Artigo de método

Lactiloma baseado em espectrometria de massa e confirmação de proteínas lactiladas

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DOI:

10.3791/68597

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24 de abril de 2026

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1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método usando linhas celulares de carcinoma escamoso esofágico como exemplo para analisar a lactilação de proteínas. O processo envolve analisar a lactilação de proteínas a partir da cultura celular até a confirmação de candidatos, incluindo análise por espectrometria de massa baseada em lactilação e confirmação por imunoprecipitação.

Resumo

Identificada pela primeira vez em 2019, a lactilação, uma nova modificação pós-translacional (PTM) em resíduos de lisina, desde então demonstrou ser de interesse em múltiplas patologias e contextos fisiológicos. Ela possui dois isômeros (L- e D-lactilação) e é conhecida por alterar a formação de complexos, localização celular ou estabilidade de proteínas alvo. Este protocolo descreve um método para analisar a lactilação a partir de cultura celular até a confirmação de potenciais alvos lactilados, usando como exemplo a linha celular TE11 do carcinoma escamoso esofágico. O protocolo a seguir fornecerá detalhes sobre a identificação de proteínas lactiladas por meio da imunoprecipitação (IP) específica de L-lactilisina (KL-LA) de peptídeos para análise por espectrometria de massa (EM): (1) extração de proteínas, (2) redução de proteínas, alquilação e digestão, (3) purificação de proteínas e concentração de peptídeos, (4) IP usando esferas de KL-LA e (5) concentração de peptídeos de KL-LA . Após essas etapas, serão realizadas análises dos dados brutos da EM para identificar sítios lactilados, e a confirmação dessas proteínas latiladas supostas por IP será descrita. Usando esse método, uma variedade de 100 a 500 peptídeos pode ser identificada, e proteínas lactiladas de interesse podem ser confirmadas. Para concluir, estudar proteínas lactiladas tem potencial para aprimorar nosso entendimento da sinalização celular impulsionada por PTM tanto em condições normais quanto em condições de doença.

Introdução

A lactilação é uma modificação pós-traducional (PTM) sobre resíduos de lisina utilizando metabólitos derivados da glicólise. L-lactil-CoA e lactoilglutationa são substratos da L-lactilação (KL-LA) e da D-lactilação (KD-LA), respectivamente 1,2. A L-lactilação é um processo enzimático envolvendo enzimas como a acetiltransferase 3,4. Pelo contrário, a D-lactilação é um processo não enzimático por substituição nucleofílica entre lactoilglutationa e um resíduode lisina 5. Como processo dinâmico, desacetilases como HDAC1-3 foram implicadas como borrachas dalactilação 6. Desde sua descoberta em 20193, demonstrou interesse em múltiplas patologias e contextosfisiológicos 2. Essa PTM foi identificada pela primeira vez em histonas pela observação de um deslocamento de massa de 72,021 Da usando análise de cromatografia líquida de alta performance (HPLC)-espectrometria de massa tandem (MS/MS) 3. Desde então, a lactilação foi detectada em outras proteínas além das histonas e demonstrou afetar a diversidade funcional, localização ou estabilidade das proteínas modificadas, dependendo docontexto 7,8,9,10.

Considerando que as PTMs frequentemente estão em baixa abundância11 e fazem parte de um processo dinâmico etransitório 12, é necessário enriquecimento da PTM investigada por imunoprecipitação (IP). Depois disso, a EM é frequentemente usada para descrever o proteoma ligado a PTM em peptídeos digeridos, como o fosfoproteoma ou o perfil de ubiquitinação11. Assim como ocorre com outros PTMs, lactiloma ou peptídeos lactilados enriquecidos, a proteômica baseada em EM é o método padrão ouro para identificar novos locais de lactilação.

Este protocolo descreve a identificação de peptídeos enriquecidos em KL-LA por meio da proteômica baseada em EM, seguida pela confirmação de proteínas lactiladas por imunoprecipitação. Usando como exemplo linhas celulares de carcinoma escámico esofágico (ESCC), descrevemos um protocolo para retirar proteínas lactiladas para identificação de alvos lactilados baseada em EM e sua confirmação subsequente por IP.

Protocolo

Como as PTMs são um processo dinâmico e transitório, é importante pré-estabelecer a confluência na qual o nível total de lactilação é ótimo usando citometria de fluxo ou Western blot com um anticorpoanti-K L-LA . Por exemplo, uma confluência de 70%-80% é preferível em linhagens celulares de CCE para experimentos de lactiloma e IP, pois o nível total de lactilação está em seu máximo. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular

  1. Cultive células em placas de Petri de 100 mm até que a confluência necessária seja alcançada, como já dito.
    NOTA: Cultive células suficientes para obter entre 0,5 a 1 mg de proteínas para lactilomas ou mais de 2 mg para IP.
  2. Enxague as células com 5 mL de soro fisiológico 1x tamponado com fosfato pré-resfriado (PBS).
  3. Adicione 500 μL de PBS pré-resfriado e colha as células usando um raspador de células. Transfira para um microtubo de baixa ligação de 1 mL.
  4. Centrifuge as células a 2.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente (RT) e descarte o sobrenadante transparente. Pellets de células podem ser armazenados a -80 °C.

