferramentas reside na sequência de sinalização oculta pela hélice Jα: um NES para LEXY e um NLS para LINuS. Ambas as sondas também possuem uma sequência de sinal fraca para controlar sua localização inicial: um NLS fraco para LEXY e um NES fraco para LINuS. A ativação dos sistemas por iluminação de luz azul, portanto, induz sua exportação para LEXY ou sua importação para LINuS, permitindo que os usuários monitorem a exportação ou importação nuclear. Abreviaturas: LEXY = sistema de exportação nuclear induzido por luz; LINuS = sinal de localização nuclear induzível por luz; NLS = sinal de localização nuclear; NES = sinal de exportação nuclear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A localização da fluorescência mCherry relata o transporte das sondas LEXY e LINuS entre os núcleos e o citosol e, portanto, pode ser acompanhada em imagens de células vivas, permitindo que os usuários monitorem o NCT. Além de serem usados como sondas simples, LEXY e LINuS também podem ser projetados para controlar a localização e estudar proteínas de interesse, in vitro ^5,6,8,9 ou in vivo ^10,11.

O método de quantificação proposto nas publicações LEXY e LINuS mostra a intensidade nuclear relativa das sondas. A análise sugerida é feita manualmente e depende da medição de uma Região de Interesse (ROI) no núcleo e no citosol. Embora esse método forneça uma boa representação do sinal da sonda ao longo do tempo, ele é muito longo e tedioso, especialmente quando experimentos e condições são repetidos. É importante ressaltar que esse método também carece de precisão, pois apenas uma pequena parte do compartimento projetado é representada.

Aqui propomos um novo protocolo para quantificação de sinais fluorescentes LEXY e LINuS. Implementamos técnicas automatizadas, que facilitam as análises e proporcionam maior precisão. Isso facilitará o processo para novos usuários dessas ferramentas e ajudará a aumentar a taxa de transferência. Nosso protocolo de quantificação usa apenas uma interface, o plug-in TrackMate¹² de código aberto da FIJI. Notavelmente, para melhorar a confiabilidade das quantificações, usamos um marcador de DNA vermelho distante compatível com imagens ao vivo para realizar a segmentação de todo o núcleo com StarDist¹³, uma rede neural convolucional treinada, combinada com rastreamento e medição do sinal fluorescente da sonda com TrackMate¹².

Os dados obtidos podem então ser facilmente exportados para a planilha fornecida e pronta para uso (Tabela Suplementar S1) para obter a intensidade nuclear relativa de cada núcleo identificado. Este protocolo também explica como agrupar os valores obtidos em um gráfico ajustando a curva de curso de tempo obtida a um modelo monoexponencial, como em Yoo e Mitchison¹⁴ e como calcular a taxa de transporte para as diferentes condições testadas. Com este protocolo e a planilha fornecida para análise, os usuários poderão quantificar facilmente os dados de imagem de células vivas, mesmo com habilidades limitadas de bioinformática.

Protocolo

NOTA: O protocolo a seguir é descrito para monitorar a exportação nuclear com a sonda LEXY. Detalhes sobre as configurações a serem ajustadas para LINuS são apresentados na seção 5.

1. Cultura de células

NOTA: O procedimento nesta seção deve ser realizado em uma capa de grau de cultura de tecidos. As etapas descritas abaixo foram otimizadas para a linha celular de fibroblastos de camundongo NIH / 3T3¹⁵ , usando DMEM (ou DMEM sem vermelho de fenol quando indicado), suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina como meio (consulte a Tabela de Materiais). No entanto, os usuários podem adaptar o procedimento para outros tipos de células. O protocolo é adequado para células transfectadas ou linhas celulares estáveis. No entanto, recomendamos a criação de linhagens celulares estáveis, conforme mencionado na seção de discussão.

