Microscopia de Expansão: Imagem Fluorescente de Alta Resolução com Microscópio Convencional

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado que combina métodos de criofixação e microscopia de expansão (Cryo-ExM), permitindo imagens de alta resolução com preservação estrutural adaptada a várias amostras biológicas. Amostras biológicas são congeladas, incorporadas em um polímero inchável, desnaturadas, expandidas e imunomarcadas, permitindo imagens de superresolução com microscópios ópticos padrão.

Resumo

A microscopia de expansão (ExM) é uma técnica inovadora de microscopia de fluorescência de superresolução que aumenta fisicamente amostras biológicas, permitindo imagens além do limite de difração usando sistemas convencionais, como microscópios confocais. Ao incorporar amostras em uma matriz de hidrogel inchável, o ExM permite a expansão isotrópica da amostra, aumentando a resolução espacial sem a necessidade de equipamentos especializados de nanoscopia. Variantes avançadas, como a Microscopia de Expansão de Ultraestrutura (U-ExM), preservam detalhes celulares finos, incluindo organelas e conjuntos macromoleculares.

A observação de estruturas celulares específicas ou organelos depende significativamente do método de fixação aplicado à amostra, notadamente por meio do uso de entrecruzamentos químicos à base de aldeído e precipitação de proteínas com metanol frio. Recentemente, a integração da criofixação — uma técnica de fixação padrão ouro — com o método U-ExM possibilitou observações em nanoescala de uma ampla gama de amostras biológicas, desde células de mamíferos cultivadas até organismos inteiros, em seu estado quase nativo. A microscopia de expansão é uma ferramenta poderosa para estudar estruturas biológicas em diferentes escalas, desde organelos isolados até tecidos inteiros. Quando combinado com criofixação, ele fornece insights sem precedentes sobre arquitetura celular e processos dinâmicos, minimizando artefatos associados aos métodos tradicionais de fixação. Esses desenvolvimentos posicionam o ExM como uma estrutura versátil para imagens biológicas de alta resolução e quase nativas.

O presente estudo apresenta um protocolo detalhado para criofixação combinado com microscopia de expansão de amostras de várias origens. Este protocolo destaca etapas críticas, incluindo fixação de amostras, formação, expansão, imunocoloração e obtenção de imagens, fornecendo a orientação necessária para implementar esse método em qualquer laboratório.

Introdução

A microscopia desempenha um papel fundamental na pesquisa biológica, permitindo visualizar a ultraestrutura e a organização entre sistemas vivos em escalas sem precedentes, desde organismos inteiros até moléculas individuais. O campo da microscopia abrange dois sistemas distintos: microscopia eletrônica (EM), altamente resolutiva, mas com capacidade limitada para marcação específica, e microscopia óptica, que permite visualização precisa e específica da estrutura subcelular, porém com resolução limitada devido ao limite de difração da luz. Embora a microscopia de fluorescência de superresolução (SRM) tenha evoluído como um método poderoso para imagens de fluorescência com resolução sub-difração de células, visualizar os detalhes ultraestruturais de conjuntos macromoleculares, como organismos inteiros, continua sendo^{desafiador 1}. Além disso, as técnicas de MRS, que alcançam resoluções que variam de 10 a 120 nm, dependem de microscópios avançados e algoritmos de reconstrução de imagem e exigem expertise e microscópios especializados, limitando seu acesso a muitos laboratórios de biologia. Um método emergente de super-resolução, a microscopia de expansão (ExM), superou essas limitações. Desenvolvida no laboratório de Edward S. Boyden há uma década, a ExM é uma técnica inovadora de microscopia fotônica agora considerada como microscopia de super-resolução, que permite imagens sem a necessidade de microscópios^{especializados 2}. Em vez de depender de tecnologias sofisticadas de imagem, a ExM envolve a incorporação de amostras biológicas em um polímero inchável que se expande isotropicamente. Essa expansão física aumenta o tamanho da amostra em um fator de quatro ou mais, aumentando a resolução e permitindo a observação usando microscópios convencionais de luz. Originalmente desenvolvidos em fatias cerebrais, os protocolos ExM evoluíram para melhorar a resolução e simplificar procedimentos. Essa técnica foi adaptada com sucesso para várias amostras biológicas, incluindo células eucarióticas, organismos unicelulares, parasitas, tecidos e organismos inteiros, demonstrando sua versatilidade 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14^{, 15}.

Atualmente, existem duas classes principais de protocolos:^{pré-expansão 2,16} e^{pós-expansão 17,18}, que se referem ao momento da coloração biológica da amostra, seja antes ou depois do procedimento de expansão. Este artigo focará especificamente no protocolo pós-expansão, no qual a imunomarcação é realizada após a desnaturação e expansão da amostra.

Neste protocolo, amostras biológicas são criofixadas ou quimicamente e incubadas com agentes químicos, permitindo a ancoragem proteica no polímero futuro. As amostras são então incorporadas em um polímero inchável composto por acrilamida/bis-acrilamida (comumente usada em géis de eletroforese) e acrilato de sódio (permitindo a expansão). Adicionar água desencadeia a expansão do gel, aumentando a distância entre proteínas em proporção à expansão do gel. Proteínas de interesse são então marcadas diretamente dentro do gel usando anticorpos específicos (Figura 1).

