Artigo de método

Técnicas multiômicas para traçar o perfil de transições de estado de cromatina em colangiócitos primários de camundongo de baixa entrada

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 de julho de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito apresenta um protocolo abrangente para ChIP-seq de baixa entrada para traçar o perfil de modificações de histonas e ATAC-seq para avaliar a acessibilidade da cromatina em pequenas quantidades de colangiócitos primários de camundongos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença hepática policística (DPP) é uma doença hereditária caracterizada pela formação de cistos cheios de líquido derivados de colangiócitos, levando à doença progressiva e a uma redução significativa na qualidade de vida dos pacientes. Os tratamentos atuais para PLD são inadequados, enfatizando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. O papel da regulação epigenética na progressão do PLD, particularmente a acessibilidade da cromatina e as modificações das histonas, permanece pouco explorado. As técnicas tradicionais de perfil epigenético, como ChIP-seq e DNase-seq, requerem um grande número de células, que são difíceis de obter a partir de colangiócitos primários. Para resolver isso, otimizamos os protocolos ChIP-seq e ATAC-seq de baixa entrada para baixo número de colangiócitos primários. Essas abordagens permitem a análise de modificações de histonas e acessibilidade da cromatina com entrada mínima de células. O ChIP-seq de baixa entrada utiliza nuclease microcócica (MNase) para fragmentação do DNA, enquanto o ATAC-seq emprega a transposase Tn5 para capturar regiões abertas da cromatina. Essas técnicas multiômicas fornecem informações valiosas sobre a dinâmica do estado da cromatina durante as transições de destino dos colangiócitos na PLD e em outras doenças biliares. É importante ressaltar que os protocolos otimizados são aplicáveis com segurança a outras células primárias de baixa entrada, permitindo a exploração de mecanismos epigenéticos em vários contextos celulares. Este trabalho apresenta uma abordagem sistemática para o estudo das alterações do estado da cromatina, contribuindo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas de base epigenética para PLD e doenças relacionadas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A PLD é uma doença hereditária caracterizada pelo desenvolvimento de múltiplos cistos cheios de líquido derivados de colangiócitos. À medida que esses cistos se expandem progressivamente, eles afetam gravemente a qualidade de vida dos pacientes 1,2. As estratégias de tratamento existentes para PLD são inadequadas, fornecendo apenas benefícios limitados, enquanto frequentemente levam a altas taxas de recorrência e complicações 3,4. Portanto, há uma necessidade premente de abordagens terapêuticas mais seguras e eficazes para enfrentar os desafios clínicos não resolvidos no tratamento com PLD.

Em condições normais, os colangiócitos permanecem quiescentes, enquanto no PLD, eles exibem proliferação excessiva, um dos principais impulsionadores da progressão da doença 5,6. Os mecanismos moleculares subjacentes a essa transição cística permanecem obscuros. Embora a regulação epigenética, incluindo acessibilidade da cromatina e modificações de histonas, desempenhe um papel vital nas transições do destino celular 7,8, seu papel na progressão do PLD permanece pouco estudado. No entanto, muitas técnicas de perfil epigenético requerem um grande número de células. O ChIP-seq tradicional, que depende da fragmentação da cromatina por sonicação, bem como os ensaios de acessibilidade da cromatina, como DNase-seq e MNase-seq, normalmente requerem mais de 106 células - excedendo em muito o número obtido de colangiócitos primários.

