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Artigo de método

Estabelecimento de um sistema de criação de tripes de pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) para triagem de virulência de fungos entomopatogênicos

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DOI:

10.3791/68600

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18 de julho de 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

Neste artigo

Resumo

Um protocolo de bioensaio de folhas destacadas foi estabelecido para tripes de pimenta de criação massal usando um método de folhas destacadas modificado em recipientes de vidro contendo ágar, garantindo alta sobrevivência e desenvolvimento sincronizado. Este sistema permite a triagem eficiente da virulência de fungos entomopatogênicos contra larvas de 2ºínstar e fornece um suprimento confiável de tripes para avaliações de laboratório, estufa e campo.

Resumo

O tripes da pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood) é uma praga economicamente significativa de culturas ornamentais e alimentares em Taiwan. Os fungos entomopatogênicos (EPF) estão funcionando como um agente de controle biológico ecologicamente correto para o manejo de tripes. É crucial rastrear a virulência dos isolados de EPF contra tripes da pimenta em condições de laboratório antes da aplicação em campo. No entanto, dados limitados sobre o método de criação de tripes de pimenta representam desafios para a triagem laboratorial em larga escala. Para resolver esse problema, desenvolvemos um método modificado de criação em laboratório para a produção em massa de S. dorsalis.

O método utiliza um sistema de criação de folhas destacadas usando um recipiente de vidro contendo ágar que é adequado para avaliar o EPF contra tripes de pimenta. Este sistema otimizado de bioensaio de folhas destacadas é adequado para avaliar a eficácia do EPF contra tripes da pimenta. O sistema tem a capacidade de produzir um grande número de tripes no mesmo estágio de desenvolvimento para triagem de virulência. De acordo com o teste, o resultado mostrou que o isolado de Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) apresentou a maior virulência (53,6%) contra larvas de2º ínstar de tripes de pimenta aos 7 dias pós-inoculação (d.p.i.). Além disso, os discos foliares embebidos em ágar permaneceram frescos por mais de 7 dias, permitindo que os tripes sobrevivessem (90% de taxa de sobrevivência do tratamento controle) durante todo o período de observação, indicando a estabilidade do sistema de criação. Este protocolo demonstra um sistema de criação estável para produção em massa e para avaliação da virulência de isolados de EPF contra tripes de pimenta e que pode ter utilidade para outros tripes, permitindo a triagem de potenciais isolados de EPF para controle de tripes no campo.

Introdução

Os tripes da pimenta (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) é uma praga polífaga que infesta mais de 100 espécies de plantas em 40 famílias diferentes de plantas, incluindo hortaliças e culturas ornamentais e frutíferas1. É nativa da Ásia tropical e subtropical-Sudeste Asiático, Índia, Japão e Taiwan2. Até onde sabemos, a pimenta é a praga de culturas agrícolas e ornamentais, incluindo manga, chá, mirtilo e lótus em Taiwan. Durante as últimas duas décadas, a pimenta se tornou uma praga econômica significativa em vários países devido ao aumento da globalização e ao comércio agrícola aberto. Além disso, o alto potencial reprodutivo e a adaptabilidade a áreas recém-invadidas contribuíram para a disseminação dessa praga 1,3.

A pimenta se alimenta principalmente de folhagens jovens, brotos, pétalas de flores e frutos imaturos, levando à necrose e morte dos tecidos3. Além disso, eles servem como vetor para várias doenças de plantas, incluindo o vírus da necrose dos botões do amendoim (GBNV), o vírus da mancha clorótica do amendoim (GCFSV), o vírus da mancha amarela do amendoim (GYSV)4 e o vírus da estria do tabaco (TSV)5. Como resultado, a alimentação com tripes da pimenta pode reduzir significativamente o rendimento e o valor das culturas afetadas. O manejo bem-sucedido de tripes da pimenta depende de um plano integrado de manejo de pragas que utiliza estratégias de controle cultural, biológicas e químicas1. Em Taiwan, os agricultores orgânicos geralmente utilizam materiais não químicos, como óleo de alcance estreito e óleo de nim, ou métodos de controle biológico, incluindo o uso de ácaros predadores e minúsculos insetos piratas (por observação pessoal). No entanto, com base no feedback dos agricultores, a aplicação desses óleos durante a época de floração e frutificação pode interferir na polinização e danificar o pólen, levando a uma redução no rendimento e no valor econômico. Portanto, o desenvolvimento de medidas alternativas eficazes de controle para tripes de pimenta é crucial para os agricultores orgânicos.