Todas as técnicas de imagem mencionadas, incluindo microscopia eletrônica, microscopia fotônica, microscopia de superresolução e ExM, requerem fixação biológica de amostra. A fixação baseada em aldeído cria reticulação entre proteínas, mantendo a organização celular durante os tratamentos necessários para microscopia fotônica ou eletrônica. No entanto, a fixação também pode levar a artefatos e mudanças morfológicas na célula, que podem ser sutis na microscopia óptica clássica, mas que se tornaram cada vez mais evidentes com o avanço e desenvolvimento da MRS, levando os cientistas a reconsiderar as consequências dos métodos^{de fixação 19}. Uma forma de contornar artefatos relacionados à fixação é usar microscopia ao vivo, que permite a visualização dinâmica das estruturas celulares em seu estado quase nativo. No entanto, a microscopia ao vivo apresenta várias desvantagens, notadamente a necessidade de expressão de transgenes, que pode impactar a fisiologia celular e alterar o comportamento das proteínas em comparação com os equivalentes endógenos. Além disso, a microscopia ao vivo normalmente oferece resolução menor do que a microscopia fixa e possui opções limitadas de rotulagem, pois as etiquetas fluorescentes devem ser não tóxicas e estáveis em condições vivas, restringindo os marcadores disponíveis. O campo da microscopia eletrônica, devido à sua alta resolução, contribuiu consideravelmente para o desenvolvimento de métodos ideais para fixar estruturas subcelulares ou macromoleculares preservando seu estado nativo. Décadas atrás, a criofixação foi desenvolvida pelos laboratórios Dubochet, Frank e Henderson, envolvendo a fixação rápida da célula em água vítrea e demonstrando que era a única abordagem para preservar a ultraestrutura^{nativa 20,21}. Enquanto moléculas purificadas podem ser observadas diretamente no gelo vítreo usando criomicroscopia eletrônica, as células precisam ser incorporadas em resina e seccionadas antes da observação. Para estabilizar ainda mais as amostras no estado mais nativo possível, as amostras são submetidas à substituição por congelamento. Nesse processo, à medida que as moléculas de gelo retornam ao estado líquido, elas são instantaneamente substituídas por acetona, que possui um coeficiente de difusão maior que a água. Durante a remoção da água, moléculas de interesse podem se agregar e colapsar, semelhante ao que ocorre na fixação química por reticulação. Para limitar essa agregação, a substituição por congelamento é realizada em baixas temperaturas, reduzindo a agregação ao aumentar a viscosidade^{intracelular 22}. Essa abordagem controlada limita a formação de grandes agregados e preserva a ultraestrutura celular mais próxima de seu estado nativo.

Em 2022, evidências crescentes de que a fixação química introduz artefatos, combinadas com avanços na microscopia de expansão, levaram o laboratório Guichard/Hamel a desenvolver um método que integra criofixação com microscopia de expansão, conhecido como 'Cryo-ExM'23. Essa abordagem aproveita as forças de ambas as técnicas ao preservar estruturas biológicas com distorção mínima. As amostras são criocongeladas usando congelamento de alta pressão ou mergulho manual, ambos requerendo equipamentos especializados comumente encontrados em laboratórios de microscopia eletrônica ou instalações centrais.

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para realizar criofixação seguida de microscopia de expansão e apresenta resultados representativos de dois modelos experimentais: células cultivadas em humanos e o parasita unicelular Trypanosoma brucei, o agente causador da doença do sono. Vamos enfatizar as melhorias oferecidas pela criofixação em relação aos métodos convencionais e destacar as armadilhas e artefatos de fixação mais comuns associados à técnica.

Protocolo

NOTA: Os reagentes usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais. Esse protocolo é adaptado, com pequenas modificações, para observação de vários processos celulares em diferentes amostras biológicas (incluindo leveduras^24,25, Toxoplasma gondii²⁶, espécies animais parentes^{próximos 27}, algas verdes^28,29, eucariotos^{microbianos 30}, assim como amostras^{de camundongos 23} e^humanas 23,31,32,33 ). Modificações para adaptar o protocolo a essas diferentes amostras não são mencionadas neste artigo, pois podem ser recuperadas das publicações originais. Aqui, células RPE1 e Trypanosoma brucei são usadas como substitutos para células e parasitas de mamíferos. Este protocolo enfatiza as etapas de fixação e expansão das amostras biológicas; Portanto, informações sobre a cultura amostral não são apresentadas neste artigo.

1. Preparação da solução de estoque

1. Solução de polilisina
   1. Resuspenda o hidrobrometo de poli-L ou poli-D-lisina (Tabela de Materiais) em água para obter uma solução padrão de polilisina a 1 mg/mL. Armazene essa solução de estoque a -20 °C e dilua-a ainda em água a 0,2 mg/mL para revestir as coberturas (Tabela 1, Tabela de Materiais).
2. Solução de ancoragem
   1. Prepare uma solução fresca de acrilamida/formaldeído (sob o capuz químico) misturando 38 μL de formaldeído (36,5%-38%; Tabela de Materiais) e 50 μL de acrilamida (40%, Tabela de Materiais) em 912 μL de PBS para obter 1 mL de solução.
3. Solução de gelação sem APS (iniciador)
   1. Prepare uma solução misturada adicionando 500 μL de acrilato de sódio a 38% (19% final), 250 μL de acrilamida a 40% (10% final), 50 μL de bis-acrilamida a 2% (0,1% final), 50 μL de TEMED (0,5% final) e 100 μL de 10x PBS (1x final). Aliquota em volume adequada para 2 géis no máximo (80-90 μL) e armazenada a -20 °C por pelo menos 12 horas antes do uso (veja a Tabela 1 para conservação a longo prazo).
      NOTA: Observe que o volume indicado para preparar a mistura de solução gelificante é calculado para obter um volume final de 1 mL, mas o volume real da solução é de 950 μL, já que o APS, que representa 1/20 do volume total de cada um, é adicionado de forma espontânea. O tempo original de armazenamento da solução^{de gelificação 17} foi estendido após observarmos que ela poderia ser preservada por até 1 mês a -20 °C sem comprometer a solidez do gel ou a eficiência de expansão.
4. TEMED e APS
   1. APS 10% em papo: Diluir o pó de APS em água, aliquota e armazenar a -20 °C.
   2. TEMED 10% v/v: Dilua TEMED em água, aliquota e armazene a -20 °C.
5. Acrilato de sódio (SA) 38%
   1. Prepare 38% de SA a partir de SA purificado (AK scientific ou Sigma; Tabela de Materiais)
      1. Resuspenda 38 g de acrilato de sódio em 100 mL de água sob agitação constante (importante). Incorpore a SA progressivamente para evitar agregados e mexa durante a noite a 4 °C para garantir a resuspensão completa. Certifique-se de que a solução seja translúcida e incolor ou levemente amarelada. Aliquota e armazene a 4 °C por até 1 ano.
   2. Prepare 38% de ácido acima-sério a partir do ácido acrílico (Sigma; Tabela de Materiais)
      1. Prepare 90 mL de acrilato de sódio a 38% neutralizando o ácido acrílico com NaOH sob um capuz químico.
      2. Misture 29 mL de água com 25 mL de ácido acrílico enquanto mexe.
         NOTA: A partir desta etapa, a reação deve ser realizada no gelo com controle constante de pH e temperatura, pois a reação é exotérmica.
      3. Adicione 10 N de NaOH gota a gota usando uma piqueta Pasteur.
         NOTA: Certifique-se de que a temperatura não ultrapasse 25 °C (se passar, pare de adicionar NaOH e espere a temperatura esfriar).
      4. Continue neutralizando até o pH atingir 7-8 e agite por 1 hora no gelo.
         NOTA: Se o pH subitamente subir para mais de 10, adicione ácido acrílico até que o pH caia para 7-8.
      5. Armazene a solução em um recipiente fechado durante a noite. Se a solução já precipitou, centrifuge a 1.000 × g por 10 minutos. Colete o sobrenadante, aliquota, e armazene-os a -20 °C.
6. Solução de desnaturação
   1. TrisBase 1 M: Dilua 121,14 g de TrisBase em 1 L de água, ajuste o pH com HCl para 9 e armazene em RT.
   2. Buffer de desnaturação: Misture 200 mM de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), 200 mM de NaCl, 50 mM TrisBase em água. Para uma solução de 200 mL, adicione 10 mL de Tris-BASE 1 M (pH 9) em 124,9 mL de_{ddH 2}O, adicione 57,1 mL de SDS (estoque 20%/700 mM) e 8 mL de NaCl (estoque 5 M) durante a mexer. Armazene no RT (Tabela 1).