Este manuscrito fornece um protocolo abrangente para ChIP-seq 9,10,11 de baixa entrada para traçar o perfil de modificações de histonas e ATAC-seq 11,12,13 para avaliar a acessibilidade da cromatina em baixo número de colangiócitos primários. O ChIP-seq de baixa entrada emprega MNase para fragmentar o DNA9, enquanto o ATAC-seq captura fragmentos de DNA de regiões abertas da cromatina usando Tn5 transposase12. A análise multiômica utilizando essas abordagens oferece informações valiosas sobre a dinâmica do estado da cromatina durante as transições de destino de colangiócitos em PLD e outras doenças biliares, facilitando assim o desenvolvimento de terapias direcionadas à epigenética.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de soluções e colangiócitos para ATAC-seq

  1. Pelo menos 1 dia antes do experimento ATAC-seq, prepare o tampão de lise ATAC usando os reagentes listados na Tabela 1.
    NOTA: O tampão de lise ATAC pode ser armazenado a 4 °C no escuro por pelo menos 1 mês.
  2. Para colangiócitos primários recém-isolados14, contar as células usando um hemocitômetro imediatamente após o isolamento e prosseguir com o experimento ATAC-seq.
    NOTA: Quanto mais cedo melhor para minimizar o impacto na viabilidade celular. No entanto, se mantido no gelo, prosseguir dentro de 2 h geralmente não é um problema.

2. ATAC-seq

NOTA: Use 100.000 colangiócitos para ATAC-seq. Manter as amostras e soluções no gelo. Para o experimento ATAC-seq, todo o procedimento leva aproximadamente 2 dias.

  1. Centrifugar a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  2. Descarte o sobrenadante, adicione 200 μL de tampão de lise ATAC contendo inibidor de protease, pipete suavemente para misturar e incube no gelo por 20 min. Nos primeiros 10 minutos, pipete suavemente para misturar.
  3. Centrifugar a 1.500 × g durante 10 min a 4 °C.
  4. Prepare o tampão de reação de transposição (50 μL) misturando 3 μL de mistura enzimática do kit de preparação da biblioteca de DNA da ATAC, 10 μL de tampão 5x do kit de preparação da biblioteca de DNA da ATAC e 37 μL de água livre de nuclease. Homogeneizar.
  5. Descarte cuidadosamente o sobrenadante, coloque o pellet nuclear coletado no gelo e adicione imediatamente 50 μL de tampão de reação de transposição. Ressuspenda suavemente e incube a 37 °C por 60 min, sacudindo o fundo do tubo a cada 10 min para misturar.
    NOTA: Prepare o tampão de reação de transposição antes de descartar o sobrenadante para evitar que as células sequem.
  6. Purifique o DNA usando o Kit de Purificação PCR de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: As esferas residuais de proteína G do processo de isolamento de colangiócitos14 podem ser removidas nesta etapa. As amostras de DNA podem ser armazenadas a -80 °C para preservação a longo prazo.
  7. Execute a construção da biblioteca usando o Kit de Preparação para Biblioteca de DNA ATAC de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: Mantenha todas as amostras e soluções no gelo, a menos que especificado de outra forma. Embora os procedimentos possam diferir entre outras marcas de kits, todos são compatíveis com nosso protocolo.
    1. Enriquecimento de PCR: Prepare a mistura de enriquecimento de PCR (50 μL) em um tubo de PCR misturando os seguintes componentes na ordem especificada: 10 μL de amostra de DNA (da etapa 2.6), 14 μL de água livre de nuclease, 10 μL de 5x TAB, 5 μL de PPM, 1 μL de TAE, 5 μL de primer P5 e 5 μL de primer P7. Pipete suavemente para misturar.
    2. Transfira o tubo para um instrumento de PCR e execute o seguinte programa: (72 °C por 3 min) x 1 ciclo, (98 °C por 30 s) x 1 ciclo, (98 °C por 15 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 3 min) x 15 ciclos e (72 °C por 5 min) x 1 ciclo, e mantenha a 4 °C.
    3. Purificação: Leve as esferas DNA Clean à temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar e, em seguida, execute uma purificação de esferas magnéticas em duas etapas.
      1. Primeira rodada: Adicione 30 μL de grânulos de DNA Clean aos produtos de PCR (da etapa 2.7.2), pipete suavemente para misturar e incube em temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo de PCR em um separador magnético e espere até que a solução fique clara (~5 min). Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo e descarte as esferas de DNA Clean.
      2. Segunda rodada: Adicione 7,5 μL de grânulos de DNA Clean ao sobrenadante coletado (da etapa 2.7.3.1), pipete suavemente para misturar e incube em temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo em um separador magnético e espere até que a solução fique límpida (~5 min). Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    4. Mantenha o tubo no separador magnético e enxágue as esferas DNA Clean por 2 x 30 s com 200 μL de etanol a 80% recém-preparado à temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o sobrenadante após cada enxágue. Com o tubo ainda no separador magnético, abra a tampa do tubo e seque as esferas ao ar por 10 min. Finalmente, adicione 22 μL de água livre de nuclease para eluir o DNA.
      NOTA: As amostras de DNA podem ser armazenadas a -80 °C para preservação a longo prazo.
  8. Sequencie as bibliotecas usando um sequenciador padrão de próxima geração.
    NOTA: Recomendamos obter pelo menos 50 milhões de leituras de extremidade de par.