1. Prepare a solução de revestimento com 23 μg/mL de colágeno e 2 μg/mL de fibronectina em 1x PBS estéril. Adicione 800 μL da solução de revestimento a cada placa de imagem ao vivo (consulte a Tabela de Materiais) e mantenha na incubadora por 90 min.
2. Lave a mistura de revestimento com PBS 1x estéril e semeie 60.000 células nas placas de imagem ao vivo na mídia, para uma aquisição no dia seguinte.
3. Se necessário, transfecte as células com o plasmídeo LEXY de acordo com o método de transfecção que melhor se adapte ao tipo de célula usado. Para seguir este protocolo, execute uma co-transfecção da sonda com um vetor vazio para aumentar a eficiência, na proporção de 1:5 para LEXY:vetor vazio. Proteja as células da luz em uma caixa escura ou com papel alumínio e deixe-as crescer por um dia.
4. Antes da aquisição, core as células com um marcador de DNA vermelho distante compatível com imagens de células vivas, em um meio sem vermelho de fenol, e certifique-se de que estejam completamente protegidas da luz até a aquisição.
   NOTA: No nosso caso, usamos SiR-DNA¹⁶ a 1 μM, incubado por pelo menos 1 h antes das aquisições.
5. Para controlar a exportação, use o inibidor de exportação nuclear Leptomicina B¹⁷ a 0,5 nM (inibição leve da exportação) e 1 nM (forte inibição da exportação), aplicado às células 1 h antes das aquisições.

2. Exames de imagem

NOTA: As aquisições podem ser feitas com um microscópio confocal compatível com imagens ao vivo, que tem a capacidade de criar um padrão de aquisições escolhidas e uma iluminação a laser pulsátil de 458 nm. Nossa imagem foi realizada no escuro em uma câmara de 37 °C (com 5% de CO₂) de um microscópio confocal com varredura ressonante. A configuração é otimizada com a objetiva de 20x, permitindo assim a aquisição simultânea de imagens simultâneas de várias células no mesmo campo de visão. A sequência de imagem é composta por três fases, como na Figura 2.

1. Fase estável
   1. Realize uma aquisição de sinais mCherry (LEXY, laser de 561 nm) e vermelho distante (SiR-DNA, laser de 633 nm) a cada 15 s e repita 10x, por uma duração total de 150 s. Certifique-se de que nem o branqueamento nem a translocação de LEXY para o citosol sejam observados neste ponto.
      CUIDADO: Uma iluminação do sistema com luz azul nesta fase ativaria o LEXY, o que induziria imediatamente sua exportação para o citosol.
2. Fase de iluminação
   NOTA: Esta fase é composta por três etapas, repetidas 15x.
   1. Realize iluminação pulsátil com luz azul (laser de 458 nm), com pulsos de 36 ms repetidos 150x, por uma duração total de ~5 s.
   2. Realize uma aquisição de sinais fluorescentes mCherry (LEXY, laser de 561 nm) e vermelho distante (SiR-DNA, laser de 633 nm).
   3. Pausa de 15 s.
3. Fase de recuperação
   1. Realize uma aquisição de sinais mCherry (LEXY, laser de 561 nm) e vermelho distante (SiR-DNA, laser de 633 nm) a cada 15 s, repita 25x, por uma duração total de 375 s.
      NOTA: Esta etapa é opcional e pode ser removida se os usuários quiserem observar apenas a exportação do probe e não a recuperação.

Figura 2: Configuração das três fases do LEXY. Para monitorar a exportação nuclear com o LEXY, três fases devem ser configuradas no software do microscópio. A parte superior indica a configuração a ser usada para as aquisições de imagens de células vivas da LEXY. Essa configuração consiste em uma fase estável, para garantir que o sinal seja estável no núcleo, uma fase de iluminação, para induzir a translocação de LEXY do núcleo para o citosol, e uma fase de recuperação, para observar LEXY voltando ao núcleo. A parte inferior da figura indica os resultados esperados com imagens de células vivas. Em vermelho, o mCherry indica a localização de LEXY. Em cinza, o SiR-DNA cora o núcleo das células. Barras de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Análise para LEXY

NOTA: Toda a análise de segmentação e rastreamento é feita usando FIJI, com TrackMate¹², um plugin Fiji de código aberto (versão necessária detalhada na Tabela de Materiais).

