Este protocolo descreve um sistema de fixação de transdutor de ultrassom projetado especificamente para estimulação de ultrassom da medula espinhal em camundongos acordados. O método emprega um sistema de fixação para garantir o posicionamento preciso do transdutor de ultrassom e, ao mesmo tempo, permitir que os sujeitos experimentais se movam livremente sem comprometer a precisão da estimulação.
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Artigo de método
Fixação de Transdutores de Ultrassom para Neuromodulação da Medula Espinhal em Camundongos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ultrassom focalizado (FUS) surgiu como uma tecnologia inovadora de neuromodulação não invasiva que demonstra um potencial significativo para a regulação neural da medula espinhal. No entanto, alcançar a fixação estável do transdutor ao longo da coluna vertebral apresenta desafios técnicos notáveis. Os métodos de imobilização existentes geralmente requerem anestesia animal prolongada ou demonstram confiabilidade de adesão inadequada. Essas restrições críticas ressaltam a necessidade urgente de desenvolver um novo paradigma de fixação que garanta estabilidade operacional e compatibilidade fisiológica. Este protocolo introduz um sistema inovador de fixação de transdutor de ultrassom para estimulação da medula espinhal em camundongos acordados e em movimento livre. Estabelecer um método confiável para a colocação precisa do transdutor de ultrassom na coluna vertebral é fundamental para experimentos de neuroestimulação. Este método integra três fases: exposição cirúrgica do corpo vertebral T13, retificação de precisão do processo espinhoso para criar uma interface de contato planar e colagem adesiva segura da base metálica e do colimador à coluna vertebral usando material de base de prótese e mistura adesiva. Permite comportamentos motores naturais por meio de movimentos irrestritos e garante posicionamento estável com variação espacial mínima entre as sessões, facilitando a investigação de intervenções medulares mediadas por ultrassom em modelos animais conscientes. É particularmente relevante para estudos que requerem avaliações comportamentais no reparo de lesões medulares, modulação da barreira hematomedular e mecanismos de dor crônica. Ao abordar um desafio técnico crítico na pesquisa de neuromodulação de animais acordados, este protocolo oferece uma interface transdutor espinhal estável sem restrição de movimento, abrindo caminho para resultados experimentais mais precisos e confiáveis.
Introdução
A medula espinhal é um centro crucial para a integração de informações entre os sistemas nervoso central e periférico, tornando-a valiosa para pesquisas clínicas em áreas como transdução de sinal de dor, reconstrução de redes neurais motoras e regulação da neuroplasticidade. O ultrassom focalizado (FUS), uma tecnologia emergente de neuromodulação não invasiva, tornou-se um importante meio de regulação neural da medula espinhal. Com suas características físicas de penetração de tecido profundo, resolução espacial em nível milimétrico e parâmetros de saída de energia controláveis, sua aplicação se estende desde a pesquisa básica de neuromecanismos até estudos de tradução pré-clínica de vários modelos patológicos da medula espinhal.