Os fungos entomopatogênicos (EPF) são um grupo de fungos matadores de insetos que demonstraram ser uma técnica de manejo de pragas eficaz e sustentável 6,7,8. Vários estudos demonstraram a eficácia do EPF contra tripes da pimenta. Os EPFs comerciais, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) e Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), exibiram controle significativo de tripes de pimenta em roseiras 9,10. As populações de tripes de pimenta em plantas de pimenta também podem ser reduzidas por Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. Outros PFEs, como Lecanicillium lecanii e Purpureocillium lilacinum, foram testados contra tripes em diferentes culturas, incluindo pimenta e chá, e foram eficazes no controle dessa praga12,13.

Alguns estudos anteriores que investigaram a eficácia dos EPFs para o controle de tripes em estufas ou no campo foram conduzidos sem a triagem prévia das espécies/cepas de EPF mais eficazes, limitando sua eficácia. A triagem cuidadosa de EPFs pode melhorar muito o manejo de pragas. Muitos estudos criaram tripes para bioensaios em plantas intactas dentro de gaiolas11,14. Embora um sistema de criação de plantas intacto ofereça um ambiente mais natural para os tripes, eles representam desafios no gerenciamento de diferentes estágios de desenvolvimento, pois os tripes exibem comportamentos distintos em cada estágio. Essa variabilidade pode complicar a seleção de estágios direcionados para fins experimentais específicos. Além disso, as condições do solo dentro do sistema de criação de plantas intactas podem influenciar a pupação e a eclosão de tripes de pimenta, reduzindo assim o número de indivíduos disponíveis para bioensaios subsequentes15, limitando os recursos para bioensaios adicionais. Além disso, os sistemas de criação de plantas inteiras requerem mais espaço e cuidados contínuos para as plantas, pois as plantas estressadas podem alterar o comportamento dos tripes e podem consumir mais tempo e recursos. Existem poucos relatos de sistemas de criação de tripes baseados em material vegetal não vivo (por exemplo, tecido vegetal destacado ou dietas artificiais) para experimentos de bioensaio de laboratório, mas os detalhes desses métodos muitas vezes não eram claros ou omitidos12,16.

Este estudo teve como objetivo desenvolver um sistema de criação massal simples, econômico e sustentável de tripes de pimenta em condições de laboratório. Neste protocolo, um método de criação de discos foliares7 foi modificado para oferecer uma abordagem mais eficiente e controlada para tripes de criação em massa, permitindo a seleção precisa de estágios de desenvolvimento para bioensaios por meio de um controle rígido sobre as condições ambientais. Além disso, um sistema de bioensaio estável e reprodutível foi desenvolvido para avaliar a virulência de isolados de fungos entomopatogênicos (EPF) por 50% de tempo letal (LT50) e 50% de concentração letal mediana (CL50), que se referem ao tempo estimado sob uma dosagem específica, e a concentração de suspensão fúngica necessária para causar 50% de mortalidade de tripes de pimenta, respectivamente. Através da aplicação deste método, os tripes coletados em campo podem ser identificados corretamente e as colônias laboratoriais estáveis de tripes podem ser mantidas para testar a eficácia de diferentes isolados de fungos usando uma metodologia mais fácil e reprodutível.

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Protocolo

NOTA: O fluxograma experimental completo é mostrado na Figura 1.