1. Instale o FIJI e baixe os plug-ins StarDist¹³ e TrackMate. Para instalar os plug-ins, vá para Ajuda | Atualização ... | Gerenciar sites de atualização e marque CSBDeep, StarDist e Trackmate-StarDist e clique em Aplicar alterações. Reinicie Fiji.
2. Enquanto alguns microscópios podem tomar cada fase de aquisição (Stable-Illumination-Recovery) juntas, outros (por exemplo, o microscópio confocal referenciado) as salvam separadamente. Portanto, uma etapa adicional, se estiver usando esta configuração, é concatenar as fases: abra as imagens das três sequências, execute a função concatenar para compilar as três fases de lapso de tempo em um único arquivo: clique em Imagem | Pilhas | Ferramentas | Concatenar....
3. Selecione a fase estável como Image1, a fase de iluminação como Image2 e a fase de recuperação como Image3. A imagem resultante é uma única imagem para o lapso de tempo das três fases, com os canais mCherry (canal 1) e SiR-DNA (canal 2) fundidos.
4. Guarde a imagem obtida para a etapa posterior de segmentação e salve-a: vá para Arquivo | Salvar como | Tiff....
5. Divida o canal mCherry sozinho para as seguintes análises: vá para Imagem | Cor | Divida os canais e salve-o: vá para Arquivo | Salvar como | Tiff....
6. Para verificar se há um eventual branqueamento durante a aquisição, execute o comando Plotar perfil do eixo Z no canal mCherry: vá para Imagem | Pilhas | Plote o perfil do eixo Z. Na tabela gerada, clique em Dados | Copie o ^1º Conjunto de Dados e cole-o na planilha pronta para uso fornecida com este protocolo (Tabela Suplementar S1), abaixo da célula de perfil do eixo Z.
7. Desenhe uma região circular de interesse (ROI) do tamanho médio de um núcleo e salve-a: vá para Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI.... Adicione o ROI e salve-o: vá para Mais | Salvar...
   NOTA: O mesmo ROI deve ser usado para medir o plano de fundo para todas as condições analisadas.
8. Coloque o ROI salvo em uma região sem células durante todo o lapso de tempo e meça a intensidade média dentro desse ROI com a função de interface ROI. Primeiro, certifique-se de que o valor médio de cinza esteja marcado clicando em Analisar | Definir medidas. Em seguida, clique em Mais | Multi medida. Marque Meça todas as 50 fatias e uma crua por fatia e clique em ok.
9. Copie e cole todos os valores exibidos na planilha fornecida (Tabela Suplementar S1), abaixo da célula "Plano de fundo do ROI".
10. Em Fiji, feche a imagem apenas com o canal mCherry e selecione a imagem salva anteriormente com os canais mCherry e SiR-DNA mesclados.
11. Abra o plug-in TrackMate: vá para Plug-ins | Rastreamento | Companheiro de Trilha.
12. Verifique se o número de pontos de tempo está correto (0 a 49 se as fases propostas foram seguidas) e clique em Avançar.
13. Selecione o detector StarDist e clique em Avançar.
14. Selecione o canal 2 (SiR-DNA) para segmentar os núcleos e clique em Avançar. Aguarde alguns segundos para que o processo de segmentação seja concluído. Inspecione visualmente se a segmentação obtida corresponde à borda dos núcleos e clique em Avançar (Figura 3). Em caso de segmentação imprecisa, anote o identificador de núcleo correspondente (SpotID) para excluí-lo de uma análise mais aprofundada na etapa 3.26.
15. Deixe os parâmetros padrão e clique em Avançar na janela de configuração inicial de limite . Esta janela fornece o número de pontos segmentados (núcleos) entre os 50 pontos de tempo.
16. Definir filtros em spots: criar e definir filtros:
    1. Crie dois filtros com intensidade média ch1 como parâmetro para remover núcleos com sinal muito intenso ou muito fraco, o que poderia distorcer as análises: um filtro para selecionar valores acima do limite definido e outro para selecionar os valores abaixo do limite. Defina o valor para remover apenas o sinal muito baixo ou saturado.
       NOTA: Esses filtros podem não ser necessários se forem usadas linhas celulares estáveis. Observe esses valores, pois eles precisam ser reaplicados para todas as condições.