2. Procedimento de criofixação e expansão

1. Preparação da amostra e criofixação
   NOTA: Este protocolo é otimizado para amostras cultivadas/carregadas em coberturas de 12 mm. Por favor, revise o volume da solução para outros suportes.
   1. Preparação de amostras
      1. Cultive a amostra em condição adaptada à amostra biológica, seja diretamente em coberturas de 12 mm (células aderentes de mamíferos) ou em suspensão (T. brucei).
      2. Coloque a amostra na capa de cobertura (T. brucei) pré-revestida com polilisina da seguinte forma: rapidamente incube coberturas de 12 mm em polilisina (0,2 mg/mL) por 1 hora a 37 °C, lave rapidamente e sece ao ar.
      3. Centrifuge os parasitas a 300 g por 10 minutos em temperatura ambiente (RT). Resuspensão em PBS suplementado com 10% do meio de cultura e carga nos coverslips de 5 a 10 minutos antes da criofixação.
   2. Configuração de mergulho (Figura 2A-C)
      ATENÇÃO: Trabalhe sob um capuz químico, com luvas e jaleco ao manipular acetona. Use jaleco e óculos de proteção sempre que manipular nitrogênio líquido e etano líquido.
      1. Sob um capuz químico, encha 5 mL de tubos (1 coverslip/tubo) com 1 mL de acetona extra seca usando uma seringa e uma agulha para evitar contaminação do ar.
         NOTA: Para melhor preservação biológica da membrana, é necessária a adição de paraformaldeído (PFA)/Glutaraldeído (GA) (0,1/0,02%). Adapte o tubo de acordo com o diâmetro do revestimento (cobertores > 12 mm não cabem em tubos de 5 mL).
      2. Congele os tubos em nitrogênio líquido usando um suporte de plástico ou metal resistente ao frio para mantê-los em pé.
      3. Encha metade de uma caixa de poliestireno (paredes de 30 cm x 30 cm de espessura) com gelo seco.
      4. Encha o dewar tipo Vitrobot com nitrogênio líquido até parar de evaporar e espere de 10 a 15 minutos para a estabilização da temperatura. O uso da aranha é necessário para facilitar o resfriamento do sistema (Figura 2B, asterisco). Reabasteça se necessário.
      5. Remova a aranha e encha a câmara metálica de mergulho com etano líquido.
      6. Espere 10 minutos para o etano se equilibrar.
         NOTA: Reabasteça o sistema de mergulho com etano líquido durante o experimento, se necessário (não use mais a aranha neste momento). A transição do etano gasoso para o líquido é difícil. O uso da pressão adequada é fundamental para a formação do etano líquido. Alta pressão impede a formação de líquidos por transbordamento constante de gás dentro da câmara metálica, enquanto baixa pressão forma etano sólido dentro da câmara metálica e do tubo de enchimento. Evitar a formação de gelo é essencial para o experimento. Manter a ponta de preenchimento na interface líquido/ar ajuda a prevenir a formação de etano sólido.
   3. Mergulho (Figura 2A-C)
      ATENÇÃO: Use jaleco e óculos de proteção sempre que manipular nitrogênio líquido e etano líquido.
      1. Pegue uma capa de 12 mm com pinças finas.
      2. Absorva qualquer excesso de médio com papel de seda.
      3. Segure a capa na metade com a pinça, com um anel de fixação adaptado ao desentupidor criogênico.
      4. Coloque a pinça que segura a capa no suporte do desentupidor criogênico. Limpe qualquer excesso restante de médio com papel Whatman.
      5. Ative o desentupidor criogênico para mergulhar o revestimento na solução de etano na câmara metálica.
      6. Transfira rapidamente o coverslip para o tubo que contém acetona congelada (1 coverslip/tubo).
         NOTA: Não use a mesma pinça para coletar as amostras e para mergulhar para evitar contaminação com o meio de cultivo. Tenha ainda mais cuidado se usar coverslips > 12 mm (15 ou 18 mm de diâmetro) encaixam no porta-lacas, mas podem ser mais difíceis de mergulhar. Durante essa etapa, é possível imergir o coverslip em nitrogênio líquido após o mergulho para facilitar a transferência para o Eppendorf, mantendo a amostra congelada. Como a acetona congela a -96 °C, é necessário colocar as coberturas sobre acetona congelada para a substituição por congelamento.
   4. Substituição por congelamento e reidratação
      ATENÇÃO: Trabalhe sob o capô ao manipular amostras durante a substituição por congelamento. O aumento da temperatura cria pressão dentro do tubo, o que pode desencadear uma explosão do tubo.
      1. Incube os tubos em gelo seco com um ângulo de inclinação (aproximadamente 45°).
      2. Agite durante a noite em um agitador orbital. Coloque a caixa fechada sobre um shaker a 4 °C ou RT para permitir que a temperatura suba de -180 °C para -80 °C.