A pesquisa mostra que o FUS pode regular os circuitos neurais da medula espinhal de duas maneiras: inibindo-os ou ativando-os por meio de efeitos térmicos e mecânicos. Caracteriza-se também por sua reversibilidade temporal e segurança para os tecidos 1,2,3. No estudo de modelos de lesão medular, a FUS melhorou a capacidade motora de ratos, modulando as respostas inflamatórias e promovendo o reparo neural 4,5,6. Além disso, o FUS demonstrou abrir a barreira sangue-medula espinhal e aumentar a eficiência local da administração de medicamentos por meio de um efeito de cavitação mediado por microbolhas 7,8. No campo da dor neuropática, Liao et al. confirmaram que o FUS alivia efetivamente as manifestações da dor neuropática em ratos, regulando a expressão de KCC2 e inibindo a via CaMKIV KCC29. Song et al. demonstraram que o tsFUS de baixa intensidade aplicado na medula espinhal lombar reduziu significativamente a alodinia mecânica e suprimiu a ativação microglial em um modelo de lesão crônica por constrição de rato10. Alcançar uma modulação precisa da medula espinhal com FUS depende da estabilidade espacial do sistema de fornecimento de energia por ultrassom. As estratégias de fixação atuais são divididas principalmente em duas categorias: 1) Método de fixação rígida: Alcança um posicionamento preciso usando um quadro estereotáxico, mas requer anestesia contínua, o que suprime a atividade neural dos sujeitos experimentais e afeta a validade das avaliações comportamentais 1,2,3,4,10 ; 2) Método de fixação flexível: Permite a pesquisa de sujeitos conscientes por meio de um dispositivo de cinto elástico, mas devido à grande mobilidade da coluna vertebral, há erros de deslocamento e descolamento do transdutor 6,8,9. Além disso, a heterogeneidade geométrica da lâmina da coluna vertebral leva a uma atenuação significativa da energia do ultrassom, reduzindo a eficiência da modulação neural 7,8.
Este estudo propõe de forma inovadora um esquema de fixação de transdutor de ultrassom focalizado implantável para pesquisa de modulação neural da medula espinhal em camundongos conscientes e em movimento livre. Este protocolo usa uma abordagem cirúrgica minimamente invasiva para integrar a base de metal, o colimador e a coluna vertebral, suporta o uso repetido do transdutor de ultrassom, garante a consistência do alvo do ultrassom e mantém a atenuação da energia do ultrassom através da lâmina dentro de uma faixa aceitável. A metodologia desenvolvida aborda as limitações críticas das abordagens existentes, permitindo assim experimentos de neuromodulação da medula espinhal mais confiáveis e reprodutíveis em animais acordados e comportados. Os principais parâmetros incluem uma incisão na linha média de 2,5 cm em T13, fixação da base de metal de aço inoxidável e uma proporção de volume de 3:1 do material da base da prótese para o adesivo de cianoacrilato. As limitações incluem invasividade cirúrgica moderada e precisão dependente do operador na preparação da superfície óssea.
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais descritos no presente estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional de Experimentação Animal dos Institutos de Tecnologia Avançada de Shenzhen (número do certificado: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Todos os experimentos usaram camundongos C57BL/6J machos (8 semanas de idade). Os camundongos pesavam 18-22 g no momento da cirurgia.
1. Indução e manutenção da anestesia (5 ± 1 min)
- Pré-carregue o circuito de anestesia por 5 min.
- Defina a câmara de indução para fornecer 4% de isoflurano no ar medicinal a uma taxa de fluxo de 2 L/min.
- Mude para ventilação com máscara facial após a perda do reflexo de endireitamento.
- Ajuste o vaporizador para manter uma concentração de 1,5-2% de isoflurano.
- Mantenha a temperatura corporal do camundongo usando um cobertor de aquecimento definido para 37 ° C, com uma faixa-alvo de 36-38 ° C durante a anestesia.
- Aplique pomada oftálmica de Terramicina.
2. Posicionamento (1 ± 1 min)
- Use um adaptador estereotáxico ajustável para o mouse.
- Posicione o mouse de bruços com alinhamento da coluna vertebral para manter a curvatura fisiológica da coluna vertebral.
- Prenda a cabeça do mouse usando barras auriculares.
- Posicione os membros simetricamente.
3. Preparo do campo cirúrgico (1 ± 1 min)
- Use um aparador elétrico (folga da lâmina de 0,1 mm) para remover os pelos do local da cirurgia.
- Certifique-se de que a área de depilação seja de aproximadamente 3 cm × 1 cm.
- Execute três passagens de corte na direção oposta ao crescimento do cabelo.
4. Incisão e abordagem (2 ± 1 min)
- Limpe a área com iodóforo 3 vezes (intervalos de 30 s).
- Palpe a última costela (presa à vértebra T13 em camundongos) e use-a como
o ponto de referência principal. Faça uma incisão de 2,5 cm no nível vertebral T13 ao longo
a linha média dorsal usando um bisturi. - Dissecar sequencialmente a fáscia subcutânea.