    2. Crie dois filtros Área para remover objetos indesejados (detritos, células moribundas ou em divisão) das análises: um filtro para selecionar valores acima do limite definido e outro para selecionar os valores abaixo do limite. Clique em Avançar.
       NOTA: Reaplique esses valores para todas as condições.
17. Selecione um rastreador: escolha Rastreador LAP simples e clique em Avançar.
18. Selecione os parâmetros para o rastreamento. Ajuste a distância máxima de vinculação (aqui, 30 μm) - a distância máxima que será permitida para vincular objetos entre quadros. Use a distância máxima de fechamento de folga (aqui, 15 μm) e a folga máxima de quadro de fechamento de folga (aqui, 3) para definir quantos pontos de uma única pista podem ser omitidos sem excluir essa mesma trilha. Clique em Avançar (Figura 3).
    NOTA: Esses parâmetros propostos foram otimizados para nossa configuração e modelo celular usando uma abordagem de tentativa e erro e podem precisar ser ajustados experimentalmente.
    A distância máxima de ligação precisa ser ajustada para evitar o desalinhamento de um núcleo para outro, especialmente se as células se moverem muito.
19. Após os cálculos, clique em Avançar e defina os filtros nas faixas. Para selecionar apenas os núcleos que foram rastreados durante todo o curso de tempo (50 pontos de tempo com a sequência proposta), selecione o maior número de pontos na trilha (coloque o cursor em mais de 49 para a sequência proposta). Clique em Avançar.
    NOTA: Isso facilitará a análise, mas só é possível se núcleos suficientes tiverem sido rastreados durante todo o curso de tempo, se não: veja a discussão.
20. Opções de exibição: marque Exibir nomes de pontos para poder retraçar cada núcleo em análises posteriores. Personalize os recursos exibidos de acordo com as preferências do usuário.
21. Na parte inferior da página, clique em Faixas | Exporte para CSV para salvar a tabela com todas as medidas. Feche a tabela e clique em Avançar.
22. Opcionalmente, plote as feições de trilha com T (tempo) como o eixo X e a intensidade média do ch1 para o eixo Y. Clique em Feições de plotagem. Feche o gráfico e clique em Avançar.
    NOTA: Isso dará aos usuários uma ideia da tendência geral da exportação. Neste ponto, não é normalizado para o fundo e a intensidade inicial.
23. Clique em Capturar sobreposição como ação e Executar | ESTÁ BEM. A imagem gerada será utilizada para identificar os núcleos quantificados. Salvar: vá para Arquivo | Salvar como | Tiff....
24. Em um arquivo de planilha, importe o arquivo CSV obtido com o TrackMate: Na guia Dados , no grupo Obter e transformar dados , clique em Do texto/CSV e em Importar.
25. Selecione todas as quatro colunas a seguir clicando na letra correspondente e copie e cole-as na parte superior da planilha fornecida (Tabela Suplementar S1), colunas A a D, com o plano de fundo: ID do ponto (B), ID da faixa (C), Quadro (I), intensidade média ch1 (M).
    NOTA: Certifique-se de que o início das medidas coladas comece na linha 6 da Tabela Suplementar S1. Se não for esse o caso, as medições podem ser deslocadas de uma ou mais células e, portanto, incorretas. Consulte a planilha da Tabela Suplementar S2 para obter um exemplo da disposição esperada.
26. Classifique os resultados em ordem alfabética primeiro por TrackID (núcleo individual) clicando na seta na célula B5 e Frame (ponto de tempo) clicando na seta na célula C5.
27. Para remover o ruído de fundo, subtraia os valores obtidos na etapa 3.8 de cada valor obtido em Intensidade média ch1 (pré-calculado na planilha fornecida, consulte a Tabela Suplementar S1).
28. Para normalizar o sinal de LEXY, calcule a intensidade média do sinal fluorescente mCherry na fase estável (quadros 0 a 9). Em seguida, divida todos os resultados obtidos em Intensidade média ch1 pela intensidade média da fase estável (pré-calculada na planilha fornecida, consulte a Tabela Suplementar S1).
    NOTA: O número obtido é a intensidade fluorescente nuclear média de LEXY. Todas as medidas já são exibidas por núcleos da coluna L e podem ser plotadas em um gráfico.