3. Preparação de soluções e colangiócitos para ChIP-seq de baixa entrada

  1. Pelo menos 1 dia antes do experimento ChIP-seq de baixa entrada, prepare o Tampão de Lise ChIP, Tampão ChIP MNase, Buffer ChIP Stop, ChIP 2x RIPA Buffer, ChIP RIPA Buffer e ChIP LiCl Buffer usando os reagentes listados na Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5.
    NOTA: As soluções acima podem ser armazenadas a 4 °C por pelo menos 1 mês.
  2. Para colangiócitos primários recém-isolados14, conte as células usando um hemocitômetro imediatamente após o isolamento e prossiga com o experimento ChIP-seq de baixa entrada.
    NOTA: Quanto mais cedo melhor para minimizar o impacto na viabilidade celular. No entanto, se mantido no gelo, prosseguir dentro de 2 h geralmente não é um problema.

4. Dia 1 de ChIP-seq de baixa entrada: lise celular, digestão de MNase e incubação de anticorpos

NOTA: Para o experimento ChIP-seq de baixa entrada, todo o procedimento leva aproximadamente 3 dias.

  1. Divida os colangiócitos em alíquotas de 100.000 células por tubo e mantenha as amostras e soluções em gelo.
    NOTA: Se estiver realizando um experimento ChIP-seq de baixa entrada para várias modificações de histonas, é aceitável aumentar o volume proporcionalmente antes de adicionar o anticorpo de modificação de histonas. Os volumes de reagente nas etapas a seguir são baseados em um tubo contendo 1 × 105 células.
  2. Centrifugue a 2.000 × g por 5 min a 4 °C.
  3. Descarte o sobrenadante, adicione 19 μL de tampão de lise ChIP contendo inibidor de protease, pipete suavemente para misturar e incube no gelo por 10 min. Evite gerar bolhas.
  4. Adicione 19 μL de Tampão ChIP MNase e pipete suavemente para misturar.
  5. Adicione 2 μL de MNase (0,01 U/μL) e pipete suavemente para misturar. Incubar a 37 °C durante 5 min.
    NOTA: O tempo de incubação é crítico. A concentração final de MNase é de 0,0005 U/μL. A concentração ideal de MNase pode ser determinada com base no tipo e número de células.
  6. Coloque imediatamente a amostra no gelo, adicione 5 μL de ChIP STOP Buffer para terminar a digestão e pipete suavemente para misturar.
  7. Adicione 45 μL de Tampão ChIP 2x RIPA contendo Inibidor de Protease, pipete suavemente para misturar e incube no gelo por 10 min.
  8. Centrifugue a 20.000 × g por 15 min a 4 °C. Transfira lentamente o sobrenadante para um novo tubo.
    NOTA: As esferas residuais de proteína G do processo de isolamento de colangiócitos14 podem ser removidas nesta etapa.
  9. Adicione 40 μL de Tampão ChIP RIPA.
  10. Para amostras de imunoprecipitação (IP), adicionar 1 μg de anticorpo por amostra e incubar a suspensão num rotador (20 rpm) a 4 °C durante a noite.
  11. Para amostras de entrada, não adicione nenhum anticorpo e incube a suspensão em um rotador (20 rpm) a 4 °C durante a noite.

