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Artigo de método

Metodologia para o Estudo da Aprendizagem e Memória em Ratos Juvenis Usando Anestesia com Sevoflurano para Avaliar a Expressão de p-CREB e c-fos do Hipocampo

402 vistas

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DOI:

10.3791/68591

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19 de setembro de 2025

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo investiga como o sevoflurano prejudica a retenção de memória e reduz a expressão de p-CREB e c-fos em neurônios do hipocampo através da via NMDAR/p-CREB/c-fos em ratos juvenis. Os resultados mostram que o sevoflurano causa déficits de memória de curto prazo e regula negativamente os marcadores de plasticidade sináptica, com efeitos reversíveis após 3 dias, independentemente da frequência de dosagem.

Resumo

O estudo das deficiências cognitivas durante o desenvolvimento do cérebro enfrenta desafios devido à natureza dinâmica do neurodesenvolvimento, restrições metodológicas e barreiras contextuais. Este estudo investigou uma abordagem metodológica integrada para estudar as deficiências cognitivas no cérebro em desenvolvimento causadas pelo sevoflurano com base na memória e na expressão de p-CREB e c-fos em neurônios do hipocampo através da via de sinalização NMDAR/p-CREB/c-fos em ratos juvenis. Sessenta e quatro ratos machos SD de 21 dias de idade (peso corporal <80 g) foram divididos em cinco grupos: normal (n=8), 60% O2 (n=16), treinamento simulado (n=8), sevoflurano em dose única (n=16) e sevoflurano em dose múltipla (n=16). Os dois grupos de sevoflurano foram subagrupados em sacrifício de 1 dia (grupos sev1a e sev1b) e 30 dias (grupos sev30a e sev30b) após o treinamento (n=8/subgrupo); Todos os outros ratos foram sacrificados 1 h após o treinamento. O teste do labirinto em Y foi utilizado para avaliar a aprendizagem e a retenção de memória. A imuno-histoquímica foi usada para determinar o número de neurônios p-CREB- e c-fos-positivos nas amostras do hipocampo. Em comparação com o grupo 60% O2 (retenção de memória de 86,33% ± 17,52%), a memória dos ratos nos grupos sev1a e sev1b apresentou uma diminuição significativa (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; todos P<0,05), enquanto os grupos sev1b e sev30b não apresentaram diferenças significativas (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; todos P>0,05). Em comparação com o grupo 60% O2 (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89), a expressão de p-CREB e c-fos nos neurônios do hipocampo diminuiu no grupo sev1a (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) e no grupo sev30 (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) (todos P<0,05), enquanto os grupos sev30a e sev30b não apresentaram diferenças significativas (todos P>0,05). O sevoflurano tem um efeito estimulante negativo de curto prazo na capacidade de manutenção da memória de ratos juvenis sem impacto com base na frequência de dosagem. O sevoflurano diminui a expressão de p-CREB e c-fos nos neurônios do hipocampo de ratos juvenis.

Introdução

O estudo das deficiências cognitivas durante o desenvolvimento do cérebro enfrenta desafios significativos devido à natureza dinâmica do neurodesenvolvimento, restrições metodológicas e barreiras contextuais. O desenvolvimento cerebral envolve mudanças rápidas e não lineares, dificultando a identificação de deficiências durante janelas críticas 1,2. Em ambientes com poucos recursos, barreiras como alfabetização do cuidador, diversidade linguística e acesso limitado a ferramentas especializadas (por exemplo, ressonância magnética) dificultam a triagem precoce1. A variabilidade individual na maturação cerebral dificulta a distinção de desvios patológicos do desenvolvimento típico 2,3. Condições como a síndrome de Down exibem desenvolvimento cortical alterado, mas amostras pequenas e dados histológicos escassos limitam os insights mecanicistas4. Os transtornos do neurodesenvolvimento (por exemplo, TEA, TDAH) geralmente ocorrem concomitantemente com ansiedade ou depressão, confundindo as avaliações cognitivas5. Déficits graves de comunicação em algumas populações restringem o uso de testes padronizados6. Esses recursos levam a vários problemas de design de pesquisa. De fato, a maioria dos estudos usa desenhos transversais, falhando em modelar a mudança dentro do indivíduo ao longo do tempo. Há uma dependência excessiva de populações ocidentais e educadas (amostras "WEIRD")7. A pesquisa da síndrome de Down sofre de pequenas amostras cerebrais post-mortem e controles inadequados de pareamento por idade4. As ferramentas de avaliação ecológica momentânea lutam para explicar as variáveis contextuais que afetam o desempenho cognitivo diário5.