- Exponha os músculos paraespinhais através dos planos anatômicos.
5. Dissecção do músculo paraespinhal (5 ± 1 min)
- Defina a ampliação do microscópio cirúrgico para 5x para visualização ideal dos músculos paraespinhais e estruturas vertebrais.
- Realize uma dissecção aguda dos músculos paraespinhais usando uma microtesoura.
- Ressecção completamente os músculos paraespinhais dorsal e lateral, preservando as camadas musculares ventrais.
- Gerencie o sangramento com gaze hemostática absorvível.
6. Instalação da base metálica (1 ± 1 min)
- Monte a haste de fixação (plástico) no adaptador estereotáxico.
- Monte a base metálica personalizada (aço inoxidável, 0.28 g) na extremidade distal da haste (Figura 1A).
- Posicione a base de metal personalizada bilateralmente nos processos transversos da coluna vertebral T13.
- Verifique a estabilidade do acoplamento.
7. Preparação da interface óssea (2 ± 1 min)
- Remova o tecido muscular residual da lâmina e dos processos espinhosos sob o microscópio cirúrgico.
- Obtenha hemostasia completa com compressão de algodão estéril.
- Crie uma superfície de contato plana usando uma broca óssea de precisão com irrigação salina contínua. Opere a furadeira a uma velocidade de 5.000 a 10.000 rpm para minimizar a geração de calor. Use um protetor ocular e uma máscara durante a perfuração.
- Remova a poeira óssea com cotonetes umedecidos com solução salina.
8. Vedação do sistema de fixação (3 ± 1 min)
- Misture os materiais de base da prótese e o adesivo de cianoacrilato (cola 502) em uma proporção de volume de 3:1. Use luvas de nitrilo e óculos de segurança para evitar o contato com a pele / olhos.
- Fixe o colimador ultrassônico (plástico, 0.6 g, Figura 1B) e a base de metal à coluna vertebral usando a mistura adesiva (Figura 1C).
- Deixe a mistura adesiva curar em condições ambientais controladas (24 ± 1 °C, 40-60% de umidade relativa). Mantenha o posicionamento estático por 60 s até a confirmação visual da solidificação completa (perda de brilho superficial e formação de uma interface rígida).
- Separe a base metálica da haste de fixação de plástico.
- Verificação da estabilidade da fixação: Aplique uma força rotacional suave à base metálica no plano horizontal. Observe a interface colimador-vértebra com ampliação de 5x para qualquer deslocamento (tolerância de <0,1 mm). Se o movimento exceder a tolerância, reaplique a mistura adesiva (etapa 8.2) e repita a cura (etapa 8.3).
9. Fechamento da ferida (1 ± 1 min)
- Alinhe as bordas da ferida para encapsular totalmente a base de metal.
- Realize a sutura interrompida com suturas de seda 4-0.
- Limpe a incisão com iodóforo.
- Limpe os detritos residuais de sangue/osso dentro do local de exposição laminar do colimador e embale com algodão estéril para selagem e hemostasia.
10. Manejo pós-operatório
- Termorregulação: Mantenha o mouse em um cobertor de aquecimento (37 ° C) até a recuperação total da deambulação (normalmente 2-3 h após a anestesia).
- Profilaxia antibiótica pós-operatória: Administrar cefazolina sódica (50 mg/kg, dissolvida em solução salina a 0,9% até a concentração de 50 mg/mL) por injeção subcutânea na região dorsal do pescoço imediatamente após a cirurgia.
- Mantenha a higiene da ferida. Limpe a ferida usando um cotonete umedecido com solução salina uma vez ao dia durante os primeiros 3 dias e faça uma inspeção diária do local da cirurgia em busca de sinais de infecção, deiscência ou inflamação.
