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Artigo de método

Um ensaio microscópico de cloreto 2,3,5-trifeniltetrazólio para análise precisa e confiável da lesão miocárdica

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DOI:

10.3791/68596

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28 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O atual ensaio 2,3,5-Trifeniltetrazólio (TTC) introduz um protocolo refinado de coloração TTC que permite a análise de lesão do miocárdio em resolução microscópica, produzindo imagens de alta qualidade que permitem uma avaliação precisa e confiável do tamanho do infarto e da viabilidade do cardiomiócito em nível celular.

Resumo

Neste protocolo, apresentamos um método refinado baseado em cloreto de 2,3,5-Trifeniltetrazólio (TTC) para a análise precisa e confiável do infarto do miocárdio (IM) em resolução celular. Esse protocolo envolve um procedimento de coloração TTC em duas etapas realizado em corações infartados 24 hpost-MI: perfusão, na qual uma solução TTC a 1% é perfundida retrogradamente através da vasculatura coronariana via cânula aórtica, e imersão, onde o coração é posteriormente incubado em solução TTC a 4 °C durante a noite. Após a coloração, o coração é incorporado em composto OCT e criossecado transversalmente em fatias de 50 μm de espessura em intervalos de 100 μm. Após um processo de fixação de 24 horas com o fixador de Zamboni, uma fronteira nítida e distinta entre o miocárdio viável (vermelho profundo) e o tecido necrótico (amarelo) torna-se discernível sob exame microscópico. Notavelmente, este ensaio microscópico de TTC permite a detecção de IM não apenas na fase aguda (24 horas pós-IM), mas também em uma janela de tempo estendida além de 7 dias. Como o ensaio microscópico TTC gera imagens de múltiplas camadas (80 fatias por coração), desenvolvemos um algoritmo robusto e semi-automatizado baseado em cores, que permite a análise rápida e eficiente de grandes conjuntos de dados de imagens e quantifica o tamanho global do infarto em minutos. Com essas melhorias, a abordagem atual refina substancialmente o processo de coloração da TTC e oferece uma ferramenta amplamente aplicável e valiosa para laboratórios que investigam lesão isquêmica cardíaca.

Introdução

Nas últimas duas décadas, a cardioproteção continuou sendo adotada como uma estratégia fundamental para preservar os cardiomiócitos após graves insultos isquêmicos aocoração 1. Tanto em contextos experimentais quanto clínicos, a extensão final da lesão miocárdica é um indicador crítico para avaliar a eficiência das intervençõescardioprotetoras 2. Assim, uma avaliação confiável e precisa do tamanho do infarto é altamente desejável e fundamentalmente importante.

Em modelos de roedores, o protocolo padrão para avaliar o tamanho do infarto pós-morte baseava-se principalmente na atividade da desidrogenase mitocondrial, que converte enzimaticamente o composto incolor cloreto 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) em um precipitado vermelho em células viáveis, enquanto permanece cinza claro no tecidonecrótico 3. Embora a coloração baseada em TTC seja simples e econômica, ela apresenta vários desafios metodológicos e limitações intrínsecas. Incluem fatias cardíacas que passam por contraturas em solução TTC, que distorce gravemente o tecido e impede que as fatias fiquem planas para planimetria; espessura desigual da fatia durante o processamento da amostra; e qualidade de imagem ruim, que dificulta a delimitação precisa do limite do infarto. Nos últimos anos, várias modificações técnicas foram introduzidas no processo de preparação da amostra, como o uso de matrizes acrílicas de coração4 ou o semicongelamento do coração para facilitar afatiação 3. Embora essas modificações tenham aumentado substancialmente a praticidade do corte tecidual, a abordagem convencional continua a se basear em imagens macroscópicas de seções grossas do coração, frequentemente produzindo qualidade de imagem variável e subótima5, com contraste de cor insuficiente que pode introduzir subjetividade substancial na medição doinfarto 6. Além disso, o método convencional exige o uso de tecido cardíaco inteiro, o que impede análises multipropósito nas mesmas amostras de tecido, como a cocoloração imune de proteínas reguladoras para identificar cascatas de sinalização importantes envolvidas na sobrevivência cardíaca. Como resultado, um número considerável de animais é frequentemente necessário para responder adequadamente a diversas questões de pesquisa.