2. Lactiloma

NOTA: Sempre use luvas para evitar contaminação da amostra. Use sempre pontas filtradas, microtubos de baixa ligação e água de grau MS.
NOTA: Réplicas biológicas (3-5 em nossa experiência) devem sempre ser realizadas para garantir que as modificações identificadas sejam reprodutíveis.

  1. Extração de proteínas
    NOTA: Trabalhe no gelo.
    1. Prepare o tampão de lise de lactiloma (Tabela 1) e armazene a 4 °C antes do uso. Adicione inibidores de protease logo antes do uso.
    2. Extraia as proteínas usando o volume apropriado do tampão de lise.
    3. Sonice no gelo 12 ciclos de pulso de 5 s + 5 s de desligamento em intensidade de 20%-25%.
    4. Centrifuge a 16.000 x g por 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante transparente contendo as proteínas para um novo microtubo de baixa ligação.
    5. Quantifique proteínas usando um kit de ácido bicinquinínico (BCA) conforme recomendação do fabricante.
      NOTA: O kit BCA é compatível com um máximo de 3 M de ureia. Portanto, as amostras precisam ser diluídas de acordo.
    6. Transfira de 500 μg a 1 mg de proteínas para novos microtubos de baixa ligação. Use a mesma quantidade de proteína para cada amostra. Complete o volume de todas as amostras com o tampão de lise de lactiloma até o mesmo volume final.
  2. Redução, alquilação e digestão enzimática
    1. Adicione ditiotreitol a uma concentração final de 5 mM. Incube a 95 °C por 2 minutos.
    2. Incubar por 30 minutos em tempo de descanso.
    3. Adicione cloroacetamida a uma concentração final de 7,5 mM. Incube em RT por 20 minutos no escuro.
    4. Adicione 3 vezes o volume de amostra (do passo 2.1.6) de 1 M (NH4)2CO3 para reduzir a ureia de 8 M para 2 M.
      NOTA: Se o volume total exceder a capacidade dos microtubos, divida-os em dois microtubos.
    5. Adicione 1 μg de tripsina grau EM por cada 100 μg de proteínas. Incube durante a noite a 30 °C. Prossiga com a purificação da amostra.
  3. Purificação e concentração de peptídeos
    NOTA: Trabalho na RT.
    1. Acidifice a amostra adicionando ácido trifluoroacético (TFA) a uma concentração final de 0,2%.
    2. Prepare as seguintes soluções em água grau MS frescamente: 0,1% TFA, 1% ácido fórmico (FA) e 1% FA/50% acetonitril.
    3. Use colunas de C18 de 100 mg para prosseguir com a purificação.
      NOTA: Para usar esta coluna, use duas pontas de pipeta: carregue a coluna com uma e corte a ponta da outra para ejetar o líquido da coluna. Certifique-se de que a coluna permaneça consistentemente úmida. Use uma coluna por amostra.
    4. Carregue a coluna com 1 mL de acetonitrila 100%, a solução molhante, e ejete. Repita duas vezes.
    5. Equilibre a coluna carregando 1 mL de 0,1% de TFA e ejete. Repita duas vezes.
    6. Carregue a coluna com 1 mL da amostra acidificada. Prossiga com 10 ciclos de carga/ejeção da amostra. Repita se ainda restar alguma amostra.
    7. Lave a coluna carregando 1 mL de 0,1% de TFA e ejete. Repita duas vezes.
    8. Para a elução, prossiga com 10 ciclos de carga/ejeção usando 750 μL de 1% de FA/50% acetonitrila. Colete em um novo microtubo de baixa ligação. Repita com mais 750 μL de acetonitrila 1%/50%, totalizando 1,5 mL de peptídeos purificados.
      NOTA: Identifique o microtubo na lateral em vez de na tampa para evitar contaminar amostras ao furar furos na tampa.
    9. Perfure de 1 a 3 furos na tampa dos microtubos com uma agulha para evaporação.
    10. Usando um concentrador a vácuo, concentre as amostras a 60 °C pelo tempo necessário (para amostras em volume final de 1,5 mL, isso pode levar pelo menos 4 horas). Em seguida, prossiga com a imunoprecipitação dos peptídeos.
  4. Imunoprecipitação usando esferas KL-LA
    1. Prepare o buffer de lavagem e o buffer IP de lactiloma (Tabela 2).
    2. No gelo, adicione 200 μL de tampão IP aos peptídeos concentrados, misturando cuidadosamente para cima e para baixo até dissolver. Alguns precipitados ainda podem ser visíveis.
    3. Centrifuge a 12.000 x g por 10 minutos a 4 °C para remover quaisquer precipitados.