5. Dia 2 de ChIP-seq de baixa entrada: imunoprecipitação, lavagem e eluição

NOTA: Para exemplos de IP, siga as etapas 5.1 a 5.7. Para exemplos de entrada, siga as etapas 5.8 a 5.12.

  1. Pré-lave as esferas de proteína G com 1 mL de tampão ChIP RIPA gelado.
  2. Adicionar 400 μg de grânulos de proteína G às amostras e incubar com rotação (20 rpm) a 4 °C durante 2 h.
  3. Lave os grânulos por 5 x 5 min com 150 μL de Tampão ChIP RIPA gelado por 5 min a 4 ° C em um rotador (20 rpm). Remova o sobrenadante usando um separador magnético.
  4. Lave os grânulos com 150 μL de Tampão ChIP LiCl gelado por 5 min a 4 °C em um rotador (20 rpm). Remova o sobrenadante usando um separador magnético.
  5. Adicione 30 μL de tampão de eluição ChIP (29 μL de água livre de nuclease e 1 μL de proteinase K) para ressuspender os grânulos e agite a 900 rpm a 55 ° C por 90 min. Agite suavemente o tubo periodicamente para manter as contas em suspensão.
  6. Recolher o sobrenadante utilizando um separador magnético e transferi-lo lentamente para um novo tubo. Incubar a 72 °C durante 40 min para inativar a Proteinase K.
  7. Meça a concentração de DNA usando um fluorômetro.
    NOTA: As amostras de DNA podem ser armazenadas a -80 °C para preservação a longo prazo.
  8. Para amostras de entrada, adicione 1 μL de proteinase K e agite a 900 rpm a 55 °C por 90 min.
  9. Purifique o DNA usando extração de fenol-clorofórmio. Adicione 130 μL de reagente de extração de DNA e vortex vigorosamente até que a solução fique rosa. Centrifugue a 20.000 × g por 5 min.
  10. Transfira o sobrenadante para um novo tubo, adicione 130 μL de isopropanol gelado e, em seguida, adicione 1 μL de glicogênio e 6,5 μL de NaAc 3M. Centrifugue a 20.000 × g por 15 min.
  11. Descarte o sobrenadante, lave uma vez com 1 mL de etanol a 70% e centrifugue a 20.000 × g por 15 min. Seque o pellet e ressuspenda-o em 30 μL de água livre de nuclease.
  12. Meça a concentração de DNA usando um fluorômetro.
    NOTA: As amostras de DNA podem ser armazenadas a -80 °C para preservação a longo prazo.