1. Coleta de campo de tripes de pimenta e manutenção de colônias

  1. Coleção de tripes de pimenta
    1. Examine visualmente ambos os lados das folhas e dentro das flores quanto à infestação de tripes de pimenta em plantas de mirtilo em uma fazenda de mirtilo afetada.
    2. Registre os detalhes de cada amostra (por exemplo, parte da planta e gravidade da infestação) e confirme as práticas de produção com os agricultores, como agricultura convencional ou orgânica, incluindo aplicação de óleo mineral e inimigos naturais.
    3. Corte as folhas e flores infestadas de tripes de pimenta e transfira-as para o saco plástico com zíper (Tabela de Materiais) e, em seguida, feche o saco com zíper com um pouco de ar dentro para manter os tripes vivos. Levar a amostra para o laboratório no prazo de 3 h.
      NOTA: Coloque a amostra em um refrigerador quando o tempo de coleta de campo for superior a 3 h.
    4. Prepare um recipiente de criação de vidro (35 mm de altura, 45 mm de diâmetro interno), coloque três camadas de toalha de papel circular (diâmetro 40 mm) no fundo do recipiente de criação de vidro e, em seguida, adicione 8-10 gotas (400-500 μL) de água filtrada (Figura 1 e Tabela de Materiais).
    5. Colete uma folha de manga vermelha jovem dos campos de manga (Figura 1). Lave a folha e verifique em um microscópio óptico (Tabela de Materiais) se há ovos de insetos ou outra contaminação de insetos antes de preparar o recipiente de criação de vidro. Corte a folha de manga com um cortador de couro (Tabela de Materiais) em um disco circular (40 mm) e coloque-o sobre a toalha de papel molhada.
      NOTA: As folhas de manga são recursos mais estáveis para alimentar tripes do que as folhas jovens de mirtilo, que crescem apenas sazonalmente.
    6. Observe os tripes da pimenta em um microscópio óptico com ampliação de 10x e transfira 10 tripes adultos (cinco machos e cinco fêmeas) usando um pincel de pintura fina (Tabela de Materiais) para o recipiente de criação de vidro.
    7. Sele cada recipiente de criação de vidro com duas camadas de parafilme (Tabela de Materiais) e faça cerca de 40 pequenos orifícios usando um pino de inseto # 00 para ventilação (Tabela de Materiais).
    8. Mantenha o recipiente de criação de vidro em uma incubadora a 25 ± 1 °C, ~ 70% de umidade relativa com um fotoperíodo de luz: escuro (L: D) = 12 h: 12 h (Tabela de Materiais).
    9. Remova os adultos usando um pincel após 48 h.
      NOTA: Com base em nossa observação, as tripes fêmeas põem ovos ~ 2 dias após serem transferidas para o recipiente de criação de vidro.
    10. Observe os tecidos foliares com ovos em um estereomicroscópio para confirmar ainda mais a oviposição (Figura 1 e Tabela de Materiais). Coloque um disco de folha de manga fresca na folha com ovos e adicione 8 a 10 gotas de água filtrada na toalha de papel para manter a umidade.
  2. Manutenção da população de tripes da pimenta
    NOTA: Os ovos eclodem em larvas de 1ºínstar após ~ 5-7 dias.
    1. Transfira diretamente a folha contendo larvas de1º ínstar para um novo recipiente de criação de vidro.
      NOTA: Usando um pincel, transfira suavemente as larvas de 1ºínstar para um novo recipiente de criação de vidro, evitando a contaminação do crescimento podre e inesperado de fungos nas folhas de manga. Com base em nossa observação, uma fêmea adulta põe em média 6 ovos por dia.
    2. Observe os tripes da pimenta diariamente. Adicione 8 a 10 gotas de água filtrada a cada 4 dias na toalha de papel. Adicione um disco de folha de manga fresca dentro do recipiente a cada 4 dias, antes que a folha velha seque.
      NOTA: As larvas de1º ínstar emergem em adultos em ~ 7-10 dias, dependendo dos fatores ambientais, como temperatura e umidade.
    3. Observe a população de tripes de pimenta diariamente até que os tripes se desenvolvam em adultos e repita as etapas da etapa 1.1.4 para manutenção da população a longo prazo.
  3. Criação em massa de tripes da malagueta
    1. Colete fêmeas adultas da população mantida e prepare um recipiente de criação de vidro com base nas etapas acima.
    2. Transfira 10 fêmeas adultas para o recipiente e siga as etapas das etapas 1.1.4 a 1.1.10 para obter uma folha com ovos.
      NOTA: Uma fêmea adulta põe em média 6 ovos por dia.
    3. Transfira suavemente ~ 120 larvas de1º instar para um novo recipiente de criação de vidro usando um pincel.
    4. Observe os tripes da pimenta diariamente. Adicione 8 a 10 gotas de água filtrada na toalha de papel a cada 4 dias. Adicione um disco de folha de manga fresca no recipiente a cada 4 dias antes que a folha velha seque.
    5. Colete as larvas de1º ínstar 5-7 dias após a postura dos ovos; coletar larvas de2º ínstar após 7-10 dias; coletar adultos após ~ 14 dias para o bioensaio (Figura 2).
      NOTA: Observe a morfologia para distinguir diferentes estágios de tripes de pimenta para experimentos posteriores (Figura 2).