      NOTA: Após a centrifugação, a amostra pode ser dosada como etapa de controle usando, por exemplo, um espectrofotômetro para quantificar a concentração do peptídio em 205 nm.
    4. Lave as esferas conjugadas com agarose de KL-LA 3 vezes com 200 μL de PBS 1x gelado, centrifugando a 2.000 x g por 1 minuto a 4 °C e removendo o sobrenadante transparente após cada lavagem.
      NOTA: Para 1 mg de proteína no início deste protocolo, use 20 μL de esferas conjugadas com agarose de KL-LA , anteriormente alicotadas em tubos de baixa ligação de 0,5 mL para fácil uso.
    5. Transfira o supernadante transparente contendo os peptídeos ressuspensos para o microtubo de 0,5 mL contendo as esferas pré-lavadas. Sele os tubos com filme de parafina para evitar vazamentos.
    6. Incube durante a noite com uma rotação suave de ponta a ponta a 4 °C.
      NOTA: Os passos 2.4.7-2.4.12 são todos executados a 4 °C.
    7. Faça pellets nas esferas por centrifugação a 2.000 x g por 1 minuto. Descarte o sobrenadante transparente.
    8. Adicione 200 μL de buffer IP de lactiloma e lave por 15 s invertendo o tubo. Centrifuge a 2.000 x g por 30 s e descarte o supernadante transparente.
    9. Repita o passo 2.4.8 uma vez.
    10. Adicione 200 μL de buffer de lavagem e lave por 15 s invertendo o tubo. Centrifuge a 2.000 x g por 30 s e descarte o supernadante transparente.
    11. Repita o passo 2.4.10 duas vezes.
    12. Adicione 200 μL de água de grau MS e lave por 30 s invertendo o tubo. Centrifuge a 2.000 x g por 1 minuto e descarte o sobrenadante transparente.
      NOTA: As etapas restantes do protocolo de lactiloma são realizadas na RT.
    13. Elude os peptídeos ligados com 100 μL de tampão de elução (0,1% TFA recém-preparado) por 1 minuto com rotação suave de ponta a ponta em RT. Centrifuge a 2.000 x g por 2 minutos.
    14. Repita o passo 2.4.13 mais duas vezes e combine os eluídos. Prossiga com a purificação das amostras.
  5. Concentração e purificação dos peptídeos KL-LA
    1. Prepare as seguintes soluções em água doce de grau MS: 0,1% TFA, 1% FA e 1% FA/50% acetonitrila.
      NOTA: Logo antes de iniciar a purificação, prepare a quantidade certa de solução em microtubos de 1,5 mL (passo 2.5.3: 300 μL de 100% acetonitrila, passo 2.5.4: 300 μL de 0,1% TFA, passo 2.5.6: 300 μL de 0,1% TFA e passo 2.5.7: 300 μL de 1% de FA/50%).
    2. Use pontas de C18 de 100 μL para prosseguir com a purificação.
      NOTA: As pontas C18 de 100 μL são usadas da mesma forma que as pontas tradicionais de pipeta. Mantenha o polegar engatado e nunca solte o êmbolo entre os passos para manter a coluna úmida e evitar a entrada de ar.
    3. Aspire 100 μL de acetonitrila 100%, a solução molhante, e dispense cuidadosamente sem ejetar todo o líquido. Repita duas vezes.
    4. Equilibre a coluna aspirando 100 μL de 0,1% TFA e dispense cuidadosamente. Repita duas vezes.
    5. Carregue a coluna com 100 μL da amostra de peptídeos KL-LA . Prossiga com 10 ciclos de carga/ejeção em um novo microtubo de baixa ligação. Repita se ainda restar alguma amostra.
    6. Lave a coluna aspirando 100 μL de 0,1% TFA e dispense. Repita duas vezes.
    7. Prossiga com 10 ciclos de carga/ejeção para eluição usando 100 μL de 1% FA/50% acetonitrila em um novo microtubo de baixa ligação. Repita duas vezes e combine os eluados.
      NOTA: Os peptídeos que se ligam à ponta C18 podem impedir que a ponta aspire 100 μL de cada vez. Repita essa etapa até que não haja mais líquido no microtubo (300 μL) na etapa 2.5.7.
    8. Perfure de 1 a 3 furos na tampa dos microtubos com uma agulha para evaporação.
      NOTA: Identifique os microtubos na lateral do tubo em vez de na tampa para evitar contaminar amostras ao perfurar os furos.
    9. Usando um concentrador a vácuo, concentre as amostras a 60 °C pelo tempo necessário para que o líquido evapore (para um volume total de 300 μL, pode levar pelo menos 2 horas).
    10. Resuspenda os peptídeos concentrados em 30 μL de 1% de FA.
    11. Seguindo as diretrizes da sua plataforma de espectrometria de massa, quantifique peptídeos com um espectrofotômetro a 205 nm para determinar sua concentração.
    12. Transfira para um frasco de vidro e mantenha a 4 °C até a análise da EM.