Para superar essaslimitações 5, desenvolvemos um protocolo adequado para imagem microscópica da coloração TTC. Esse método combina etapas de coloração "perfusão + imersão" com criosseção do tecido cardíaco em fatias finas otimizadas para imagem por microscópio óptico. Embora esse método tenha sido recentementerelatado 7, acreditamos que fornecer procedimentos experimentais detalhados aumenta sua praticidade e acessibilidade. Além disso, como o método microscópico TTC gera imagens de alta resolução compostas por múltiplas camadas de seção cardíaca, desenvolvemos um algoritmo semiautomático robusto baseado em cores para abordar a natureza demorada da análise de grandes conjuntos de dados de imagens. O método atual permite a detecção rápida das regiões do infarto e a quantificação do tamanho global do infarto em minutos.

No geral, o protocolo apresentado aqui serve como uma ferramenta valiosa, permitindo que pesquisadores implementem esse método de forma eficiente, fácil e precisa.

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Protocolo

Todos os experimentos foram aprovados pela LANUV de Nordrhein-Westfalen, Alemanha, e realizados de acordo com as diretrizes ARRIVE e o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os equipamentos e produtos químicos necessários estão listados na Tabela de Materiais.

1. Configuração de um sistema de retroperfusão Langendorff

NOTA: O sistema consiste em uma torneira de dois bloqueios e três vias conectada a uma cânula aórtica feita de uma agulha embotada calibre 20 e duas portas de infusão, uma para a solução de lavagem (soro salino tamponado com fosfato (PBS)) e outra para a infusão TTC (porta TTC). Ao alternar a direção da torneira de registro de três vias, o perfusado pode ser entregue ao coração de forma intercambiável.

  1. Fixe o aparelho horizontalmente em uma placa de Petri de 150 mm usando um pedaço de fita adesiva para evitar movimentos indesejados durante etapas posteriores.
  2. Ajuste a ponta da cânula para ficar 1 mm acima da base, alinhando-a com o nível da raiz aórtica quando o coração estiver plano.
  3. Preencha o sistema com PBS gelado usando uma seringa de 10 mL através da porta PBS.
  4. Preparar uma solução nova de coloração (1% de tentar dissolver em PBS); é necessário um volume mínimo de 6 mL para cada coração.
    ATENÇÃO: Tentar engravidar geralmente é considerado perigoso e requer manuseio cuidadoso, pois pode causar irritação leve na pele, irritação grave nos olhos e é prejudicial se inalado. Descarte resíduos e resíduos de acordo com os requisitos das autoridades locais.
  5. Use uma seringa de 3 mL para pré-preencher a porta TTC com a solução de mancha.
  6. Certifique-se de que não haja bolhas de ar acidentais no sistema, pois elas podem causar êmbolos de ar que interfeririam com manchas subsequentes. Na maioria dos casos, bolhas de ar são visíveis no sistema; quando presente, remova-as retirando e reabastecendo o PBS enquanto toca suavemente a torneira de três posições na cânula vertical.
  7. Forme um nó solto de meio quadrado usando um ponto de seda 6-0 e coloque-o na extremidade distal da cânula para fixação posterior da raiz aórtica.

2. Preparação da amostra cardíaca

NOTA: Camundongos C57BL/6J (20-25 g) foram usados neste estudo. O infarto experimental do miocárdio (IM) foi induzido por ligamento cirúrgico da artéria descendente anterior esquerda (LAD) por 30 a 60 minutos, conforme descrito abaixo. A metodologia de indução do MI já foi relatadaanteriormente em 8 e não está detalhada neste manuscrito. Salvo indicação em contrário, amostras cardíacas foram coletadas 24 horas após o IM.