2. Identificação molecular de tripes de pimenta

NOTA: Os tripes coletados no campo devem ser identificados no nível da espécie por identificação molecular usando um fragmento do gene mitocondrial da citocromo oxidase I (COI), um marcador comumente usado para tripes da pimenta17,18.

  1. Extração de DNA genômico de tripes de pimenta
    1. Colete um tripes de pimenta adulto em um tubo de centrífuga de 1,5 mL (Tabela de Materiais).
    2. Homogeneizar os tripes da pimenta usando um pilão de pellets e, em seguida, isolar o DNA genômico usando o kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais).
  2. Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA
    1. Amplifique o fragmento de DNA de tripes de pimenta esperado usando PCR Master Mix (2x) com um par de primers COI, primer direto LCO 1490 e primer reverso HCO 2198, que amplifica o gene COI mitocondrial parcial (Tabela de Materiais).
      1. Prepare uma mistura de PCR de 20 μL contendo 2 μL de molde de DNA genômico de tripe, 1 μL de primers diretos e reversos, 10 μL de 2x PCR Master Mix e 6 μL de ddH2O (Tabela de Materiais).
      2. Realize a PCR com um termociclador com as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 94 °C por 2 min, 35 ciclos de 94 °C por 30 s, 52 °C por 1 min, 72 °C por 1 min, seguida por uma extensão final de 72 °C por 10 min (Tabela de Materiais).
    2. Verificar o amplicon da PCR por eletroforese em gel de agarose a 1% para verificar o resultado da amplificação (Figura 3).
    3. Extirpar a banda alvo (o tamanho esperado do amplicon era de 658 pb) e purificar o amplicon COI PCR dos tripes da pimenta usando um kit de purificação Gel/PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Envie o produto purificado para sequenciamento por meio de um serviço de sequenciamento comercial. (Tabela de Materiais).
  3. Análise de sequência
    1. Avalie a qualidade da sequência usando o software referenciado (Tabela de Materiais).
    2. Abrir o arquivo FASTA ou TXT e aparar manualmente as bases de baixa qualidade nas extremidades 5 ′ e 3 ′, excluindo as sequências indesejadas.
    3. Realize uma pesquisa BLAST no banco de dados NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) usando parâmetros padrão para confirmar a identidade da espécie.

3. Preparação de fungos entomopatogênicos

NOTA: Os isolados de EPF usados neste estudo estão listados na Tabela 1.