3. Análise de mestrado e bioinformática

NOTA: As amostras foram analisadas na Instalação Central de Proteômica da Universidade de Sherbrooke usando um espectrômetro de massa (MS) (operado no modo de Aquisição Dependente de Dados com Fragmentação Paralela de Acumulação Serial (DDA-PASEF).

  1. Espectrometria de massa
    1. Para cada amostra, injete 375 ng de peptídeos em um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
    2. Carregue peptídeos em uma coluna de armadilha a uma vazão constante de 4 μL/min.
    3. Separe os peptídeos em uma coluna analítica C18 usando um gradiente de 2 horas de 5%-37% acetonitrila em 0,1% de FA a uma vazão de 400 nL/min.
    4. Realize ionização por eletrospray com as seguintes configurações: Tensão capilar: 1500 V, Gás seco: 3,0 L/min, Temperatura seca: 180 °C, TIMS-Pressão de entrada: 2,6 mBar.
    5. Adquira os espectros de massa em uma faixa de 100-1700 m/z usando o modo DDA auto-MS/MS.
      NOTA: O instrumento está configurado para detectar estados de carga de 0 a 5+. Uma configuração de Espectrometria de Mobilidade de Íons Aprisionados (TIMS) é usada com um tempo de rampa de 100 ms e 10 varreduras de Acúmulo Paralelo - Fragmentação Serial (PASEF) por ciclo de aquisição, resultando em um ciclo de trabalho de 1,17 s. A exclusão dinâmica é definida para 0,4 min.
    6. Realize fragmentação usando uma energia de dissociação induzida por colisão (CID) linearmente aumentada de 20-59 eV em uma faixa de mobilidade iônica de 0,6-1,6 Vs/cm².
      NOTA: A intensidade alvo é definida em 20.000, com um limiar de intensidade de 2.500. Um polígono padrão de filtro é aplicado para priorizar precursores ao longo da linha diagonal de varredura para peptídeos carregados +2, +3 e +4 no plano de mobilidade m/z-íon.
  2. Pré-processamento de dados: Análise MaxQuant
    NOTA: Os próximos passos são realizados usando o software MaxQuant v.2.6.713 para identificar os peptídeos lactilados.
    1. Na seção superior direita, clique na aba Configuração e verifique se a lactilação foi adicionada como uma modificação.
    2. Se não, use o banco de dadosUnimod.org 14. Faça login como convidado e pesquise por lactilação (acessão #2114).
    3. Clique no botão Adicionar . No Nome, escreva Lactilação (K), insira a composição como escrita no Unimod clicando no botão Mudar .
    4. Verifique a massa monoisotópica obtida. Clique em OK.
    5. No canto superior esquerdo da tela, em azul, clique no botão Salvar as mudanças .
    6. Na seção superior esquerda, clique em Dados brutos. Carregue arquivos de dados brutos e nomei-os automaticamente usando o botão Sem frações .
    7. Defina o número de threads no canto inferior esquerdo com base no número de núcleos acessíveis no computador.
    8. Na aba específica do grupo , clique em Modificações em azul.
    9. Adicione Lactilação às modificações de variáveis clicando no botão de seta para adicionar ao quadrado à direita.
    10. Clique em Quantificação sem rótulo. Insira LFQ e altere o tipo de normalização para nenhum.
    11. Clique em Digestão. Certifique-se de que a Tripsina/P seja adicionada ao quadrado à direita.
    12. Aumente o máximo de clivagens perdidas para 4 , pois a lactilação pode afetar a digestão da tripsina.
    13. Clique em Instrumento. Altere a tolerância de peptídeos da busca principal para 20, considerando que a lactilação não é uma PTM comum.
    14. Na seção superior esquerda, clique em Parâmetros Globais. Adicione um arquivo Fasta, anteriormente baixado do Uniprot ou Ensembl, para a espécie correspondente.
    15. Clique em Regra de Identificador e Teste para garantir que o arquivo Fasta pode ser lido corretamente.
    16. Clique em Quantificação de Proteína em azul. Adicione Lactilação ao quadrado à direita.
    17. Clique em Identificação em azul. Mude FDR para 0,05. Certifique-se de que os segundos peptídeos e a correspondência entre as execuções estejam verificados.
    18. Clique em Quantificação sem rótulo em azul. Marque as caixas iBAQ e Top3.
    19. Na seção superior direita, clique em Desempenho.
    20. Na seção inferior, clique em Começar em azul.
  3. Identificação de proteínas lactiladas
    NOTA: Ao final da execução do MaxQuant, haverá múltiplos arquivos de saída obtidos, tais como:
    • Lactilação (K)Sites: arquivo primário de interesse - contém informações específicas do local sobre resíduos de lisina lactilados em uma sequência peptídica precisa (proteína identificada, localização da lactilação na sequência, intensidades, nível de confiança).
    • Parâmetros de lactilação: contém todas as informações sobre configurações e limiares usados durante a análise MaxQuant.
    • Peptídeos de lactilação: peptídeos identificados modificados e não modificados.
    • Grupos proteicos de lactilação: grupos proteicos identificados e sua ligação com a lactilação detectada.
    O uso desses arquivos dependerá da questão da pesquisa. O próximo passo descreve como identificar um local lactilado.
    1. Abra o arquivo Lactylation (K)Sites no Excel.
    2. Duplique a aba na parte inferior de Lactilação (K)Sites para manter os dados originais.
    3. Ordene de A a Z as colunas Reverso e Potencial contaminante . Se houver valor em algumas linhas, apague essas linhas.
    4. Nesta nova aba, mantenha apenas as colunas necessárias, tais como: (1) Proteína:UniProt 14 Número primário de acesso, (2) Posições dentro das proteínas: Posição prevista da lactilação, importante de confirmar conforme descrito posteriormente, (3) Nomes de proteínas, (4) Nomes de genes, (5) Número de lactilação (K detectado no peptídeo correspondente), (6) Probabilidades de lactilação (K) (Probabilidade de 1 na posição da lactilação), (7) Intensidade (soma de todas as intensidades individuais pertencentes ao peptídeo correspondente).
    5. Complete quaisquer valores faltantes, como nomes de proteínas ou nomes de genes.
    6. Mantenha apenas o número do primeiro acesso na coluna ''Proteínas''. A tabela obtida representa todos os peptídeos lactilados detectados junto com a proteína mais provável na qual esse peptídeo pode ser encontrado.
      NOTA: Como a lactilação não é uma PTM abundante, espera-se que entre 100 e 500 peptídeos sejam identificados como lactilados. Como os peptídeos detectados diferem de uma réplica para outra, é possível estabelecer um limiar de pelo menos 2 replicados biológicos.
    7. Para confirmar a posição de um resíduo modificado, utilize uma ferramenta web de alinhamento como BLAST do NIH15 ou Align do UniProt16 com a sequência peptídica na coluna ''Probabilidades de Lactilação (K)'' (apagar qualquer probabilidade) e a sequência proteica do banco de dadosUniProt 17.
      NOTA: Como múltiplos sítios de lactilação podem ser identificados em uma única sequência proteica, é possível alinhar esses sítios simultaneamente. Isso também ajudará a identificar sítios duplicados que podem estar em peptídeos diferentes, mas no mesmo local na sequência proteica.
    8. A análise de dados dependerá da questão de pesquisa, mas é necessário considerar etapas de normalização, centralização, escalonamento e transformação logarítmica antes de realizar qualquer análise estatísticade dados 18.
    9. Para confirmar as proteínas lactiladas identificadas pela análise de EM, prossiga com o protocolo de imunoprecipitação.