As funções mais importantes no cérebro animal e humano incluem aprendizado e memória, que são centrais para o desenvolvimento humano e a vida em geral8. O cérebro dos bebês está em fase de desenvolvimento e é vulnerável a fatores externos como drogas e anestesia 9,10. Os danos causados pelos anestésicos à função de memória dos lactentes é um tópico crucial da pesquisa clínica e pode até atrasar os tratamentos ideais para pacientes pediátricos devido à incapacidade de realizar anestesia11. Disfunções cognitivas relacionadas à anestesia (ou disfunção cognitiva pós-operatória, DCPO) podem ter consequências a longo prazo para os bebês12. A inalação de sevoflurano pode afetar as funções de memória em lactentes13,14, mas a anestesiologia tradicional acredita que o dano cerebral em lactentes é causado principalmente por hipóxia cerebral durante a anestesia, especialmente na anestesia geral10. Portanto, desde que não haja hipóxia de curto ou longo prazo no cérebro, o risco de lesão do sistema nervoso central em lactentes deve ser reduzido11. Ainda assim, a compreensão do POCD permanece abaixo do ideal. Bebês que necessitam de cirurgia precisarão de anestesia, e um melhor conhecimento das vias envolvidas pode ajudar a projetar estratégias de anestesia que minimizem o risco de DCPO.

Um estudo envolvendo pacientes idosos submetidos a cirurgias não cardíacas revelou que quase 25% dos pacientes apresentaram DCPO dentro de 1 semana após a cirurgia, e a proporção diminuiu para menos de 10% após 3 meses, enquanto o grupo controle apresentou taxas de DCPO de 3,4% e 2,8%15. O estudo também indicou que a maioria dos casos de DCPO era reversível, com apenas um pequeno número de pacientes apresentando DCPO prolongada ou permanente15. No sistema nervoso central, o glutamato é o aminoácido excitatório mais comum16. O receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) é crucial para a indução e manutenção da potenciação de longo prazo (LTP) e depressão de longo prazo (LTD)17. Pesquisas em camundongos mostraram que a plasticidade sináptica excitatória afeta diretamente o desenvolvimento da função cerebral18, sendo a ativação do NMDAR e o influxo de cálcio particularmente importantes19,20. A atividade aumentada do NMDAR tem implicações significativas para induzir o crescimento sináptico e a plasticidade19,20. Portanto, um maior grau de bloqueio de NMDAR por antagonistas de NMDAR (por exemplo, sevoflurano) deve resultar em menores habilidades de aprendizado e memória21. Embora os efeitos do sevoflurano no aprendizado e na memória em cérebros adultos não tenham chegado a uma conclusão clara22,23, o sevoflurano é comumente usado para anestesia em cirurgias pediátricas14. Como um antagonista não competitivo do NMDAR, o sevoflurano pode afetar significativamente as funções de aprendizagem e memória do cérebro 11,13,14,23,24. No entanto, além do NMDAR, outras vias e proteínas estão envolvidas no aprendizado e na memória, e os mecanismos de regulação da memória envolvendo a proteína de ligação ao elemento de resposta fosforilada do cAMP (p-CREB) e o gene c-fos precoce imediato estão se tornando mais claros 25 , 26 , 27 , mas ainda requerem uma melhor compreensão para a administração ideal da anestesia em bebês e crianças.

Com base nesses referenciais teóricos, o presente estudo investigou uma abordagem metodológica integrada que poderia ser usada para estudar prejuízos cognitivos no cérebro em desenvolvimento causados pelo sevoflurano com base na memória e na expressão de p-CREB e c-fos em neurônios do hipocampo através da via de sinalização NMDAR/p-CREB/c-fos em ratos juvenis. Os resultados podem ajudar a melhorar nossa compreensão da DCPO e do comprometimento da memória após anestesia geral. Este estudo utilizou ratos de 21 dias de idade porque eles haviam acabado de ser desmamados e tinham um peso corporal e estado fisiológico altamente uniformes, correspondendo ao início da adolescência em humanos. Devido à sua neuroplasticidade e vulnerabilidade aumentadas durante esse período crítico de desenvolvimento, eles podem modelar com eficiência as deficiências cognitivas causadas por cirurgia ou anestesia no cérebro imaturo 28,29. Isso os torna particularmente adequados para estudar os riscos neurocognitivos associados à cirurgia pediátrica e explorar possíveis estratégias de intervenção. O labirinto em Y é um método comumente usado para avaliar o aprendizado e a memória30. A imuno-histoquímica é comumente usada para estudar neurônios e várias proteínas neuronais.