  1. Recuperação de isolados de fungos da biblioteca de recursos fúngicos
    1. Descongele o estoque de conídios fúngicos preservados (conídios suspensos em glicerina a 30%) de um freezer a -80 ° C.
    2. Transfira aproximadamente 10 μL da suspensão de conídios e espalhe uniformemente em uma placa de ágar Sabouraud dextrose (SDA) de 5,5 cm usando um espalhador de células em uma capela de fluxo laminar. O meio é preparado misturando 0,75 g de caldo Sabouraud dextrose e 1,5 g de ágar em 100 mL de água bidestilada (ddH2O) (Tabela de Materiais).
    3. Sele a placa de Petri com parafilme (Tabela de Materiais) e transfira a placa para a incubadora escura a 25 ° C por 10-14 dias.
    4. Subcultive o micélio fúngico em crescimento ativo listrando em uma placa fresca de ágar 1/4 Sabouraud dextrose (SDA). Incubar fungos na escuridão a 25 °C por 10-14 dias para permitir o desenvolvimento de conídios antes da colheita.
      NOTA: Use culturas fúngicas com aproximadamente 10 dias de idade para bioensaios subsequentes. Culturas com mais de 14 dias não são recomendadas para testes de virulência devido a possíveis reduções na viabilidade dos conídios.
  2. Preparação da suspensão de conídios
    1. Adicione 2-3 mL de 0,03% Tween 80 à superfície de uma cultura fúngica de 10-14 dias em 1/4 SDA. Raspe suavemente os conídios usando um laço estéril (Tabela de Materiais).
    2. Transfira a suspensão fúngica para um tubo de centrífuga limpo de 15 mL.
    3. Homogeneizar a suspensão por vórtice na velocidade máxima e filtrá-la com papel de filtro para remover os detritos hifais e obter uma suspensão de conídios puros.
    4. Use um hemocitômetro (Tabela de Materiais) para verificar o número de conídios sob um microscópio óptico e dilua a suspensão para 108 conídios / mL.
    5. Transfira a suspensão de conídios para um micropulverizador esterilizado com luz UV para posterior aplicação do bioensaio.
      NOTA: Certifique-se de que a suspensão de conídios esteja completamente inclinada antes de cada transferência para evitar assentamento. Antes de usar, esterilize o micropulverizador expondo-o à radiação ultravioleta por 30 minutos dentro de uma capela de fluxo laminar.

4. Triagem de virulência contra tripes de pimenta

  1. Preparação de larvas de2º ínstar
    1. Colete as larvas de2º ínstar seguindo as etapas 1.3.1-1.3.5 para o experimento a seguir.
      NOTA: Distinguir as larvas de2º ínstar pela cor amarela do corpo e abdômen largo em comparação com as larvas de primeiro ínstar (Figura 2).
  2. Preparação do recipiente de inoculação
    NOTA: Selecione as espécies de folhas com base na cultura-alvo de tripes de pimenta. Neste estudo, tripes de pimenta foram coletados do campo de folhas infestadas de mirtilo 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp). Portanto, o bioensaio de EPF contra tripes de pimenta será realizado em folhas de mirtilo.
    1. Colete folhas jovens de mirtilo de uma fazenda de mirtilo e lave as folhas de mirtilo para remover a poeira da superfície e quaisquer outros artrópodes, se presentes.
    2. Seque as folhas ao ar livre ou use toalhas de papel para limpar a água; Em seguida, verifique a superfície das folhas de mirtilo em busca de outros artrópodes ou ovos sob um estereomicroscópio. Remova todos os artrópodes, se presentes.
    3. Corte um disco de folha de 2,8 cm de diâmetro usando um cortador de couro (Tabela de Materiais), desinfete a folha usando água sanitária a 1% (solução de hipoclorito de sódio) e enxágue 2x com água esterilizada para remover qualquer resíduo de água sanitária nas folhas.
      NOTA: Prepare o disco foliar antes da solidificação do ágar para garantir que o disco foliar possa ser incorporado ao ágar água corretamente.
    4. Autoclave uma solução de ágar água a 2,5% (2,5 g de ágar por 100 mL de ddH2O) para esterilização.
    5. Despeje 3 mL de ágar água a 2,5% em pequenos recipientes de vidro (35 mm de altura, 30 mm de diâmetro interno) dentro de uma capela de fluxo laminar antes que o ágar solidifique. Deixar o ágar-ágar arrefecer até cerca de 40 °C até atingir o estado semi-sólido.
    6. Coloque suavemente o disco foliar (lado adaxial para cima) no ágar, incorporando-o levemente com exposição mínima acima da superfície do ágar. Assim que o ágar água solidificar totalmente, os recipientes de vidro estarão prontos para o bioensaio.
  3. Inoculação e observação de EPF
    1. Antes da aplicação, bata bem a suspensão de conídios. Usando um micropulverizador, aplique uniformemente 0,1 mL da suspensão (preparada na etapa 3.2.4) na superfície de cada disco foliar a uma distância de aproximadamente 10 cm dentro do recipiente de vidro.
      NOTA: Teste as áreas de pulverização antes do experimento. Certifique-se de que a pulverização cubra uniformemente todo o disco foliar com uma camada fina. Se as gotículas se acumularem em água parada na folha, reduza o volume de inoculação para evitar o excesso de umidade.
    2. Seque ao ar a suspensão de conídios na folha por 30 min em condições estéreis (por exemplo, em uma capela de fluxo laminar).
    3. Transfira 10 larvas de2º ínstar para cada recipiente usando um pincel fino e feche cada recipiente de criação de vidro com duas camadas de parafilme.
    4. Faça ~ 30 pequenos furos usando um pino de inseto # 00 (Tabela de Materiais) para ventilação.
    5. Inocular o recipiente a 25 ± °C incubadora com ~70% de humidade relativa e um fotoperíodo de L:D = 12 h: 12 h.
    6. Observe e registre a mortalidade de tripes da pimenta sob um estereomicroscópio com aumento de 10x diariamente por 7 dias.
    7. Mantenha as larvas mortas dentro do recipiente de vidro para observação de micose para confirmar a infecção por EPF.