4. Imunoprecipitação (IP)

  1. Extração de proteínas
    NOTA: Trabalhe no gelo.
    1. Prepare o tampão de lise/lavagem IP (Tabela 3) e armazene-o a 4 °C antes do uso. Adicione os inibidores de protease logo antes do uso.
      NOTA: Para a preparação da amostra, pode ser usado um pellet celular que tenha sido conservado a -80 °C. Se estiver trabalhando com células novas, siga os passos 4.1.2 e 4.1.3. Caso contrário, ressuspenda o pellet celular no mesmo volume de lise/buffer de lavagem IP conforme indicado no passo 4.1.2 e continue com o passo 4.1.4.
    2. Adicione 1 mL de lise/tampão de lavagem IP e incube as células a 4 °C por 10 minutos.
    3. Colhe células usando um raspador de células e transfira a lise para um microtubo de 1,5 mL.
    4. Incube com uma rotação suave de ponta a ponta por 30 minutos a 4 °C.
    5. Centrifuge a 16.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
    6. Transfira o supernadante transparente para um novo microtubo de 1,5 mL.
    7. Quantifique a proteína com um kit de BCA conforme o protocolo do fabricante.
  2. Pré-limpeza das esferas e incubação de anticorposK-L-LA
    NOTA: Trabalhe no gelo. Para cada condição experimental, prepare um tubo IP de controle (IgG da mesma espécie do anticorpo KL-LA ) e um tubo para KL-LA IP.
    1. Transfira 1 mg de proteínas para um novo microtubo de 1,5 mL. Complete todas as amostras até o mesmo volume final usando lise/tampão de lavagem IP.
      NOTA: Este protocolo pode ser realizado usando esferas magnéticas ou de agarose. Para os passos seguintes, contas magnéticas foram usadas.
    2. Transfira o volume necessário de esferas para um novo microtubo de 1,5 mL.
    3. Para pré-lavar as contas, magnetize-as por 30 s ou até a solução ficar clara. Descarte o sobrenadante transparente. Lave as esferas 3 vezes com 500 μL de lise/buffer de lavagem IP. Descarte o sobrenadante transparente após cada lavagem. Adicione o mesmo volume de buffer IP que o volume inicial de esferas retirado.
    4. Incube as amostras de proteína com 10-15 μL das contas pré-lavadas com uma rotação suave de ponta a ponta por 20 minutos a 4 °C.
      NOTA: Para 1 mg de proteína, use 10-15 μL de esferas magnéticas. Esta etapa minimiza a ligação inespecífica de proteínas às esferas durante o protocolo de imunoprecipitação.
    5. Magnetize as esferas por 30 s ou até a solução estar clara. Transfira o sobrenadante transparente para um novo microtubo de 1,5 mL.
    6. Adicione 1,5 μL de anticorpoanti-K L-LAem um tubo e a quantidade correspondente de IgG em outro.
      NOTA: Para 1 mg de proteína no início deste protocolo, use 1,5 μg de anticorpos.
    7. Incube as amostras com uma rotação suave de ponta a ponta durante a noite a 4 °C.
  3. Imunoprecipitação KL-LA
    NOTA: Trabalhe no gelo.
    1. Prepare o tampão de lise/lavagem IP (Tabela 3) e armazene-o a 4 °C antes do uso. Adicione os inibidores de protease logo antes do uso.
    2. Pré-lave as esferas conforme descrito no passo 4.2.3.
      NOTA: Para 1 mg de proteína no início deste protocolo, use 40 μL de esferas magnéticas.
    3. Incube as amostras com 40 μL de esferas magnéticas pré-lavadas com rotação suave de ponta a ponta por 4 horas a 4 °C.
    4. Magnetize as esferas por 30 s ou até a solução ficar clara. Colete o primeiro supernadante transparente. Lave as esferas 3 vezes com 500 μL de lise/tampão de lavagem IP. Remova o sobrenadante transparente após cada lavagem.
      NOTA: O primeiro sobrenadante pode ser quantificado e utilizado no western blot (WB). É útil avaliar a eficácia da imunoprecipitação.
    5. Resuspenda as esferas com 20 μL de 2x Laemmli e 5% de tampão β-mercaptoetanol.
    6. Incube a 95 °C por 5 minutos antes de carregar em um gel SDS-PAGE. Alternativamente, amostras desnaturadas podem ser armazenadas a -20 °C por várias semanas.
  4. Detecção de WB
    1. Coloque os tubos IP no suporte magnético por 30 s antes de coletar a amostra e carregá-la em um gel SDS-PAGE.
    2. Realize o WB usando um anticorpo contra a proteína de interesse e/ou o anticorpoanti-K L-La para confirmar a redução de proteínas lactiladas em 5% de Albumina Sérica Bovina (BSA). Os anticorpos secundários foram diluídos em 1:5000 em 5% de BSA.
    3. Detecte as bandas usando detecção de quimiluminescência baseada em HRP.