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Protocolo

Todos os protocolos deste estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Xinhua, Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (aprovação nº. XHEC-C-2016-023-2).

1. Visão geral experimental dos animais e agrupamento

  1. Obter 64 ratos SD machos com 21 dias de idade (peso corporal inferior a 80 g).
  2. Divida os ratos em cinco grupos: grupo normal (n = 8), grupo 60% O2 (n = 16), grupo de treinamento simulado (n = 8), grupo de dose única de sevoflurano (n = 16) e grupo de dose múltipla de sevoflurano (n = 16) (ver Tabela 1).
  3. Alojar os ratos em uma instalação de animais a 20-24 ° C com 50% -60% de umidade e luz natural.
  4. Forneça comida e água adequadas.
  5. Certifique-se de que todos os protocolos sejam revisados e aprovados pelo Comitê de Ética.
  6. Preparar a câmara de inalação (ver Figura suplementar S1, detalhada no ponto 2.1).
  7. Grupo normal
    1. Expor os ratos a 60% de ar durante 2 h (detalhado na secção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 1 dia após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  8. 60% O2 grupo
    1. Expor os ratos a 60% de ar durante 2 h (detalhado na secção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 30 dias após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  9. Grupo de treinamento simulado
    1. Expor os ratos a 60% de ar durante 2 h (detalhado na secção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 1 dia após a exposição sem treinamento estruturado (as luzes e os locais das zonas de choque variaram aleatoriamente), usados para controlar os efeitos da luz e dos estímulos elétricos no aprendizado e na memória (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  10. Grupo sevoflurano em dose única (grupo sev1a)
    1. Exponha os ratos a 60% de ar + 3% de sevoflurano por 2 h (detalhado na seção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 1 dia após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  11. Grupo sevoflurano de dose única (grupo sev30a)
    1. Exponha os ratos a 60% de ar + 3% de sevoflurano por 2 h (detalhado na seção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 30 dias após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  12. Grupo sevoflurano em dose repetida (grupo sev1b)
    1. Exponha os ratos a 60% de ar + 3% de sevoflurano por 2 h por dia, durante 7 dias consecutivos (detalhado na seção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 1 dia após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).
  13. Grupo sevoflurano de dose repetida (grupo sev30b)
    1. Exponha os ratos a 60% de ar + 3% de sevoflurano por 2 h por dia, durante 7 dias consecutivos (detalhado na seção 2.2).
    2. Realize o teste do labirinto em Y 30 dias após a exposição (detalhado na seção 4).
    3. Colete tecido após o teste comportamental (detalhado na seção 5).

2. Inalação de sevoflurano

  1. Preparação da câmara (ver figura suplementar S1)
    1. Conecte o orifício à esquerda da caixa a 60% O2/40% N2.
    2. Conecte o suprimento de oxigênio ao vaporizador de sevoflurano.
    3. Conecte o orifício à direita da caixa ao analisador de gás de uma máquina de anestesia.
    4. Conecte o orifício na parte superior da câmara aos resíduos de gás.
    5. Coloque cal abaixo da malha na parte inferior da câmara e adicione algodão.
    6. Coloque a configuração em uma hotte.
    7. Coloque uma almofada de aquecimento sob a câmara.
  2. Inalação
    1. Ligue o suprimento de oxigênio e o vaporizador de sevoflurano.
    2. Ajuste o fluxo de oxigênio para 2 L/min.
    3. Quando a concentração de sevoflurano atingir 3,0%, mantenha o fluxo por 30 min para estabilizar a atmosfera na câmara.
    4. Coloque um rato no lado de algodão da câmara.
    5. Mantenha o rato lá de acordo com o agrupamento (ver passo 1.2).
    6. Monitore a cor da pele, frequência respiratória, frequência cardíaca e oximetria de pulso.
    7. Remova o rato.
    8. Deixe o rato despertar naturalmente.
    9. Devolva o rato à sua gaiola.