      3. Remova a maior parte do gelo seco da caixa (apenas deixe alguns no fundo da caixa), libere a pressão nos tubos abrindo e fechando rapidamente, e continue agitando por 45 minutos no agitador orbital para continuar a temperatura subindo de -80 °C para -20 °C.
      4. Transfira os coverslips para uma placa de 12 poços (ou qualquer recipiente conveniente) contendo solução de etanol puro pré-refrigerado (100%). Incube por 5 minutos e prossiga com a reidratação gradual da seguinte forma: EtOH 100% (5 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 70% (3 min) - EtOH 50% (3 min) - EtOH 25% (3 min) - H₂O 100%.
      5. Transfira as coberturas em PBS e oriente-as sob um microscópio (arranhando a superfície com a ponta) para que todas fiquem voltadas para cima.
         NOTA: EtOH 100% e 95% são armazenados a -20 °C, EtOH 70% e EtOH 50% a 4 °C, EtOH 25% e ddH_2Oem RT para continuar aumentando a temperatura até RT. Para a marcação de membranas, a adição de PFA/GA (0,1%/0,02%) é necessária em soluções de acetona e reidratação, exceto para_ddH2O.
2. Expansão
   1. Ancoragem de proteínas
      1. Prepare uma solução fresca de formaldeído/2% de acrilamida (FA/AA) a 2% em PBS 1x.
      2. Coloque os coverslips em uma placa de poço 4/12 preenchida com 0,5/1 mL de AA/FA.
      3. Incube por 3-5 horas a 37 °C sem agitação.
         NOTA: O formaldeído liga grupos amináticos livres de proteínas à acrilamida. O excesso de acrilamida ajuda a limitar a reticulação de proteínas normalmente induzida pelo formaldeído e ancora as proteínas ao polímero de expansão futura. Pode ser necessário alongamento gradual de ancoragem da proteína até a noite para o dia, dependendo da amostra biológica. De qualquer forma, uma incubação mais longa não impactará nenhuma das etapas seguintes. Encha os poços livres com água ou coloque-os em uma câmara úmida para evitar a evaporação.
   2. Gelação
      1. Descongelação, APS (10%) e solução gelificante (Acrilato de sódio 19%, Acrilamida 10%, bisacrilamida 0,1%, TEMED 0,5% diluído em 10x PBS) em gelo 10 minutos antes da gelificação.
      2. Prepare uma câmara úmida com uma fina camada de papel úmido e parafilme, depois armazene a 4 °C por 10 minutos.
      3. Coloque a câmara úmida sobre gelo.
      4. Retire as capas da solução de ancoragem proteica e remova o excesso com papel de seda (2 em fila).
      5. Adicione APS (concentração final 0,5%) na solução de gelificação, faça vórtice por 2-3 segundos e coloque 2 gotas de 35 μL sobre o parafilme da câmara úmida.
      6. Cubra cada gota com a capa de cobertura, com as células voltadas para a solução gelificante.
      7. Incube no gelo por 5 minutos para permitir a penetração do gel.
      8. Incube a 37 °C por 30-60 minutos.
   3. Desnaturação
      1. Punte o gel com uma ferramenta de biópsia (0,4 cm de diâmetro, Figura 2D) e agite por 10/15 minutos em uma placa de 6 poços cheia com 1 mL de tampão de desnaturação até que os géis se soltem das escobilhões.
      2. Transfira o gel para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cheio com um novo tampão de desnaturação.
      3. Incube por 1 h 30 a 95 °C.
      4. Transfira o gel para ddH_2Opor 10 minutos e repita 3 vezes para lavar corretamente o tampão de desnaturação.
      5. Meça o gel com papel milimétrico ou caliper para avaliar o fator de expansão do gel.
      6. Transfira o gel para PBS para imunocoloração.
      7. Alternativamente, armazene os géis em PBS-azida 0,02% a 4 °C por um curto período (Tabela 1) ou a -20°C para armazenamento mais longo (Tabela 1). Para armazenamento prolongado, os géis devem ser incubados em vários banhos de água: solução de glicerol a 50% por 2-3 horas sob agitação e colocados a -20 °C em um volume suficiente de solução, que deve ser adaptado ao tamanho do gel.
         NOTA: O gel pode ser mantido inteiro, se preferido (Figura 2D, E) (passo 2.2.3.1). Até 5 punções (equivalente a um gel inteiro) podem ser reunidas em 1 tubo (passo 2.2.3.2). A temperatura e o tempo de desnaturação devem ser respeitados (passo 2.2.3.3). Calor alto pode desencadear a abertura do tubo, levando à evaporação do tampão de desnaturação e/ou expulsão do gel. Certifique-se de usar tubos com trava segura ou cobri-los. A lavagem do gel após a desnaturação deve ser feita em água destilada, pois o PBS desencadeará a precipitação de SDS, afetando a eficiência das lavagens. Essa etapa desencadeará uma leve expansão do gel, que não terá consequências nas etapas seguintes do protocolo (etapa 2.2.3.4). O glicerol pode ser diluído em PBS para economizar espaço no caso de géis grandes. Para punção de 0,4 mm, os géis são idealmente armazenados em uma placa de 12 poços preenchida com 3 mL de água: glicerol.