Resultados

Como exemplo, a linhagem celular TE11 do carcinoma escamoso esofágico foi cultivada até atingir 80% de confluência. Seguindo o fluxo de trabalho ilustrado na Figura 1 e na análise MaxQuant, conforme descrito neste protocolo, o lactiloma foi determinado. Nessas células, 137 peptídeos foram identificados como potencialmente lactilados, representando 82 proteínas únicas, já que múltiplos sítios foram identificados na mesma proteína (Figura 2A). Note que isso não leva em conta peptídeos únicos. Espera-se um número entre 100 e 500 peptídeos identificados nesses experimentos em linhas celulares de carcinoma escamoso esofágico.

Proteínas lactiladas identificadas estão relacionadas a vários processos biológicos, como remodelação da cromatina ou montagem da cromatina, que já haviam sido descritas na literatura como enriquecidas em proteínas lactiladas (Figura 2B). Algumas das primeiras proteínas lactiladas identificadas foram histonas, que também podem ser encontradas nesses dados, como a histona H1.2 (Tabela 4). A lactilação pôde ser identificada em vários resíduos diferentes de lisina a partir da mesma proteína. Por exemplo, dois locais de lactilação foram identificados na histona H1.2: lisinas (K) 168 (provavelmente) e 191. No primeiro peptídeo (Tabela 4, linha 2), observou-se que o resíduo K168 tem maior probabilidade de ser o lactilado com 0,733 em 1, enquanto K169 tem probabilidade de apenas 0,267. HNRNPA1 é um bom exemplo de peptídeo que precisará ser alinhado para determinar o resíduo modificado correto.

Para validar a lactilação de HNRNPA1 com base nos resultados do lactiloma (Tabela 4), foi realizado um ensaio IP direcionado a essa modificação pós-traducional. Primeiro, para determinar qual tipo de esfera apresenta interação ótima com o anticorpo anti-KL-LA, foram comparadas esferas G e A/G. Após a realização de IP com um anticorpo KL-LA e seguida por um WB contra KL-LA, observou-se um enriquecimento visível das proteínas KL-LA , em comparação com a entrada, como esperado, com ambos os tipos de esferas (Figura 3). Esses resultados demonstram a eficiência e a robustez do protocolo no enriquecimento de proteínas lactiladas. Não foi observada diferença significativa entre os dois tipos de esferas testadas. Para validar os alvos identificados pela EM, IPs específicos podem então ser confirmados. Por exemplo, a lactilação de HNRNPA1, que foi identificada pela EM (Tabela 4), foi calibrada. Uma faixa específica correspondente a HNRNPA1 foi detectada após KL-LA IP e HNRNPA1 WB, indicando que HNRNPA1 é modificada pela lactilação (Figura 4). Embora tanto as esferas G quanto A/G tenham imunoprecipitado com sucesso a proteína alvo, um sinal mais intenso de HNRNPA1 é observado com as esferas A/G, sugerindo afinidade ou recuperação aumentada.

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Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho para a análise do lactilômemo. Abreviações: IP = Imunoprecipitação; KL-LA = L-lactilisina; LC-MS/MS = cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Resultados representativos para algumas proteínas obtidas para o lactiloma das células TE11. (A) Número total de proteínas e peptídeos identificados. Múltiplos sítios de lactilação podem ser identificados na mesma proteína. (B) Os 5 principais processos biológicos enriquecidos para proteínas lactiladas em células TE11 obtidos usando o banco de dados STRING. O valor p foi corrigido para múltiplos testes usando Benjamini-Hochberg. O número em cada barra representa o número de proteínas na rede identificadas como lactiladas a partir do total de proteínas nesta Ontologia Gênica (GO). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imunoprecipitação de KL-LA usando esferas G ou A/G e detecção de WB dePan-K L-LA em células TE11. A detecção de Pan-KL-LA serve como um controle crucial para confirmar a eficácia e especificidade da imunoprecipitação deste PTM. Este experimento garante que o IP enriquece com sucesso proteínas que possuem a modificação KL-LA . (*) indica as cadeias pesadas e leves do anticorpo, como claramente observado em IP: IgG lanes (controle IP) (N = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Imunoprecipitação de KL-LA usando esferas G ou A/G e detecção de HNRNPA1 por WB. A detecção de HNRNPA1 por WB em imunoprecipitações específicas de KL-LA usando esferas G ou A/G confirma sua lactilação em células TE11 (N = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

SoluçãoConcentração final
Ureia8 M
Bicarbonato de amônio1 M
HEPES20 mM

Tabela 1: Buffer de lise do lactiloma. Preparando em água de grau EM e ajustando o pH para 8.