3. Reagentes e instrumentos experimentais

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare 250 mL de sevoflurano disponível comercialmente para administração anestésica.
    2. Preparar a solução de trabalho do anticorpo p-CREB diluindo o anticorpo de reserva 1:350.
    3. Preparar a solução de trabalho do anticorpo c-fos diluindo o anticorpo de reserva a 1:200.
    4. Monte o kit para coloração imuno-histoquímica.
    5. Prepare paraformaldeído a 4%.
      1. Dissolver 40 g de paraformaldeído solúvel (PFA) num recipiente de vidro com 500 ml de água de alta pureza, aquecer continuamente e agitar magneticamente até 60-65 °C até formar uma suspensão leitosa.
      2. Adicionar gotas de NaOH 1,0 mol/L até que a solução fique límpida (pH = 7,0).
      3. Adicione aproximadamente 500 mL de PBS e misture bem em um banho de gelo ou banho de água fria.
      4. Verificar novamente o pH, filtrar e completar o volume de 1000 ml.
      5. Conservar a 4 °C para utilização futura.
  2. Configuração do equipamento
    1. Posicione o labirinto em Y na área de teste comportamental (consulte a Figura S2 suplementar).
    2. Calibre o microscópio com um sistema de imagem integrado para análise histológica.
  3. Instale o micrótomo com lâminas novas para seccionamento de tecidos.
  4. Programe a máquina de desidratação com o protocolo padrão de processamento de tecidos.
  5. Prepare a máquina de coloração com os banhos de coloração sequenciais de acordo com as instruções do fabricante da máquina.
  6. Configure o aparelho de perfusão.
    1. Use dois frascos de solução salina embalados em plástico, drene a solução salina da abertura inferior e encha-os com PBS e fixador de paraformaldeído a 4%.
    2. Pendure os frascos, conecte-os com conjuntos de infusão e prenda uma torneira de três vias na extremidade grossa da agulha do conjunto de infusão.

4. Labirinto em Y e teste de aprendizagem/memória

  1. Monte o labirinto em Y
    1. Configure o labirinto em Y com três braços retangulares rotulados como I, II e III, conectados por uma junção triangular (consulte a Figura Suplementar S2).
    2. Coloque uma grade elétrica com espaçamento de 1 cm na parte inferior do labirinto.
    3. Prenda tiras finas de cobre de 2 cm nas paredes do labirinto para simular áreas perigosas e instalar luzes de sinalização de estímulo.
  2. Defina áreas perigosas e seguras
    1. Eletrifique as regiões I, II e III a 16.000 V/m para indicar áreas perigosas (a luz de sinalização acende quando eletrificada).
    2. Marque as regiões não eletrificadas com uma luz vermelha para indicar áreas seguras.
    3. Defina a junção entre os braços como uma área não segura onde o rato pode receber um choque elétrico.
  3. Procedimento de treinamento
    1. No início do experimento, considere a área onde o rato está localizado como a área segura.
    2. Após 2-4 min, aplique eletricidade na área segura, incentivando o rato a se mover em direção à zona segura.
    3. Se o rato se mover da área segura para uma área perigosa, ele retornará à zona segura sob choque elétrico, exibindo uma resposta passiva de evitação.
  4. Desenvolvendo a resposta de evitação ativa
    1. Após várias sessões de treinamento, acenda a luz na área segura sem aplicar choques elétricos.
    2. Observe o movimento do rato em direção à área segura iluminada, formando um reflexo condicionado de discriminação claro-escuro (resposta de evitação ativa).
  5. Coloque o labirinto em Y em uma área mal iluminada e silenciosa para minimizar as distrações externas.
  6. Realize treinamentos diariamente entre 9:00-11:00 e 14:00-16:00.
  7. Permita que os ratos se movam livremente dentro do labirinto por 5 minutos antes do experimento para ajudá-los a se adaptar ao ambiente do labirinto.
  8. Ajuste os parâmetros de estímulo
    1. Ajuste a tensão de estímulo (16.000 V/m) durante o teste para garantir que os ratos escapem dentro de 10 s após receberem um choque elétrico.
    2. Mantenha a luz de sinalização da área segura acesa por 15 s e desligue-a.
    3. Comece a próxima rodada de experimentos de choque após um intervalo de 45 s.
  9. Sequência de luz de sinal e resposta correta
    1. Defina a sequência de acender a luz de sinalização conforme I → II → III → I, em um ciclo.
    2. Defina uma resposta correta como o rato escapando da área inicial diretamente para a zona segura iluminada dentro de 10 s após receber um choque elétrico.
  10. Considere que o rato atingiu o padrão de aprendizado se fizer a resposta de fuga correta em 8 de 10 tentativas consecutivas.
  11. Registre qualquer fuga para um braço sem luz como uma resposta incorreta.
  12. Várias sessões de treinamento e teste
    1. Realize várias sessões de treinamento e teste para avaliar o aprendizado e a memória.
    2. Registre o número de respostas corretas e incorretas durante um número fixo de tentativas.
    3. Altere a área inicial para aumentar a complexidade da tarefa.
  13. Avalie a retenção de memória em intervalos (por exemplo, 24 ou 48 h após o treinamento) para avaliar a capacidade de retenção de memória dos ratos.