3. Imunocoloração e expansão final

1. Mude o banho de PBS por mais 15 minutos de incubação.
2. Corte o gel inteiro em 4 partes iguais.
3. Transfira as peças/punções do gel para um portador adaptado (Figuras 2D, E) e incube com anticorpos primários diluídos em PBS-BSA 2% por 3 horas até a noite toda com agitação (veja a Tabela 2 e a Tabela 3 para condições detalhadas).
4. Gel de lavagem 3 vezes com PBS+Tween 0,1% por 10 minutos de descanso com agitação.
5. Incube o gel em anticorpos secundários e Hoechst em PBS-BSA 2% por 3 horas até a noite durante a agitação (veja as Tabelas 2 e Tabelas 3 para condições detalhadas).
6. Gel de lavagem 3 vezes com PBS+Tween 0,1% por 10 minutos de descanso com agitação.
7. Opcional: Realize a marcação pan-rotulada do proteoma inteiro incubando gel com éster NHS (veja a Tabela 2 para detalhes) em PBS por 1h30 em RT sob agitação, depois lave 3x em PBS+Tween 0,1% por 10 minutos.
8. Transfira o gel para um transportador adaptado e prossiga com a expansão do gel por incubação em água destilada (ddH₂O).
   NOTA: A concentração e o tipo de detergente (Tween, Triton-X100, Saponina) usados em sabonetes anticorporais podem ser adaptados a amostras biológicas. Substituir a água várias vezes é crucial para eliminar vestígios de sais, que impedem a expansão total.

4. Montagem e imagem

1. Cobre as coberturas com polilisina (ver seção 1.1) cobrindo as coberturas com aproximadamente 200 μL de polilisina, incubando 1 hora na RT e lavando 3 vezes em_{ddH 2O}para remover o excesso de polilisina. Deixe as mantas secarem e guarde-as a 4°C até o uso.
2. Coloque géis expandidos em coberturas não revestidas na câmara de imagem para verificar a orientação das amostras usando um microscópio de fluorescência.
3. Uma vez orientado, seque gel sobre papel sem fiapos para remover o excesso de água e monte em coberturas revestidas a polilisina (veja o passo 1.1 para o protocolo).
4. Observe amostras com um microscópio invertido.

Resultados

Este artigo destaca os resultados da combinação da criofixação com microscopia de expansão em dois tipos diferentes de amostras: células de mamíferos cultivadas e parasitas T. brucei . Ambas as amostras foram criofixadas ou quimicamente fixadas em 4% de PFA antes da expansão e imunocoloração. Note que outras fixações químicas podem ser mais adequadas para organelas específicas (como metanol ou glutaraldeído) e que apenas PFA, uma fixação química comum, foi escolhida para comparar com a criofixação por simplicidade.

RPE1 humana (células epiteliais pigmentarias retinianas) foram coloridas para αβ-tubulina, ATP5a e Hoechst para visualizar microtúbulos, mitocôndrias e núcleos, respectivamente. Além disso, géis foram incubados com o éster fluorescente do NHS antes da expansão, um corante que reagia com os grupos amina livres e, portanto, tingia todo o proteoma celular. Pudemos observar várias vantagens da criofixação em comparação com a fixação química, como já^{demonstrado 23}. A característica mais marcante foi que a criofixação preservou perfeitamente a rede mitocondrial, visível tanto usando NHS-ester quanto anticorpos específicos contra a subunidade alfa da ATP sintase (ATP5a) (Figura 3A,B). Além disso, como o ATP5a está localizado na membrana mitocondrial interna, poderíamos resolver cristas mitocondriais usando criofixação (Figura 3B"). Pelo contrário, a fixação de PFA não permitiu preservar a rede mitocondrial e, portanto, as cristas mitocondriais não eram visíveis nessa condição (Figura 3C"). Também colorimos microtúbulos em ambas as condições e demonstramos que a criofixação preservava melhor microtúbulos dinâmicos, como os microtúbulos citoplasmáticos ou astrais (Figura 3B-E). No entanto, microtúbulos estáveis, como os dos centriolos e cílios, organelos não membranosos compostos por tripletes/duplas de microtúbulos de 9 vezes, foram igualmente preservados, se não melhores, em células fixas a PFA em comparação com células fixadas em criofixação (Figura 3B', C'). É importante notar que a criofixação, como preservar a integralidade das proteínas celulares, pode ser menos aplicável a estruturas muito densas, como centriolos/cílios. Essa observação também foi feita em estruturas rígidas, como poros nucleares, onde a fixação química desencadeia um lavagem de proteínas citoplasmáticas, permitindo uma melhor observação das estruturas dos poros^{nucleares 23,32}. Por fim, pudemos demonstrar que a criofixação também contorna o efeito de reticulação da fixação química, que impacta negativamente a capacidade de expansão, como mostrado em fusos mitóticos, que estavam quase duas vezes mais expandidos em condição criofixada em comparação com a PFA (Figura 3D,E).

Células de Trypanosoma brucei foram coloridas para TDH³⁴ (Figura 4A-D) para visualizar a mitocôndria única e para^{BiP 35} (Figura 4E,F) para destacar o retículo endoplasmático. Além disso, os géis foram tingidos com fluorescente NHS-ester. Como observado em células humanas, a criofixação combinada com expansão preserva melhor a arquitetura celular geral (Figura 4B,E), particularmente essas duas estruturas membranosas, em comparação com a fixação de PFA (Figura 4C,D,F). O citoesqueleto microtubular de T. brucei é mais rígido e estável do que o das células humanas; consequentemente, nenhuma diferença significativa foi observada entre PFA e criofixação. Além disso, o limite de resolução da técnica U-ExM nos impede de distinguir microtúbulos individuais (não mostrados).

De modo geral, a criofixação aborda limitações da fixação química clássica, como a preservação de organelas membranosas (mitocondrias, retículo endoplasmático) e elementos dinâmicos do citoesqueleto (microtúbulos citoplasmáticos ou astrais). Além disso, como a criofixação não cria qualquer ligação cruzada entre proteínas, ela preserva totalmente a capacidade de expansão, especialmente em estruturas rígidas e densas.