Solução - Buffer de lavagem com lactilomaConcentração final
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HCl20 mM
Adicionar para buffer IP de LactilomaConcentração final
NP-400.5%

Tabela 2: Buffer de lavagem de lactiloma e buffer IP. Preparando em água de grau MS e ajustando o pH para 8 em ambas as soluções.

SoluçãoConcentração final
Cloreto de sódio100 mM
Fluoreto de sódio50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)50 mM
β-glicerofosfato40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
Glicerol5%
Triton X-1001%
Adicione novo:
Coquetel Inibidor de Protease 100X1X
PMSF1 mM
Orthovanadate0,2 mM

Tabela 3: Lise/tampão de lavagem IP. Deve estar livre de desnaturalizantes, pois eles podem desestabilizar a presença das PTMs nas proteínas.

Posições dentro das proteínasProteínaNomes de proteínasNomes genéticosNúmero de lactilação (K)Probabilidades de lactilação (K)Intensidade
168P16403Histone H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403Histone H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Proteína semelhante à alfa-2-macroglobulina 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Homologo da proteína Chromobox 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Homologo da proteína Chromobox 3CBX31TTLQK(0,828)MGK(0,172)2,49E+05
112; 141O76095-2JTB de proteínaJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Ribonucleoproteína nuclear heterogênea A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Tabela 4: Resultados representativos para peptídeos lactilados obtidos para a linha celular TE11 do carcinoma escamoso esofágico. Esta tabela é obtida após a análise MaxQuant.

Discussão

Este protocolo descreve como a imunoprecipitação de proteínas modificadas por KL-LA pode ser usada na EM para descobrir novas proteínas lactiladas e seus locais de lactilação. Esse protocolo de lactiloma é realizado usando esferas conjugadas, mas pode ser alcançado usando anticorpo KL-LA ou até mesmo anticorpo KD-LA , segundo a questão de pesquisa. Se for usado um anticorpo em vez de esferas conjugadas, escolher um anticorpo policlonal facilita a formação de complexos mais apertados, pois pode se ligar a múltiplos epítopos; no entanto, essa abordagem pode introduzir variabilidade. Uma vantagem do uso de esferas conjugadas é que elas evitam o anticorpo de lixiviação – liberação do suporte sólido – o que poderia contaminar as amostras de EM. Também é mais eficiente em tempo do que usar um anticorpo não conjugado.

Além disso, é importante notar que a quantidade de peptídeos identificados nesse tipo de análise pode ser influenciada por múltiplosfatores: 1. Primeiro, a especificidade de anticorpos desempenha um papel crucial para garantir que a proteína correta seja capturada. Adicionar uma etapa de pré-limpeza com esferas de agarose pode ser uma forma de remover interações inespecíficas. Por outro lado, não se sabe se a lactilação pode afetar a digestão da tripsina, pois ela cliva peptídeos no lado c-terminal do resíduo de arginina, mas, mais importante, o resíduo de lisina. Se for esse o caso, pode potencialmente levar a uma redução da cobertura peptídica. Portanto, é possível considerar outras opções para proteases. Neste protocolo, o parâmetro ''Max. clivagens perdidas' é aumentado para levar em conta essa limitação. Por fim, a preparação e o manuseio das amostras, como o uso de luvas para evitar contaminação das amostras com queratinas da pele, por exemplo, ou a estabilidade da modificação, já que a renovação do PTM é um processo dinâmico e às vezes rápido6, também devem ser consideradas.

Ao contrário da abordagem mais ampla da EM, que levou à baixa detecção de PTM de baixa abundância, como a lactilação, a identificação de peptídeosL-LA enriquecidos com K por meio da proteômica baseada em EM permite uma análise detalhada do sítio PTM, como a identificação de novos sítios de lactilação e proteínas lactiladas19. Western blot pode fornecer informações sobre o padrão geral de lactilação presente nas células, mas não pode informar sobre a lactilação específica de proteínas. Assim, o IP é a abordagem comumente usada para confirmar a PTM20 detectada por EM. O ensaio de ligação por proximidade (PLA) é outra técnica que pode ser usada para confirmar a lactilação de potenciais alvos identificados pelaproteômica 21. Essa técnica também pode indicar a localização das proteínas modificadas, mas possui menor especificidade. Usar uma abordagem IP específica para lactilação é apropriado para uma triagem PTM ampla, mas pode ser interessante realizar IP específica para proteínas dependendo da questão de pesquisa em questão.