5. Imuno-histoquímica

  1. Anestesie os ratos
    1. Administre uma injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10% (0,4 mL / 100 g) 1 h após o treinamento para anestesiar os ratos. Descarte a solução de hidrato de cloral de acordo com os regulamentos locais.
    2. Realizar toracotomia para expor totalmente o coração31.
  2. Perfundir ratos anestesiados com solução fisiológica
    1. Insira uma agulha contendo PBS no ventrículo esquerdo na direção da aorta, prenda a agulha com uma pinça hemostática e abra imediatamente a aurícula direita do camundongo para liberar sangue venoso.
    2. Injete rapidamente PBS até que o efluente esteja limpo e o fígado e os pulmões pareçam brancos.
    3. Em seguida, aplique uma infusão rápida e lenta de 500 mL de solução de formalina a 10% até que o corpo do animal enrijeça, conseguindo a fixação da formalina.
    4. Descarte a solução de formalina de acordo com os regulamentos locais.
  3. Remova o cérebro
    1. Abra rapidamente o crânio32.
    2. Remova todo o cérebro levantando-o suavemente do crânio e cortando os vasos sanguíneos e a medula espinhal na base, sem danificar os hemisférios (como mostrado na Figura Suplementar S3).
  4. Dissecar o hipocampo
    1. Dissecar o hipocampo bilateral.
      1. No forame occipital do camundongo, corte todo o cérebro com uma tesoura.
      2. Insira cuidadosamente uma tesoura diagonalmente no forame magno para cortar o osso parietal.
      3. Separe os dois lados do osso parietal com uma pinça hemostática.
      4. Use uma tesoura para cortar o nervo óptico de um lado e sondar até a base do crânio.
    2. Coloque o hipocampo em solução de formalina a 10% por 12 h.
    3. Mergulhe a amostra em formalina contendo um gradiente de sacarose (10%, 20%, 30%).
    4. Mantenha durante a noite a 4 ° C até que o tecido da amostra afunde para o fundo.
  5. Incorpore e corte a amostra
    1. Incorpore a amostra em parafina. Descarte a solução de formalina de acordo com os regulamentos locais.
    2. Corte a amostra incorporada a 4 μm.
  6. Desparafinizar e reidratar as seções
    1. Mergulhe as seções em 50 mL de xileno três vezes para desparafinização, cada vez por 15 min.
    2. Mergulhe sequencialmente em 50 mL de etanol a 100%, 90%, 70% e 50% por 10 min cada.
    3. Enxágue três vezes com 50 mL de PBS 0,01 mM por 3 min cada.
  7. Recuperação de antígeno
    1. Coloque as seções em 50 mL de tampão citrato (PBS, pH 6,0).
    2. Aqueça as seções em uma panela de pressão de aço inoxidável a 120 °C. Coloque as seções em um rack, totalmente imerso no buffer. Feche a panela, aqueça e mantenha sob alta pressão por 3 min.
    3. Retire o fogão do fogo e deixe esfriar naturalmente em temperatura ambiente antes de abrir a tampa.
    4. Enxágue as seções em PBS (pH 7,2) por 2 min, repetindo 3 vezes.