5. Bioensaio de isolados de EPF selecionados

NOTA: O isolado de EPF mais virulento ou vários isolados com alta virulência podem ser selecionados para um bioensaio dose-dependente contra tripes de pimenta. Três concentrações diferentes de conídios, variando de 106 a 108 conídios/mL, foram utilizadas para avaliar a relação entre dose e patogenicidade.

  1. Preparação da suspensão de conídios
    1. Recupere o isolado EPF selecionado seguindo a etapa 3.1.
    2. Preparar três concentrações de suspensões de conídios (106, 107 e 108 conídios/ml) conforme descrito no passo 3.2.
  2. Preparação de larvas de2º ínstar
    1. Colete as larvas de segundo ínstar seguindo a etapa 4.1 para obter adultos recém-emergidos.
  3. Preparação do recipiente de inoculação
    1. Siga o passo 4.2. preparar o recipiente de inoculação contendo discos de folhas de mirtilo embebidas em ágar água.
  4. Inoculação e observação de EPF
    1. Realizar a inoculação do EPF com três concentrações de suspensão de conídios, conforme descrito no passo 4.3.

6. Análise estatística

  1. Cálculo da mortalidade
    1. Transforme os dados de mortalidade de cada cepa fúngica por transformação de Arcsin antes de realizar a análise de variância (ANOVA) unidirecional para avaliar as diferenças entre os tratamentos fúngicos (nível de significância definido como p < 0,05).
    2. Realizar comparações post hoc das médias de tratamento usando o teste de Diferença Significativa Honesta (HSD) de Tukey.
  2. Cálculo do tempo letal médio (LT50) e da concentração letal média (CL50)
    1. Calcule os valores medianos de tempo letal (LT50) e concentração letal mediana (LC50) usando a análise de regressão Probit.
    2. Crie e preencha variáveis chamadas "total", "resposta" e "duração" (para LT50) ou "concentração" (para LC50) com os dados observados na interface do software.
      NOTA: Se a mortalidade cumulativa não exceder 50% durante o período de observação, os valores de LT50 e/ou LC50 não podem ser estimados de forma confiável.
    3. Realize a análise de probits navegando até Analisar | Regressão | Probit. Defina o "total" como o número total de insetos testados, "resposta" como o número de insetos mortos e "duração" ou "concentração" como a covariável. Defina o nível de significância para o fator de heterogeneidade como 0,05 pressionando Opções e definindo o Nível de significância para uso do fator de heterogeneidade como 0,05.