Ao quantificar a proporção de uma proteína lactilada específica em um extrato total de proteína, realizar uma IP sozinha não é suficiente. Embora a IP usando esferas deL-LA K permita a captura de proteínas lactiladas, ela não quantifica com precisão a proporção de lactilação, pois está limitada a enriquecer proteínas alvo. Portanto, é necessária espectrometria de massas, fornecendo uma análise mais detalhada que permite uma medição quantitativa precisa da lactilação. Assim, realizar IP de uma proteína potencialmente lactilada usando um anticorpo contra essa proteína, seguida de análise de espectrometria de massas, pode determinar a porcentagem de proteínas lactiladas em uma amostra total de proteína, enquanto realizar IP é uma abordagem eficiente para confirmar a lactilação das proteínas identificadas como lactiladas pela EM.

Em um IP que utiliza anticorpos não conjugados, otimizar a proporção esfera-anticorpo é essencial para garantir a captura ótima das proteínas lactiladas. De fato, o equilíbrio entre esses dois componentes impacta diretamente a especificidade e eficiência do IP. Um excesso de anticorpos pode levar à ligação inespecífica, o que aumenta o ruído de fundo e reduz a precisão geral da detecção. Em contraste, o contrário pode levar a um enriquecimento ineficiente da proteína-alvo, resultando em sinais mais fracos e sensibilidade reduzida. Essas considerações técnicas são críticas para obter resultados confiáveis e precisos no estudo de proteínas lactiladas.

Para concluir, esse protocolo pode ser usado para monitorar mudanças nos perfis de lactilação após a desregulação da homeostase, como câncer 8,10, que podem impactar a resposta relacionada ao medicamento. A identificação de biomarcadores pode até ser alcançada usando esse método. Aplicável a múltiplas linhagens celulares, tipos de tecido e até biópsias de pacientes, essa técnica tem potencial para aprofundar o entendimento da sinalização celular impulsionada por PTM em doenças ou condições normais.

Divulgações

Não há conflito de interesses a ser divulgado.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente a todos os membros do Giroux Lab pelas discussões científicas. Agradecemos à plataforma de Proteômica e espectrometria de massa da Faculdade de Medicina e Ciências da Saúde - Université de Sherbrooke pelos serviços e orientação. O VG conta com o apoio do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (RJPIN-2019-06185) e dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (178171). O VG possui a Cátedra de Pesquisa do Canadá Nível 2 em Biologia de Células-Tronco Gastrointestinais. O MH é bolseiro do Centre de Recherche en Inflammation et Oncologie Digestive da Université de Sherbrooke, Université de Sherbrooke-Fondation De Sève, CRCHUS, do programa TRaIning A New Generation of Researchers in Gastroenterology and LivEr (TRIANGLE) e do FRQ. FMB é bolsista de mérito FRQS (366044). VG e FMB são membros do "Centre de Recherche du CHUS", financiado pela FRQS.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ponta Zip de 100 uL C18 Pierce87784
Aclamação PepMap100 C18Dionex Corporation1649460,3mm de identificação x 5mm
Acetonitrilo (grau MS)FisherA955-4
Bicarbonato de amônioSigma-AldrichA6141-500
Anticorpo monoclonal anti-HNRNPA1Novus Biologicals NB100-672
Anticorpo monoclonal anti-L-Lactillysine (KL-La)PTM-BioPTM1401RM
Anti-IgG de camundongo, anticorpo ligado ao HRPCST7076S
Anti-IgG do coelho, anticorpo ligado ao HRPCST7074S
Azure 280BiossistemasAZI280-01
Uniforme BCAThermo Fisher ScientificP123227
Albumina Sérica de Bovin (BSA)Wisent800-095-EG
Fonte nanoESI do Spray CativoBruker Daltonics
CloroacetamidaSigma-AldrichC0267
Substrato ECL Ocidental Clarity MaxBio-Rad1705062
Ditiotreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Esferas de proteína G Dynabeads para imunoprecipitaçãoThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
Ácido fórmico (FA; Grau de mestrado)Thermo Fisher ScientificA117-50
GlicerolFisher ScientificBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
Coluna Hypersep C18 100mgFisher60108-302
Contas conjugadas de agarose KL-LAPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromofenol)Wisent, J.T. Baker800-100-CG, D293-01
Microtubo de baixa ligação 0,5 mLSarstedt72.704.600
Microtubo de baixa ligação 1,5 mLThermo Fisher ScientificP190410
Microtubo 1,7 mLAxygenMCT-175-C
Sistema HPLC NanoEluteBruker DaltonicsTamanho de partícula de 1,9um, 75um de identificação x 25cm
Anticorpo policlonal IgG Normal de CoelhoMillipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
Cocktail inibidor de protease (PIC)Sigma-AldrichP8340-5
Partículas magnéticas da proteína A/G da Sera-Mag SpeedBeadsThermo Fisher Scientific09-981-920
Cloreto de sódioSigma-AldrichS9888-500
Fluoreto de sódioSigma-AldrichS1504
Ortovanadato de sódioSigma-AldrichS6508
TimsTOF pro espectrômetro de massa  Bruker Daltonics
Ácido trifluoroacético (TFA)Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Tripsina (grau MS)Pierce90058
UreiaThermo Fisher ScientificU15-500
Vaccufuge plusEppendorf22820168
Água (grau MS)VWR10803-890A
β-glicerofosfatoSigma-AldrichG5422
β-mercaptoetanolSigma-AldrichM3148

Referências

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