Figura 3: Análise do TrackMate usando FIJI. Na parte superior, a representação esquemática do TrackMate analisa, na parte inferior, imagens obtidas a partir das análises FIJI. A primeira representação à esquerda mostra a coloração de SiR-DNA não segmentada, um marcador do núcleo, em cinza. O segundo painel representa a segmentação automática realizada com o canal SiR-DNA por Stardist. Os núcleos são coloridos de acordo com a intensidade do canal mCherry, para facilitar a visualização e a etapa final. O terceiro painel mostra as trilhas obtidas pelo rastreamento da coloração de SiR-DNA nos pontos de tempo de toda a sequência de imagem de células vivas. O último painel à direita mostra o sinal fluorescente do LEXY, em vermelho, na área definida pela segmentação, que será medido para cada ponto de tempo. Barra de escala = 50 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Taxa de transporte, estatísticas e números

1. Plote o gráfico de intensidade nuclear relativa.
   1. Abra o GraphPadPrism e crie uma planilha: clique em Inserir ou importar dados para uma nova tabela e, nas opções, selecione os tempos decorridos para X e o número máximo de núcleos segmentados para os valores replicados em subcolunas lado a lado para Y. Clique em Criar e cole os dados obtidos na tabela.
   2. Para os valores X (tempo), se os parâmetros das aquisições foram mantidos conforme sugerido, copie e cole a coluna em 'tempo' na planilha fornecida. Caso contrário, ajuste os valores de acordo com os parâmetros utilizados.
   3. Para criar o gráfico da intensidade nuclear relativa, vá para a seção Gráficos. Selecione XY como a família de grafos e Pontos e linha de conexão com barras de erro como o tipo de grafo.
   4. Na seção Plotar , selecione Média, Erro e SEM e clique em OK para ver os gráficos. Altere as escalas e visuais de acordo com os parâmetros escolhidos.
2. Ajuste a intensidade nuclear relativa a um modelo monoexponencial.
   1. Na seção Tabela de dados , clique em Nova tabela de dados.
      1. Selecione Insira os valores X como X e Insira e plote um único valor Y para cada ponto como Y e clique em Criar.
      2. Na coluna X , relate os tempos em decimais apenas para as fases estável e de iluminação; se os parâmetros sugeridos de aquisições foram mantidos, copie e cole a coluna em 'tempo decimal' na planilha fornecida, Tabela Suplementar S1.
      3. Cole os valores obtidos como intensidade nuclear relativa na tabela, apenas para as fases estável e de iluminação.
      4. Na seção Resultados, selecione a seguinte análise: Análises XY | Exponencial | Regressão não linear (ajuste de curva) e clique em OK.
      5. Nos parâmetros, selecione Platô seguido por um decaimento de fase como Modelo e, nos parâmetros de restrição, selecione uma constante igual a 2,25 como X0 (o tempo inicial da iluminação), uma constante igual a 1 como Y0 (intensidade nuclear relativa no início da iluminação), uma constante igual a 0 para o platô (os valores para os quais a intensidade nuclear relativa deve se apoiar), e indicar que K (a taxa de exportação) deve ser maior que 0. Deixe os outros parâmetros no padrão. Clique em OK.
      6. Na seção Resultados , a linha K indica todas as taxas de exportação para os núcleos da condição testada.
      7. Repita as etapas 4.2.1 a 4.2.1.5 para as outras condições, se necessário.
3. Crie o gráfico de taxa de exportação.
   1. Crie uma nova tabela: selecione Insira os valores X como X e Insira e plote um único valor Y para cada ponto como Y e clique em criar.
   2. Para cada condição (em colunas), cole e transponha os valores de K obtidos na etapa anterior.
   3. Para criar o gráfico da taxa de exportação, vá para a seção Gráficos , selecione coluna como família de gráficos e, na seção Caixa e violino , selecione Gráfico de violino como tipo de gráfico, com Gráfico de violino. Mostrar todos os pontos como plotagem. Clique em OK para ver o gráfico. Personalize a maneira de representar os dados, se necessário.
   4. Para executar um teste estatístico para a taxa de exportação, execute um teste t de Welch bilateral, conforme descrito em Yoo e Mitchison¹⁴, seguindo as próximas etapas:
      1. Na tabela que contém as taxas de exportação de todas as condições, clique em Analisar | Comparação de grupos | Teste T (e testes não paramétricos), selecione as condições a serem testadas e clique em OK. Marque Não pareado, Sim usar teste paramétrico e Teste t não pareado com correção de Welch. Não assuma SDs iguais e clique em OK.
   5. Observe os resultados da análise na tabela da seção Resultados e relate o gráfico de taxa de exportação, se necessário.

5. Adaptações para LINuS

NOTA: O protocolo descrito acima pode ser facilmente adaptado para monitorar a importação nuclear com LINuS aplicando as seguintes alterações.