  1. Retire o camundongo com infarto da gaiola e eutanasie-o por luxação cervical sob anestesia profunda de isoflurano (3 %, v/v).
    NOTA: Todos os procedimentos de eutanásia devem ser devidamente documentados e relatados, incluindo o motivo da eutanásia e o método utilizado, de acordo com as regulamentações locais.
  2. Transfira o animal eutanasiado para a mesa de cirurgia e prenda as quatro extremidades com fita adesiva.
  3. Remova a pele da região do meio do abdômen para a parte média da pata dianteira usando pinças e tesouras microdissecantes.
  4. Faça uma incisão transversal de 2 cm na parede do músculo abdominal, logo abaixo do diafragma, para permitir a toracotomia subsequente.
  5. Abra o diafragma com tesouras finas para expor o coração, depois faça incisões bilaterais pela pele, músculo e costelas para abrir a cavidade torácica.
  6. Corte o diafragma bilateralmente e exponha totalmente o coração levantando o esterno.
  7. Imediatamente despeje 20 mL de PBS gelado na superfície do coração para interromper o batimento cardíaco.
  8. Extraia o coração junto com os tecidos ao redor (pulmões e esôfago) e transfira a massa tecidular para um béquer de 50 mL contendo PBS congelado por cerca de 1 minuto para permitir que o batimento cardíaco diminua.
  9. Transfira o coração para uma placa de Petri de 150 mm e corte a raiz aórtica livre de tecido conjuntivo sob um microscópio binocular usando pinças finas e tesouras.
  10. Remova suavemente o timo e exponha a aorta ascendente.
  11. Apare a raiz aórtica dissecando o tecido conjuntivo.
  12. Pegue o toco aórtico com uma pinça fina e monte sobre a cânula que já está conectada a um aparelho de perfusão pré-preenchido com solução de coloração de PBS e TTC. Use pinças finas para estabilizar a parede radicular da aorta durante a inserção.
  13. Fixe a aorta usando o nó pré-formado e solto na cânula. Inspecione cuidadosamente a cânula e o coração enquanto ela está sendo retro-perfundida com PBS. O preenchimento do coração pode ser confirmado visualmente pelo volume do ventrículo à medida que o volume de PBS entra no coração aumenta.
  14. Deixe os tecidos extracardíacos (pulmões e esôfago) no local para apoiar o coração em uma posição natural e adequada.

3. Coloração do TTC

  1. Cubra o coração com papel de seda úmido assim que a canulação estiver fixa.
  2. Comece a enxaguar o coração com uma seringa pré-conectada de 10 mL, cheia de PBS gelada, a uma dose de 2-3 mL/min por 3 minutos, até que o eluado cardíaco desapareça. Isso garante que apenas uma quantidade mínima de sangue permaneça no coração e nos coronaris. Durante essa etapa, evite pressão excessiva durante a perfusão, pois pode levar à ruptura do ventrículo infarto.
  3. Inspecione o coração sob um microscópio binocular para garantir que não haja vazamento na raiz aórtica e que ele infle corretamente sob pressão de perfusão.
  4. Gire a torneira de três vias em direção à solução TTC e infunda lentamente 1 mL de solução de tingimento pela porta TTC por mais de 30 s.
  5. Reinfunde 1 mL de solução para tentar conceber 5 minutos depois e repita essa etapa mais uma vez após mais 5 minutos (10 minutos após a primeira infusão para tentar engravidar). Um total de 3 mL de solução para tentar conceber é necessário para uma infusão de 3x ao longo de 15 minutos.
  6. Inspecione a superfície do coração sob um microscópio binocular. Neste ponto, já deveria ser visível uma distinção clara entre o miocárdio viável (vermelho profundo) e o tecido necrótico (cinza claro).
  7. Remova todos os tecidos não cardíacos com tesoura fina e transfira o coração manchado para um tubo cônico de 15 mL contendo 3 mL de solução para engravidar.
  8. Coloque o tubo cônico a 4 °C durante a noite para uma segunda camada de tingimento por imersão.