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Resultados

O fluxograma experimental apresentado neste estudo demonstrou que o sistema de criação estável dos tripes da pimenta pode ser estabelecido, desde a coleta em campo até a triagem da virulência dos isolados de EPF (Figura 1). Embora a observação morfológica possa distinguir tripes de pimenta de outros tripes de flores, o uso da sequência COI parcial como marcador molecular, incluindo tamanho do amplicon de PCR e sequenciamento de COI, pode confirmar ainda mais ...

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Discussão

A pimenta malagueta é uma praga globalmente significativa que afeta várias culturas economicamente importantes, como milho, amendoim, pimenta, soja, morango, batata-doce e tomate 1,11,19. As estratégias de controle atuais dependem de abordagens integradas envolvendo práticas culturais, agentes de controle biológico e tratamentos químicos, incluindo o uso de inimigos naturais, nematóides e EPFs

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses envolvido neste trabalho.

Agradecimentos

Agradecemos especialmente ao Sr. Lin, Huanf-Jen da fazenda de mirtilo Humi (Wufeng Dist., Cidade de Taichung), que forneceu as plantas de mirtilo. Esta pesquisa foi apoiada por 113-2313-B-005 -024 -MY3 do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (NSTC).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
#00 alfinete de insetoEntosphinx DMM0220Feito no Reino Unido
Tubo de centrífuga de 1,5 mLCorning incorporadaMCT-175-CFeito nos EUA
10 μ L Alça de inoculaçãoNEST Científico718201Feito nos EUA
Escada de DNA III de 100 pbGeneaidDL007Feito em Taiwan.
2x SuperRed PCR Master MixFerramentas biológicasTE-SR01Feito em Taiwan
Placa de Petri de 6 cmAlpha Plus Científico16021Feito em Taiwan
ÁgarBioman CientíficoAGR001.1Grau de microbiologia
agaroseBioman CientíficoRolamento PB1200Feito em Taiwan
Tampão de gel de DNA seguro BioGreenBioman CientíficoSDB001TFeito em Taiwan
Kit de tecido de extração de alta velocidade Easy DNAFisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Fabricado na Austrália)
Primário dianteiro: LCO 1490Genômica PO-PR220919G6Sequência: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
recipiente de criação de vidro Empresa de equipamentos de laboratório SunshineTamanho: 35 mm de altura, 45 mm de diâmetro interno. Pode ser repalce por qualquer tamanho simular de plástico ou copo de vidro.
hemocitômetroPaulo Marienfeld640030Fabricado na Alemanha
incubadoraPonto altoF740Feito em Taiwan
cortador de couroOficina artesanal realhttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
Termociclador MiniAmpThermo Fisher CientíficoRolamento A37834Feito nos EUA
microscópio óptico Nikon  Ci-LFeito no Japão
pincel de pinturaTian Cheng empresa de escovas4716608400352Pode ser substituído por pincel de aquarela de ponta fina, equivalente a um pincel redondo tamanho 0 ou 1.
toalha de papelPode FlorBLS007-8Feito em Taiwan
Parafilme MBemisPM-996Feito nos EUA
pilão de pelletsBioman CientíficoGT100RFeito em Taiwan
Primer reverso: HCO 2198Genômica PO-PR220919G6Sequência: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Caldo Sabouraud DextroseHiMediaMH033-500GFeito na Índia
estereomicroscópioSoptopSZN71Feito em Taiwan
Tampão TAE 50XBioman CientíficoTAE501000Feito em Taiwan
Pré-adolescente 80PanReac AppliChem142050.1661Feito em Taiwan
saco com zíperempresa plástica de wenchen1809000061Tamanho: 12 cm de largura e 17 centímetros de comprimento. (Fabricado em Taiwan)

Referências

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
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