1. Cultura de células
   1. Em vez de leptomicina B na etapa 1.5, use importazol¹⁸ como inibidor nuclear, a uma concentração de 10 μM por 1 h antes da aquisição.
2. Imagiologia
   1. Para ter uma importação ideal do sistema, substitua as 150 repetições de pulsos de iluminação de 36 ms pelo laser de 458 nm na etapa 2.2.1 por 250 repetições para uma duração total de ~ 9 s.
      NOTA: o tempo de sequência pode ser dependente do tipo de célula, e os parâmetros para ambas as sondas podem precisar de ajuste para serem ideais, uma vez que os sistemas dependem do reconhecimento de NLS e NES, que são específicos do tipo de célula^19,20.
3. Taxa de transporte, estatísticas e números
   1. Em vez de ajustar uma curva a um platô seguido por um decaimento de fase na etapa 4.2.1.5, selecione o platô seguido por uma análise de associação de fase .
   2. Restrinja X0 a 2,25, Y0 como 1 e K (a taxa de importação no caso de LINuS) maior que 0.
      NOTA: As análises do LINuS com o TrackMate são idênticas às do LEXY. A intensidade nuclear relativa ainda é o valor medido e analisado, mas em vez de observar uma diminuição devido à exportação da sonda, deve-se observar um enriquecimento do sinal fluorescente no núcleo após a iluminação da luz azul.

Resultados

O protocolo acima mencionado deve permitir que os usuários visualizem a localização e a translocação da sonda durante a aquisição em imagens de células vivas. Um exemplo das imagens esperadas adquiridas para visualizar a exportação nuclear com LEXY é mostrado na Figura 4. Uma rápida diminuição do sinal do núcleo e um enriquecimento no citosol devem ser observados após algumas rodadas de iluminação de luz azul. Uma recuperação progressiva do sinal da sonda pode ser visível após a interrupção dos ciclos de iluminação. Para controlar o sistema, a leptomicina B, um inibidor de exportação, atesta que uma mudança na exportação pode ser visualizada com as análises, pois impede que o LEXY seja exportado com iluminação de luz azul (Figura 4).

Figura 4: Visualização do sinal de LEXY ao longo do tempo. Captura de pontos de tempo representativos das fases estável, de iluminação e de recuperação, adquiridos com imagens de células vivas. A condição de metanol representa a condição de controle. Após a iluminação pulsátil da luz azul, em vermelho, o sinal fluorescente mCherry, repórter da localização do LEXY, é translocado do núcleo para o citosol. Depois de parar a iluminação, o sinal é recuperado no núcleo. O tratamento com o inibidor de exportação Leptomicina B a 1 nM ou 0,5 nM mostra a ausência ou diminuição da exportação de LEXY quando a exportação é bloqueada. Barra de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Em relação às análises, enquanto os valores da curva de intensidade nuclear relativa durante a fase estável devem estar em torno de 1, após a ativação da luz azul, eles devem apresentar uma diminuição lenta até atingir um platô no final da fase de iluminação (Figura 5A). Se a diminuição for muito rápida ou muito lenta, os parâmetros de aquisição podem ser otimizados (veja a discussão). O tratamento com leptomicina B em concentrações suficientes também pode confirmar que as análises e a técnica são sensíveis o suficiente para mostrar que a exportação nuclear está completamente bloqueada, com valores relativos de intensidade nuclear estáveis em torno de 1 para todo o experimento. As concentrações intermediárias de leptomicina B, no entanto, devem exibir uma exportação nuclear leve (Figura 5A). Estas observações visuais devem ser confirmadas quantitativamente com a obtenção da taxa de exportação (figura 5B).