4. Preparação de blocos de tecido

  1. Retire o coração do tubo cônico e seque cuidadosamente com papel de seda. Neste ponto, a coloração no miocárdio viável torna-se mais pronunciada, e o miocárdio não perfundido (regiões epicárdica e potencialmente endocárdica) também apresenta coloração vermelha clara.
  2. Encha uma cânula curva e embotada de calibre 20 com composto de temperatura de corte ideal (OCT) usando uma seringa de 1 mL.
  3. Excise a válvula tricúspide com tesouras finas e insira a cânula no ventrículo direito.
  4. Preencha a cavidade com composto OCT (aproximadamente 50-80 μL) e interrompa a infusão quando houver refluxo de líquido.
  5. Expõe a válvula mitral e insira a cânula pelo átrio esquerdo e a válvula mitral no ventrículo esquerdo.
  6. Infunde suavemente a cavidade com composto OCT (aproximadamente 80 μL) e interrompa a infusão quando houver saída da aorta.
  7. Prepare uma pequena cápsula cilíndrica (1 cm de diâmetro) feita de papel alumínio e encha com 300 μL de composto OCT.
  8. Coloque cuidadosamente o coração na cápsula em posição de ápice para baixo e ajuste para uma orientação vertical. Vista de cima para baixo, o ápice não deve se projetar excessivamente para nenhum dos lados.
  9. Imerga a cápsula em uma solução de 2-metilbutano pré-resfriada a -30 °C a -40 °C.
  10. Deixe a amostra permanecer na solução por 5 a 10 minutos para solidificar antes de formar um bloco de tecido.
  11. Rotule o bloco de tecido e armazene-o a -80 °C para análise histológica adicional.

5. Criossecção e fixação

  1. Monte o bloco de tecido em um mandril de criostato usando composto OCT.
  2. Coloque o mandril no criostato e ajuste a temperatura para aproximadamente -24 °C.
  3. Corte o bloco de tecido até que o ápice fique visível.
  4. Ajuste a espessura da seção para 50 μm e colete cada segunda fatia, resultando em intervalos de 100 μm entre as fatias.
    NOTA: Evite dobras de tecido durante a criossecção. Isso é amplamente minimizado preenchendo as cavidades ventriculares vazias com composto OCT (veja os passos 4.4-4.6).
  5. Alinhe as fatias sequencialmente em lâminas de vidro para microscópio, colocando oito pedaços por lâmina. No total, são esperadas 80 seções, ou seja, 10 slides, por coração.
  6. Seque os slides com um secador de cabelo na configuração mais baixa usando fluxo de ar em temperatura ambiente (sem necessidade de aquecimento) por aproximadamente 10 minutos.
  7. Submerga as lâminas em uma câmara de coloração preenchida com solução de Zamboni (um fixador contendo 2% de paraformaldeído e 0,4% de ácido pícrico, w/v).
    ATENÇÃO: O fixador de Zamboni pode causar uma reação alérgica na pele e suspeita-se que cause defeitos genéticos e carcinogênese. Descarte resíduos e resíduos de acordo com as regulamentações das autoridades locais.
  8. Fixe o tecido cardíaco a 4 °C durante a noite. Essa fixação de longo prazo garante que a superfície do tecido cardíaco permaneça livre de bolhas de ar formadas durante o processo de fixação.
  9. Após a fixação, retire as lâminas do fixador e enxágue três vezes com PBS.
  10. Monte os ferrolhos com meio de montagem e cubra as seções com varas de cobertura. Após essa etapa, as lâminas de coração estão prontas para aquisição da imagem.
  11. Armazene as amostras em uma caixa de slides em temperatura ambiente.
    NOTA: Como os precipitados formazanos são insolúveis em água, a coloração pode ser preservada por anos sem perda de intensidade.