Controlar a qualidade da criofixação e expansão é essencial para preservar a ultraestrutura celular das amostras biológicas. Vários erros podem resultar em má fixação e criar artefatos dentro das amostras biológicas. Aqui, destacamos as desvantagens e consequências mais comuns da fixação criogênica. O artefato mais evidente criado pela criofixação é o aparecimento de trincas dentro da amostra biológica (Figura 5A), também comum na criomicroscopia eletrônica. Embora essas rachaduras não alterem a ultraestrutura intrínseca das organelas, como mostrado na Figura 5A (inset) para mitocôndrias e microtúbulos, podem levar a uma má interpretação da relevância biológica dessas fissuras e precisam ser consideradas com cautela. Não há correlação específica entre questões de manipulação e a aparência/abundância dessas rachaduras.

Uma característica específica indicativa de fixação fraca é o aparecimento de "estruturas semelhantes a bolhas" dentro do citoplasma celular, indicando a presença de cristais de gelo. Essas estruturas são particularmente visíveis com a coloração NHS-éster (Figura 5B). Elas geralmente são acompanhadas por preservação limitada de elementos do citoesqueleto, como microtúbulos ondulados (Figura 5B), e por uma preservação muito pobre dos organelos membranosos (mitocôndrias na Figura 5B). Essas características apresentam questões importantes de fixação, que podem ser causadas por (i) volume e/ou temperatura inadequados de etano (passos 2.2.4-2.2.6 do protocolo), (ii) aquecimento não gradual da amostra biológica (passos 2.3 e 2.4 do protocolo) e (iii) presença de impurezas na solução de substituição por congelação (passo 2.2.1 do protocolo). Imagens representativas de soluções de acrilato de sódio destacando o aspecto esperado de 38% de acrilato de sódio utilizável (incolor e translúcido [1]) ou levemente amarelo e translúcido [2]), ou inutilizável para expansão (amarelo/laranja e turvo [3]) são mostradas na Figura 5C.

Figura 1 Fluxo de trabalho Cryo-ExM. (A) Células vivas (células humanas ou T. brucei) são criofixadas mergulhando em etano líquido a -180 °C e incubadas em acetona congelada sobre gelo seco. A substituição por congelamento é realizada por um aumento constante e lento da temperatura de -180 °C para -80 °C por incubação em gelo seco, que desencadeia a liquefação da acetona (-96 °C), e depois de -80 °C a -20 °C por incubação sem gelo seco. A reidratação é realizada por banhos sucessivos de etanol misturado com uma concentração crescente de água destilada, juntamente com um aumento constante da temperatura de -20 °C até temperatura ambiente. (B) As amostras reidratadas são então processadas para expansão da seguinte forma: As amostras são incubadas em uma mistura de acrilamida: formaldeído (AA/FA) a 37 °C, permitindo a ancoragem das proteínas ao polímero inchável feito de acrilamida, bis-acrilamida e acrilato de sódio (AA/BIS/SA), este último conferindo a propriedade de expansão ao gel. Amostras são incubadas em NaCl/SDS a 95 °C para realizar desestabilização de interações proteína-proteína e desnaturação suave. Essa etapa é essencial para a expansão isotrópica. As amostras são então imunoscadas usando anticorpos primários e secundários regulares e, finalmente, expandidas em água destilada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2. Criogenia e configuração de expansão. (A) Desentupidor criogênico em posição armada (painel superior) e posição para baixo (painel inferior). A seta indica o botão PUSH para ativar o mergulho. (B) Configuração de crio-plunging pronta para mergulho mostrando o nível de nitrogênio líquido (N₂) adequado para criofixação, indicado pela altura da espuma ao redor do dewar (ponta de flecha vermelha). A aranha removível é indicada por asteriscos. (C) Ilustração dos passos principais do crio-mergulho a partir da seguração do coverslip (canto superior esquerdo), a posição dos coverslips em dewar de etano líquido (canto inferior esquerdo) e do tubo de coleta para substituição por congelamento (direito). (D) Ilustração do método de 'gel punching' para imunocoloração em amostras humanas. O gel polimerizado nas capas (1) é cortado usando um punção de biópsia específica (P), formando um punção de gel de 0,4 cm de diâmetro (2), que pode ser tingido em uma placa siliconada (painéis direitos) para reduzir a quantidade de anticorpo. (E) Ilustração do método de 'corte em gel' para imunocoloração em amostras humanas e de T. brucei . Géis polimerizados e desnaturados (1) são cortados em 4 partes iguais (2), permitindo sua incubação em uma placa de 12 poços com anticorpos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3. Comparação entre criofixação e fixação de PFA em células humanas. (A) Imagem do disco giratório de células RPE1 criofixas e expandidas coradas para αβ-tubulinas (ciano), subunidade 5a da ATP sintase mitocondrial (ATP5a, amarelo) e éster NHS (vermelho/cinza), mostrando a excelente preservação tanto dos organelos membranários quanto dos elementos do citoesqueleto, incluindo centrículos e cílios (ponta de flecha). Barra de escala: 10 μm. (B, C) Imagem de disco giratório de células RPE1 criofixadas (B) e fixadas por PFA (C) coradas para αβ-tubulinas (ciano), ATP5a mitocondrial (amarelo) e Hoechst (magenta) enfatizando cílio primário (setas, B', C') e mitocôndrias (B", C"). Se a criofixação e a PFA preservarem igualmente os centrioles e os cílios primários, a criofixação supera em larga medida a PFA no que diz respeito à preservação da estrutura mitocondrial (B", C"- pontas de flecha vermelhas indicam cristas mitocondriais visíveis apenas em condições criofixadas). Barras de escala: 1, 1 e 2,5 μm, respectivamente. (D,E) Imagem do disco giratório de células RPE1 criofixas (D) e fixadas com PFA (E) coradas para αβ-tubulinas amarelas/cinzas), ATP5a mitocondrial (magenta) e Hoechst (azul BOP) mostram que a criofixação permite melhor expansão do fuso mitótico (pontas de seta vermelhas) e preserva melhores microtúbulos do fuso mitótico (setas vermelhas). Medições do comprimento do fuso mitótico: 12 μm e 7 μm para criofixação e PFA, respectivamente. Barras de escala: 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Comparação entre criofixação e fixação de PFA em Trypanosoma brucei. (A, B) Imagens confocais de células procíclicas criofixadas e expandidas de T. brucei coradas para treonina desidrogenase mitocondrial (TDH, amarelo) e NHS-éster (vermelho/cinza), mostrando a excelente preservação da mitocôndria única e a arquitetura geral da célula. Barras de escama: 5 μm. (C, D) Imagem confocal de células procíclicas de T . brucei fixadas e expandidas com PFA, coradas para TDH (amarelo) e éster do NHS (vermelho/cinza). Comparando a preservação da estrutura mitocondrial e a rede, a criofixação supera a fixação de PFA. Barras de escala: 5 μm. (E, F) Imagens confocais de células procíclicas criofixadas (E) e fixadas por PFA (F) e expandidas de T. brucei coloridas para marcadores do retículo endoplasmático BiP e NHS-ester (cinza), mostrando que a criofixação permite melhor expansão e conservação do retículo endoplasmático. Barras de escala: 5 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Problemas de criofixação. (A,B) Imagens de disco giratório de RPE1 criofixo e expandido coradas para αβ-tubulinas (ciano), subunidade 5a da ATP sintase mitocondrial (ATP5a, amarelo) e NHS-éster (vermelho) mostrando efeitos clássicos da criofixação: rachaduras (A, setas) e bolhas (B, seta). Embora as fissuras não afetem as ultraestruturas dos organelos (A), a presença de bolhas no citoplasma (B) indica uma fixação ruim e altera significativamente a preservação dos organelos subcelulares (mitocôndrias e microtúbulos, insets). Barras de escala: 5 μm e 2 μm (insets). (C) Imagem mostrando diferentes soluções de acrilato de sódio destacando o aspecto esperado de 38% de acrilato de sódio utilizável (incolor e translúcido (1) ou levemente amarelo e translúcido (2), ou não utilizável para expansão (amarelo/laranja e turvo (3)). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Condições de armazenamento da solução Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Lista de anticorpos Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Condições de imunocoloração Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado que integra criofixação com microscopia de expansão (Cryo-ExM), oferecendo uma abordagem robusta para visualizar compartimentos subcelulares, evitando artefatos comumente associados à fixação química, como distorção estrutural e perda de antígenos. Ao preservar a arquitetura celular em um estado quase nativo, o Cryo-ExM elimina a necessidade de otimização extensa da fixação, permitindo uma localização proteica mais precisa.