    5. Aplique aproximadamente 100-200 μL de 3% H2O2 para cobrir a seção na lâmina e incube em temperatura ambiente por 5-10 min para eliminar a atividade da peroxidase endógena.
    6. Enxágüe com PBS por 2 min, 3 vezes.
  8. Incubação primária de anticorpos
    1. Adicione 200 μL de anticorpos primários (diluídos 1:150 em 0,01 mol / L PBS) às seções.
    2. Incubar durante a noite a 4°C.
  9. Incubação de anticorpos secundários
    1. Enxágue as seções em PBS por 3 min, 3 vezes.
    2. Incube as seções com aproximadamente 100-200 μL de Polymer Helper para cobrir a seção na lâmina e incube a 37 °C por 20 min.
    3. Enxágue as seções em 0,1 mol / L PBS por 2 min, 3 vezes.
    4. Adicione aproximadamente 100-200 μL de IgG de poliperoxidase anti-camundongo/coelho e incube a 37°C por 20 min.
    5. Enxágue as seções em PBS por 3 min, 3 vezes.
  10. Desenvolvimento de cores
    1. Adicione aproximadamente 100-200 μL da solução de diaminobenzidina (DAB) (o suficiente para cobrir a seção na lâmina) para o desenvolvimento da cor.
    2. Deixe reagir por aproximadamente 3 min.
  11. Contracoloração e montagem
    1. Realize a contracoloração adicionando aproximadamente 100-200 μL de hematoxilina gota a gota para cobrir completamente a seção em cada lâmina.
  12. Desidrate e monte as seções
    1. Desidrate as seções em 50 mL de etanol a 50%, 70%, 90% e 100% por 10 min cada, seguido de 50 mL de xileno por 10 min.
    2. Limpe e monte as seções usando procedimentos padrão.
  13. Exame microscópico
    1. Conte o número de neurônios p-CREB- e c-fos-positivos no hipocampo de cada grupo33,34.
    2. Examine as seções ao microscópio com ampliação de 400x.
    3. Registre o número médio de neurônios positivos em cada fatia, com base na contagem de três seções por animal sem sobreposição.
      NOTA: Todos os dados foram compilados em uma planilha de computador. Todas as análises foram realizadas por meio de um software estatístico. Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e analisados por meio de ANOVA one-way com os testes post hoc SNK-q e Dunnett T335. O teste SNK-q é comumente usado para estudos exploratórios e é adequado para comparações pareadas entre médias de amostras múltiplas. Não se baseia em hipóteses pré-definidas, tornando-o ideal para comparar todas as médias dos grupos36. O teste de Dunnett T3 é normalmente usado para estudos confirmatórios com hipóteses predefinidas. É adequado para comparar vários grupos de tratamento com um grupo controle ou para comparar médias com significado profissional particular 35,37. Quando o valor de P do teste ANOVA foi ≤ 0,05, os testes post hoc pareados foram realizados para determinar quais grupos eram significativamente diferentes dos demais. Valores de P bilaterais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