- Analgesia pós-operatória: Administrar carprofeno (5 mg/kg, por via subcutânea) a cada 12 h por 3 dias apósa cirurgia 11.
NOTA: A Figura 1D mostra o sistema de fixação implantado em um camundongo vivo pós-recuperação.
11. Eliminação de resíduos perigosos
- Colete pó ósseo e materiais contaminados com sangue em sacos de risco biológico à prova de vazamentos rotulados com símbolos de "risco biológico" para transferência para uma instalação licenciada de descarte de resíduos médicos.
- Coloque o material de base da prótese não curada e os resíduos de cola 502 em recipientes selados resistentes a produtos químicos rotulados como "Resíduos Químicos" e armazene-os em um gabinete ventilado designado para descarte por meio de protocolos de gerenciamento de resíduos químicos.
- Descarte agulhas, lâminas de bisturi e brocas ósseas em recipientes resistentes a perfurações marcados com rótulos de "risco biológico".
12. Avisos de segurança
- Ao manusear materiais à base de próteses, evite o contato direto com a pele usando luvas de nitrilo e óculos de segurança e realize a mistura e a cura em uma capela de exaustão bem ventilada para minimizar a inalação de monômeros voláteis.
- Descarte o material residual como resíduo químico de acordo com as diretrizes institucionais. Para adesivos 502 de cianoacrilato, evite o contato com a pele ou os olhos e enxágue imediatamente com água por 15 minutos se ocorrer exposição, procurando ajuda médica. Use-os em áreas ventiladas, armazene-os em locais frescos e secos, longe de fontes de ignição, e evite o contato com tecidos de algodão ou lã.
- Ao usar brocas de precisão, prenda a peça de mão, use um protetor facial e máscara cirúrgica e irrigue o local da perfuração com solução salina para evitar lesões térmicas.
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Resultados
Ensaio em campo aberto
O teste de campo aberto foi projetado para avaliar possíveis mudanças comportamentais em camundongos após a cirurgia (Figura 2A). Uma câmara de campo aberto padrão de 40 cm × 40 cm foi empregada para garantir espaço de atividade suficiente para os camundongos, mantendo condições ambientais relativamente consistentes e minimizando a interferência externa. O experimento consistiu em duas fases: pré-cirurgia e 7 dias pós-operatório. Em cada fase, foi f...
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Discussão
Este estudo apresenta um novo protocolo de acoplamento vertebral que facilita a neuromodulação ultrassônica precisa da medula espinhal em camundongos acordados e com comportamento livre. Ao contrário das abordagens convencionais de fixação, esta metodologia supera as limitações das abordagens convencionais de fixação. Ao contrário dos quadros estereotáxicos rígidos que necessitam de anestesia contínua (que suprime a atividade neural e complica as avaliações comportamentais
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Projeto de Startup de Pesquisa Científica de Talentos de Alto Nível do Hospital da Universidade de Hong Kong-Shenzhen sob Grant HKUSZH202207003. Agradecemos sinceramente a todos os membros do laboratório por sua assistência na otimização de protocolos e cuidados com os animais, e ao Instituto de Tecnologia Avançada de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências (SIAT), por seu apoio institucional.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmara de indução de anestesia | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Adesivo de cianoacrilato (cola 502) | Obras Químicas de Pequim | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=verdadeiro& id=736 869038961& ltk2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e& ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Materiais de base da prótese dentária | Novo Século Odontológico | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Haste de fixação | Costume | ||
| Isoflurano | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Base metálica | Costume | ||
| Microinstrumento | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | ||
| Broca de precisão | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sistema de anestesia multicanal para pequenos animais | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Adaptador estereotáxico para camundongos e ratos juvenis | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =verdadeiro& id=651346369142& ltk2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 & ns=1& priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Microscópio cirúrgico | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Sutura cirúrgica (Prolene) | A Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =verdadeiro& id=774292384846& ltk2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Pomada Oftálmica Terramicina | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Colimador ultrassônico | Costume |
Referências
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Reimpressões e permissões