Embora o protocolo seja geralmente simples, vários passos críticos exigem atenção especial para garantir resultados bem-sucedidos. O passo de crio-mergulho é especialmente sensível, pois exige tanto materiais específicos (ver Tabela de Materiais) quanto um nível de destreza, especialmente ao manusear o preenchimento líquido de etano, que representa uma possível armadilha. Conhecimento prévio de técnicas de criofixação é vantajoso; recomendamos consultar um especialista em crio-EM ou um gerente de instalação de microscopia eletrônica ao adotar esse método pela primeira vez. Durante a fase de expansão, é essencial seguir rigorosamente as condições de desnaturação, pois desvios podem comprometer tanto a preservação quanto a eficiência da expansão. Por fim, manter condições adequadas de armazenamento para todos os reagentes (veja Tabela 1) é crucial para garantir reprodutibilidade e qualidade consistente de imagem ao longo do tempo.

Este artigo destaca várias vantagens importantes do protocolo Cryo-ExM. Notavelmente, a criofixação minimiza a perda de proteínas solúveis, uma limitação comum dos métodos convencionais de fixação, e preserva melhor a integridade da membrana, aumentando assim a fidelidade da imagem celular. Uma grande força dessa técnica está em sua compatibilidade com microscópios de campo amplo e confocais padrão. Diferente de muitos outros métodos de super-resolução que exigem equipamentos especializados e frequentemente caros, o ExM pode ser implementado usando microscópios de fluorescência convencionais. Outra vantagem significativa do ExM é sua versatilidade. A técnica foi aplicada com sucesso a uma ampla gama de amostras biológicas – desde células individuais até tecidos complexos – demonstrando sua ampla aplicabilidade em diversos domínios de pesquisa. Este artigo enfatiza especificamente a compatibilidade desse protocolo com dois sistemas modelo muito diferentes: T. brucei e células humanas, mas observe que uma amostra maior ou mais complexa exigiria fixação por congelamento em alta pressão, pois o mergulho manual não é suficiente para preservar toda a amostra 24,25,30. A microscopia de expansão revolucionou a capacidade de visualizar estruturas celulares em nanoescala que antes eram difíceis ou impossíveis de resolver, possibilitando avanços em áreas como biologia celular, biologia do desenvolvimento e^{neurociência 36}. Em particular, o método tem sido transformador na parasitologia, um campo onde a microscopia óptica convencional frequentemente falha. Para muitos parasitas, a microscopia de expansão ultraestrutural (U-ExM) provou ser um divisor de águas, permitindo imagens de alta resolução de organelas intrincadas como o apicoplasto, conóide e elementos do citoesqueleto com clareza^{sem precedentes 6,37,38}. Esses avanços demonstram o poder da U-ExM para desvendar detalhes estruturais antes inacessíveis, abrindo novos caminhos para descobertas em biologia celular, neurociência e biologia de parasitas, além de auxiliar na busca por potenciais alvos terapêuticos. Além disso, o ExM permanece compatível com anticorpos de imunofluorescência comumente utilizados, o que facilita sua integração nos fluxos de trabalho existentes. Na maioria dos casos, anticorpos rotineiramente usados para microscopia de fluorescência ou western blot atuam eficazmente em amostras expandidas, eliminando a necessidade de reagentes especializados. Essa acessibilidade torna o Cryo-ExM uma opção atraente para muitos laboratórios de pesquisa biológica, oferecendo imagens de alta resolução sem o custo ou a complexidade tipicamente associados a sistemas avançados de imagem.