6. Imagem e processamento

  1. Monte um microscópio óptico usando uma objetiva 1,25x e execute o software CellSens para imagem.
  2. Posicione a seção do coração no centro do campo de visão.
  3. Ajuste o tempo de exposição, o foco e o balanço de branco da câmera conforme necessário.
  4. Capture imagens de cada seção e salve todas as imagens do mesmo coração em uma pasta dedicada.
  5. Copie o script R (Arquivo Suplementar 1) para a plataforma RStudio e execute um algoritmo automatizado baseado em R para avaliar o MI. O algoritmo calcula o tamanho planimétrico dos infartos para cada corte e calcula o volume total do infarto para todo o coração.
  6. Exporte o conjunto de dados para um arquivo Excel e analise os dados conforme necessário.
  7. Importe todas as imagens de cada coração para a plataforma ImageJ para reconstrução 3D subsequente.
  8. Empilhe todas as imagens em ordem coerente e sequencial usando o menu pop-up da plataforma ImageJ.
  9. Crie uma construção 3D usando a função de plotamento de superfície.
  10. Abra a janela do Visualizador de Volume e ajuste todos os parâmetros para projeção 3D.
    NOTA: A metodologia para imunohistoquímica9 e os vídeos para a coloração convencionalTTC 4,5 já foram relatados anteriormente e não estão incluídos neste manuscrito.

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Resultados

As etapas principais envolvidas na realização da coloração microscópica TTC são ilustradas na Figura 1. Após duas rodadas de coloração TTC, um padrão perfurado distinto tornou-se visível na superfície do coração. O corte serial de todo o coração em intervalos de 100 μm resultou em aproximadamente 80 seções de tecido, com o local da ligadura localizado ao redor do60º corte. Em cada seção, a coloração vermelha intens...

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Discussão

O infarto do miocárdio (IM), resultante de isquemia prolongada do miocárdio, continua sendo uma grande preocupação global de saúde, já que a lesão isquêmica frequentemente prejudica a função contrátil do coração necessária para a circulação sanguínea eficaz. Nas últimas décadas, esforços significativos têm sido dedicados para identificar intervenções ou compostos que aumentam a resistência cardíaca ao estresseisquêmico 1. Embora desfechos substitutos alternativos,...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pela FoKo em 23/2013 e pelo Instituto de Pesquisa Cardiovascular de Düsseldorf (CARID).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Objetivo 1,25xOlympusPlanApo 1.25X/0.04Imagem
Seringas de 10 mLB.Braum4617100VRetroperfusão
2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólioMilipore1.08380.0100Produtos químicos
Cânula 20 GBD305895Retroperfusão
3  seringas mLB.Braum4617022VRetroperfusão
Torneira de 3 viasB.Braum16494CRetroperfusão
Aquamount BDH362262HCirosseção
EquilíbrioOhausN/APesagem de produtos químicos
Microscópio binocularLeicaMZ6Canulação
C57BL/6JJanvierN/AAnimais
CâmeraOlympusUC30Imagem
Slips de coberturaEprediaBB02400500A113MN20Cirosseção
CriostatoLeicaM850Cirosseção
Água Duplamente DestiladaMIliporeN/AProdutos químicos dissolvedores
Tesouras finas de dissecaçãoAESCULAPBC702RInstrumentos cirúrgicos
Pinça microdissecante fina  AESCULAPFM001RInstrumentos cirúrgicos
Lâminas de microscópio de vidroEngelbrecht11102Cirosseção
ImageJNIH1,54gProcessamento de imagem
IsofluranoPiramal14150097146754Produtos químicos
IsopropanolRoth  0733.1Produtos químicos
Microscópio ópticoOlympusBX61Imagem
Microdissecação de pinças & nbsp;F.S.T11152-10Instrumentos cirúrgicos
Composto OCTSakura4583Produtos químicos
Placa de PetriTherno Scientific172931Retroperfusão
Soro Tamponado de FosfatoRoth9143.1Produtos químicos
RstudioPosit Software2024.09.0Processamento de imagem
Sutura de sedaF.S.T18020-60Retroperfusão
SoftwareOlympusCellSens V3.2Imagem
Tesoura de dissecação de aço inoxidávelAESCULAPBC257RInstrumentos cirúrgicos
Solução de ZamboniMorphisto12773.0050Produtos químicos

Referências

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  18. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).

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