Figura 5: Intensidade nuclear relativa esperada de LEXY e taxa de transporte. (A) O gráfico representa a intensidade nuclear relativa do sinal fluorescente de LEXY ao longo do tempo, normalizada para a intensidade média mCherry da fase estável. A intensidade nuclear relativa da condição de metanol (controle, vermelho) diminui pela metade após a iluminação, em contraste com as células tratadas com o inibidor de exportação Leptomicina B, na concentração de 0,5 nM (azul claro) ou 1 nM (azul escuro). Barras de erro: MEV. (B) Taxa de exportação das condições controle e Leptomicina B, obtida pelo ajuste da curva a um modelo monoexponencial. Os valores obtidos quando a exportação é bloqueada pela leptomicina B são significativamente menores do que a condição de controle. N = 18 células para metanol (vermelho), 19 células para leptomicina B 0,5 nM (azul claro) e 15 células para leptomicina B 1 nM (azul escuro). Os valores de p foram calculados por um teste t de Welch bilateral. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Planilha com cálculos pré-definidos. Esta planilha é fornecida para facilitar a análise. Os valores de intensidade obtidos com o TrackMate podem ser copiados e colados diretamente na planilha para obter os valores de intensidade nuclear relativa normalizados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: Exemplo dos resultados esperados para uma condição de controle da análise de LEXY. A planilha representa um exemplo dos valores obtidos para uma condição de controle da linhagem celular estável de LEXY. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Conforme mencionado no protocolo, a criação de linhagens celulares estáveis melhora muito a qualidade das análises. Primeiro, ter 100% das células expressando as sondas aumenta o número de núcleos rastreados e analisados, o que fortalece a robustez das análises. Em segundo lugar, reduz a morte celular induzida pela superexpressão das sondas e pela toxicidade dos reagentes de transfecção utilizados. E, finalmente, reduz a forte heterogeneidade dos sinais fluorescentes entre as células. Este parâmetro é importante, pois um sinal saturado não permitirá a detecção adequada da mudança de intensidade após a iluminação. A mesma conclusão é verdadeira para sinais fracos, que podem branquear ou não permitir a quantificação de diferenças. Portanto, recomendamos primeiro testar as sondas por transfecção para garantir que funcionem corretamente, configurando os parâmetros de aquisição e, em seguida, criando rapidamente linhagens celulares estáveis. Criamos vetores de lentivírus para as sondas LEXY e LINuS, que estão disponíveis para compartilhamento mediante solicitação, bem como as linhas estáveis NIH/3T3 LEXY ou LINuS criadas com esses lentivírus.

Se as sondas forem transfectadas ou se as células forem esparsas, os parâmetros sugeridos provavelmente diminuirão o número de rastros detectados e as análises serão menos robustas. Se for esse o caso, os usuários podem ser mais permissivos com os pontos omitidos no rastreamento, diminuindo o filtro Número de pontos nos trilhos (sugerimos manter pelo menos 45 dos 50 pontos). Cuidado: se este filtro for diminuído, o arquivo Excel fornecido (Tabela Suplementar S1) deve ser ajustado manualmente: de fato, os valores colados do CSV importado não levarão em consideração as lacunas. O usuário precisa descobrir onde estão os pontos ausentes com o número do TrackID e correlacioná-los com o número do núcleo, o que geralmente leva algumas rodadas de copiar e colar.

Um parâmetro crítico para garantir o sucesso do experimento é manter as células no escuro. Como as sondas reagem à luz azul, os usuários devem garantir o transporte das células no escuro por pelo menos 30 minutos antes da aquisição. Uma pequena caixa fechada ou usando alumínio para cobrir o prato é suficiente. Da mesma forma, é necessário ter muito cuidado para usar apenas a luz mCherry para procurar as células no microscópio, pois a iluminação com luz azul ativa as células. Se uma eventual iluminação ocorrer sob o microscópio, procure outro campo distante para a aquisição. Plotar o perfil do eixo Z na etapa 3.6 ajudará a saber se as células foram impactadas por uma iluminação, se a curva está diminuindo em vez de ser um platô.

A sequência de imagem é configurada para consistir em três fases. Primeiro, a fase estável, para avaliar o branqueamento potencial, mas também para garantir que a localização do LEXY seja estável sem ativação (1). Em segundo lugar, a fase de ativação, que consiste em rodadas de iluminação de luz azul pulsátil, para induzir a translocação de LEXY do núcleo para o citosol (2). Finalmente, a fase de recuperação opcional, onde o sinal volta progressivamente à sua localização inicial no núcleo (3).

A sequência descrita para aquisições pode ser específica do tipo de célula^19,20. Para o primeiro experimento, o usuário deve testar e modificar a potência e os tempos do laser para ver o sistema se translocar progressivamente entre o núcleo e o citosol. É importante ressaltar que uma potência de laser muito forte, como uma pausa muito curta, pode impedir uma translocação progressiva, mas sim uma queda / enriquecimento brutal (dependendo da sonda usada) da intensidade do mCherry após a iluminação.