Apesar de suas vantagens, o ExM tem certas limitações. Uma grande desvantagem é o consumo substancial de anticorpos, que pode ser caro ou problemático, especialmente para anticorpos caseiros disponíveis em quantidades limitadas. Aqui está o motivo pelo qual propomos essa estratégia de protocolo para reduzir o volume de anticorpos usados para imunocoloração (Figura 2D,E). O processo de expansão também aumenta a espessura da amostra, o que pode afetar a capacidade de visualizar estruturas mais profundas devido às limitações de distância de trabalho das alvos padrão de microscópio. Essa limitação pode ser particularmente desafiadora ao estudar amostras maiores e mais espessas, onde regiões mais profundas podem não ser efetivamente fotografadas com microscópios convencionais. Além disso, a expansão do tecido pode, às vezes, introduzir distorções mecânicas, exigindo passos cuidadosos de validação e correção para garantir representações espaciais precisas. Por fim, a ExM clássica depende estritamente da fixação da amostra, que pode variar de amostras biológicas ou de estrutura subcelular para observação. Embora centriolos e cílios sejam estáveis o suficiente para serem expandidos sem pré-fixação, organelas celulares exigem diferentes tipos de fixação química (PFA, metanol, glutaraldeído), que podem criar artefatos e impedir a observação de várias estruturas celulares juntas. Por fim, como o ExM é compatível com várias modalidades de imagem de super-resolução, como Microscopia de Iluminação Estruturada (SIM⁾³⁹, Microscopia de Depleção por Emissão Estimulada (STED⁾⁴⁰, Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta (dSTORM)⁴¹ e, mais recentemente, Microscopia de Folha^{de Luz 42}, a abordagem descrita neste estudo fornece uma ferramenta versátil para investigar estruturas celulares com alta precisão. Um estudo recente combinou criofixação com microscopia de expansão^{iterativa 32}, ultrapassando ainda mais os limites da resolução enquanto preserva o estado natural da célula o máximo possível graças à criofixação.

Ao permitir que essas técnicas avançadas de imagem capturem células em seu estado nativo, o Cryo-ExM abre caminho para futuros estudos de processos celulares complexos com clareza sem precedentes. Essa abordagem também abre novas possibilidades para a microscopia correlativa de luz e eletrônica (CLEM), aumentando ainda mais seu potencial para imagem multimodal.

Em conclusão, o ExM representa uma ferramenta poderosa para imagens de super-resolução, com ampla aplicabilidade em diversas amostras biológicas. Sua compatibilidade com microscópios padrão, versatilidade nos tipos de amostras e implementação relativamente simples o tornam uma escolha atraente para muitos laboratórios. Com avanços contínuos na técnica, esperamos melhorias adicionais na resolução, uso de anticorpos e manuseio de amostras que aumentarão suas capacidades e a tornarão ainda mais acessível para uma ampla gama de aplicações biológicas. O Cryo-ExM, em particular, se destaca como um avanço promissor, oferecendo um meio para estudar estruturas celulares com detalhes excepcionais, preservando sua integridade nativa, ultrapassando os limites da microscopia moderna.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suporte metálico para tubos de 5ml	Dominique Dutscher	QB-E5	Etapa de substituição por congelamento
Êmbolo criogênico manual 620	RHOST	https://rhost-em.com/	Etapa de criofixação
Acetona 99,8% AcroSeal	Acros Organics	Gato. nº 67-64-1	Etapa de substituição por congelamento
Acrilamida 40% (AA)	Sigma-Aldrich	A4058	Procedimento de expansão   (âncora)
Ácido acrílico	Sigma-Aldrich	8.00181	Procedimento de expansão (polímero)
Persulfato de amônio (APS)	Thermo Fisher	17874	Procedimento de expansão (polímero)
Punção de biópsia	Dominique Dutscher	PUK-40	Necessário para cortar o gel antes da desnaturalização
BSA	Sigma-Aldrich	P1379	Imunocoloração
Câmara celular Attofluor	Invitrogen	A7816	Câmara de imagem adaptada para coberturas de 24mm para imagem
Câmara de celas	Serviço de Ampliação Vitalícia	10900	Câmara de imagem adaptada para coberturas de 18mm para imagem
Coberturas 12 mm	Dominique Dutscher	100040	Crescimento de células / fixação de T. brucei
Coberturas 24 mm	Dominique Dutscher	900547	Imagem
Coberturas 18mm	VWR	631-0153	Imagem
Gaz	Linde Gaz	88888DE	Necessário para criofixação
Formaldeído 36.5&ntraço; 38% (FA)	Sigma-Aldrich	F8775	Procedimento de expansão   (âncora)
Glutaraldeído 25% (GA)	Sigma-Aldrich	G5882	Etapa de substituição por congelamento
Glicerol	Euromedex	EU3550	Armazenamento de gel a longo prazo
Nitrogênio líquido	Linde Gaz	2200975	Necessário para criofixação (resfriamento do sistema)
Microtubo clear-lock 5 ml	Dominique Dutscher	390932A	Necessário para substituição por congelamento
Agulha 18G	Dominique Dutscher	050123B	Necessário para coletar acetona
N,N-metilbisacrilamida 2% (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533, SIGMA	Procedimento de expansão (polímero)
Paraformaldeído 16% (PFA)	EMS	Gato. nº 15710	Etapa de substituição por congelamento
Poli-D-Lisina	Sigma-Aldrich	P1024	Revestimentos para cobertura de amostras / imagens
Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P1274	Revestimentos para cobertura de amostras / imagens
Reduicer de pressão	Linde Gaz	CPLH0SJ-LIN224	Reduicador de pressão permitindo a distração de etano (criofixação)
Seringe Terumo 10 ml	Dominique Dutscher	50132	Necessário para coletar acetona
Kit de elastomer de silicone	Dow	4001834	Kit para preparação de placas de poço silionado (imunocoloração) & nbsp;
Acrilato de Sódio 97-99% (SA)	Sigma-Aldrich	408220	Procedimento de expansão (polímero)
AK Scientific	R624	Procedimento de expansão (polímero)
Dodecilsulfato de sódio	Euromedex	EU0660	Procedimento de expansão (desnaturação)
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Thermo Fisher	17919	Procedimento de expansão (polímero)
Tubings	Termo Científica	8060-0060	Tubos para desfregamento de etano (criofixação)
Pré-adolescente-20	Euromedex	1005-7	Imunocoloração
Pinças Dumont n° 5	FineScienceTools	11255-20	Manipulação dos coverslips