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Resultados

Usando dados deste estudo como exemplos ilustrativos, mostramos os tipos de resultados que podem ser gerados com essa estrutura metodológica, incluindo imagens representativas de imunocoloração, bem como dados comportamentais e moleculares de diferentes grupos. A ênfase está na apresentação de resultados típicos ou esperados produzidos por essa abordagem, em vez de fornecer uma interpretação de seu significado biológico.

Resultados dos testes de aprendizagem e memória de cada grupo de ...

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Discussão

Este estudo investigou como o sevoflurano afeta a memória e modula a expressão de p-CREB e c-fos em neurônios do hipocampo através da via de sinalização NMDAR / p-CREB / c-fos em ratos juvenis. Os resultados sugerem que o sevoflurano teve um efeito estimulante negativo de curto prazo (1 h após o treinamento, não após 3 dias) na capacidade de manutenção da memória de ratos juvenis, sem impacto com base na frequência de dosagem (dose única ou sete doses ao longo de 7 dias). O sevoflurano d...

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Divulgações

Os autores relatam que não há interesses conflitantes a declarar.

Agradecimentos

Ye Jiang e Guohui Li projetaram o estudo. Ye Jiang e Lai Jiang coletaram e analisaram os dados e redigiram o manuscrito. Ye Jiang e Guohui Li revisaram o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram a versão final do manuscrito para submissão. Este trabalho é apoiado por doações para Guohui Li do Programa Shanghai Pujiang (concessão nº 23PJD057).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Animais Experimentais
Ratos Sprague-Dawley (SD)Charles River Laboratories (Pequim, China)N/A21 dias de idade, masculino
Ração de Rato PadrãoKeao Xieli Feed (Pequim, China)N/ADieta padrão para animais de laboratório
Produtos Químicos e Reagentes
Hidrato de CloralReagente químico Sinopharm (Xangai, China)80113818Anestésico para perfusão terminal
Tampão de citrato (10x)ZSGB-BIO (Pequim, China)ZLI-9064Solução de recuperação de antígeno, pH 6,0
Etanol (100%)Reagente químico Sinopharm (Xangai, China)100092683Agente de desidratação para histologia
Solução para coloração de hematoxilinaBaso Diagnostics Inc. (Zhuhai, China)BA-4041Contracoloração para IHQ
Peróxido de hidrogénio (H2O2)Reagente químico Sinopharm (Xangai, China)10011218Solução a 3% para bloqueio da peroxidase endógena
Bálsamo NeutroSolarbio (Pequim, China)G8590Meio de montagem para slides
Azoto (N2)Shanghai Medical Gas Co. (Xangai, China)N/AAlta pureza, para mistura de gases
Oxigênio (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Xangai, China)N/AGrau médico, para mistura de gases
ParafinaLeica Biosystems (Nussloch, Alemanha)39601006Meio de inclusão de tecido
Paraformaldeído (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA)158127Fixador para perfusão e fixação de tecidos
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco (Waltham, MA, EUA)7001104410x solução estoque, pH 7,4
SevofluranoAbbVie Inc. (Norte de Chicago, IL, EUA)N/AAgente anestésico inalatório
Limão SodadoW. R. Grace and Co. (Columbia, MD, EUA)22-01-0010CO2 absorvente para câmara de inalação
Hidróxido de sódio (NaOH)Reagente químico Sinopharm (Xangai, China)10019818Usado para ajuste de pH da solução PFA
SacaroseSangon Biotech (Xangai, China)A502693Usado para crioproteção do tecido cerebral
XilenoReagente químico Sinopharm (Xangai, China)10023418Agente de limpeza para histologia
Anticorpos e Kits
anticorpo c-FosAbcam (Cambridge, Reino Unido)AB190289Anti-camundongo de coelho, anticorpo primário
Kit de cromogênio DABZSGB-BIO (Pequim, China)ZLI-9018Substrato para desenvolvimento de cores HRP
anticorpo p-CREB (Ser133)Tecnologia de Sinalização Celular (Danvers, MA, EUA)9198Anti-camundongo de coelho, anticorpo primário
Kit de detecção de polímero HRPZSGB-BIO (Pequim, China)PV-9000Anticorpo secundário e sistema de detecção de IHQ
Equipamento
Máquina de anestesiaRWD Ciências da Vida (Shenzhen, China)R500Para entrega controlada de mistura de gás
Processador de Tissue AutomatizadoLeica Biosystems (Nussloch, Alemanha)ASP6025Para desidratação e limpeza automatizadas
Criostato/micrótomoLeica Biosystems (Nussloch, Alemanha)CM1950Para seccionamento de tecido cerebral congelado/embutido
Sistema de microscópioOlympus (Tóquio, Japão)BX53Para imagens de lâminas IHC
Bomba de perfusãoBomba de precisão mais longa Co. (Baoding, China)BT100-2JBomba peristáltica para perfusão transcárdica
Vaporizador de SevofluranoRWD Ciências da Vida (Shenzhen, China)R510PSPara controle preciso da concentração de sevoflurano
Aparelho Y-MazeMed Associates Inc. (St. Albans, VT, EUA)MED-VFC-S-YCom rede elétrica e luzes para prevenção ativa
Software
Prisma do GraphPadGraphPad Software (San Diego, CA, EUA)Versão 9Análise estatística e visualização de dados
ImagemJInstitutos Nacionais de Saúde (Bethesda, MD, EUA)Versão 1.53Software de análise de imagem para contagem de células
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, EUA)Escritório 365Software de planilha para compilação de dados

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