Se a otimização da sequência não resolver o problema, é provável que o NES e/ou NLS não sejam adequados para o tipo de célula usado. Os usuários podem consultar o artigo⁸ do método LINuS para projetar e modificar as sondas. Os usuários também podem consultar este artigo para obter imagens do LINuS com um microscópio de epifluorescência.

A segmentação dos núcleos é uma etapa crítica da análise. Um marcador nuclear robusto e confiável deve ser usado para imagens de células vivas das sondas. Como a iluminação com luz azul ativa a translocação da sonda e como as sondas são monitoradas com a proteína fluorescente mCherry, esse marcador deve ser visível no espectro vermelho distante ou próximo. No nosso caso, usamos SiR-DNA que cora as células durante 1 a ~ 24 h de incubação, mas usar SPY-DNA 650 também é uma opção (consulte a Tabela de Materiais para referências).

Por fim, se a segmentação com StarDist combinada com o rastreamento filtrado do TrackMate comprovar sua eficiência, é importante observar que o usuário deve sempre verificar visualmente os resultados da segmentação e da quantificação. Uma célula em divisão ou moribunda pode ser incluída na quantificação, o que não deveria. Para reduzir os riscos de análise de tais eventos, a planilha Excel fornecida atribui um código de cores à intensidade nuclear relativa (azul = valores baixos, vermelho = valores altos). Ao inspecionar as cores antes de plotar os valores no GraphPad Prism, o usuário deve ser capaz de notar quaisquer valores incomuns. Por exemplo, as intensidades nucleares relativas do LEXY devem variar de altas (vermelho, grandes quantidades da sonda nos núcleos) durante a fase estável a baixas (azul, quantidades reduzidas da sonda nos núcleos) no final da fase de iluminação, antes de voltar a valores altos (vermelho), na fase de recuperação (conforme exibido na Tabela Suplementar S2).

Este protocolo apresenta várias vantagens em relação aos métodos propostos anteriormente ^5,6. O pipeline semiautomático facilita a análise do transporte nucleocitoplasmático LEXY e LINuS e fornece mais precisão do que a quantificação manual proposta anteriormente ^5,6. O uso de nosso protocolo permitirá que iniciantes na área realizem análises eficientes, mas também fornecerá uma nova ferramenta para usuários experientes, que precisarão de apenas uma interface de acesso aberto para realizar análises semiautomatizadas do transporte nucleocitoplasmático.

Este método pode ser usado para outras aplicações além do estudo da taxa de transporte nucleocitoplasmático global em linhagens celulares NIH3T3. De fato, com algumas etapas de otimização, ele pode ser adaptado para estudar a taxa de transporte da sonda em vários tipos de células ou animais vivos⁸. Além disso, ao fundir uma proteína de interesse para LEXY ou LINuS, também é possível estudar sua taxa de transporte ou os efeitos a jusante de sua translocação induzida por luz para dentro ou para fora do núcleo. Por exemplo, é possível sequestrar uma proteína no citoplasma com LEXY, ou forçar sua localização no núcleo com LINuS 5,6,21,22,23. Finalmente, as análises descritas também podem ser estendidas a mais aplicações do que LEXY e LINuS, para rastrear qualquer sinal que se transloque entre compartimentos subcelulares que podem ser segmentados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagénio	Sigma-Aldrich	08-115
Microscópio confocal	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Distinguir-se	Microsoft
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F1141
Software FIJI	FIJI		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Placas fluoradas	Dutscher	Rolamento FD3510-100	Alternativa: Câmara de attofluor (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1	GraphPad Software, Inc.
Importazol	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomicina B	Sigma-Aldrich	L2913
Plasmídeo LEXY	Addgene	72655	pDN122
Plasmídeo LINuS	Addgene	61347	pDN77
Pencillin-estreptomicina	Gibco	15140-122
DMEM livre de vermelho de fenol	Gibco	21063-029
SiR-DNA	Espirocromo	SC007	Alternativa: SPY-DNA650 (Espirocromo #SC501)
Plugin Stardist 2D	StarDist		StarDist_0.3.0
Plug-in TrackMate	Companheiro de Trilha		Companheiro de Trilha-7.14.0