6. Dia 3 de ChIP-seq de baixa entrada: construção e sequenciamento de bibliotecas

  1. Execute a construção da biblioteca usando um Kit de Preparação para Biblioteca de DNA ChIP de acordo com as instruções do fabricante.
    NOTA: As etapas incluem Preparação do Final, Ligação do Adaptador e Amplificação da Biblioteca. Pipetar 5 ng de amostras ChIP (amostras de entrada e IP) para construção de bibliotecas. Manter todas as amostras e soluções no gelo, salvo indicação em contrário. Embora os procedimentos possam diferir entre outras marcas de kits, todos são compatíveis com nosso protocolo.
  2. Preparação final: Prepare o tampão de reação de preparação final (65 μL) em um tubo de PCR misturando 5 ng de amostra de DNA (da etapa 5.6 ou etapa 5.11), 15 μL de End Prep Mix 4, 6,5 μL de Tris EDTA e água livre de nuclease até um volume final de 65 μL. Pipete suavemente para misturar. Transfira o tubo para um instrumento de PCR e execute o seguinte programa: 20 °C por 15 min, 65 °C por 15 min e mantenha a 4 °C (tampa quente: 105 °C).
  3. Ligação do adaptador: Dilua o adaptador de DNA S na proporção de 1:100. Prepare o tampão de reação de ligação do adaptador (100 μL) em um tubo de PCR misturando 65 μL de produtos de preparação final (da etapa 6.2), 25 μL de tampão de ligação rápida 2, 5 μL de DNA ligase rápida e 5 μL de adaptador de DNA diluído S. Pipete suavemente para misturar. Transfira o tubo para um instrumento de PCR e execute o seguinte programa: 20 °C por 15 min, seguido por uma retenção a 4 °C (tampa quente: 105 °C).
  4. Purificação:
    1. Leve as esferas DNA Clean à temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Adicione 60 μL de grânulos DNA Clean aos produtos de ligação do adaptador (a partir da etapa 6.3). Pipete suavemente para misturar e incubar em temperatura ambiente por 5 min.
    2. Coloque o tubo de PCR em um separador magnético e espere até que a solução fique clara (~5 min). Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
    3. Mantenha o tubo no separador magnético. Enxágue as esferas DNA Clean por 2 x 30 s com 200 μL de etanol a 80% recém-preparado em temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o sobrenadante após cada enxágue.
    4. Com o tubo ainda no separador magnético, abra a tampa do tubo e seque as esferas ao ar por 5 min. Finalmente, adicione 22,5 μL de Tris-HCL 10 mM (PH 8,0) para eluir o DNA.
  5. Amplificação da biblioteca: Prepare o tampão de reação de amplificação da biblioteca (50 μL) em um tubo de PCR misturando 20 μL de produtos de purificação (da etapa 6.4), 2,5 μL de primer de PCR i5, 2,5 μL de primer de PCR i7 e 25 μL de mistura de amplificação. Pipete suavemente para misturar. Transfira o tubo para um instrumento de PCR e execute o seguinte programa: (95 °C por 3 min) x 1 ciclo, (98 °C por 20 s, 60 °C por 15 s, 72 °C por 30 s) x 18 ciclos, (72 °C por 5 min) x 1 ciclo e mantenha a 4 °C.
  6. Purificação: Leve as esferas DNA Clean à temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar e, em seguida, execute uma purificação de esferas magnéticas em duas etapas.
    1. Primeira rodada: Adicione 30 μL de grânulos DNA Clean aos produtos de amplificação da biblioteca (a partir da etapa 6.5). Pipete suavemente para misturar e incubar em temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo de PCR em um separador magnético e espere até que a solução fique clara (~5 min). Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo e descarte as esferas de DNA Clean.
    2. Segunda rodada: Adicione 7,5 μL de grânulos de DNA Clean ao sobrenadante coletado. Pipete suavemente para misturar e incubar em temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo em um separador magnético e espere até que a solução fique límpida (~5 min). Descarte cuidadosamente o sobrenadante. Mantenha o tubo no separador magnético. Enxágue as esferas DNA Clean por 2 x 30 s com 200 μL de etanol a 80% recém-preparado em temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o sobrenadante após cada enxágue. Com o tubo ainda no separador magnético, abra a tampa do tubo e seque as esferas ao ar por 10 min. Finalmente, adicione 22,5 μL de Tris-HCl 10 mM (PH 8,0) para eluir o DNA.
      NOTA: As amostras de DNA podem ser armazenadas a -80 °C para preservação a longo prazo.
  7. Sequencie as bibliotecas em um sequenciador padrão de próxima geração.
    NOTA: Recomendamos obter pelo menos 10 a 20 milhões de leituras finais de pares.

7. Análise de dados de ATAC-seq e ChIP-seq de baixa entrada

  1. Preparando o ambiente virtual de análise (miniconda)
    1. Baixe o Miniconda3 do site usando os seguintes comandos e siga as instruções de instalação do Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Crie um ambiente virtrual para pipeline de análise de ATAC-seq e ChIP-seq.
      conda criar -n NGSpipeline
      conda ativar NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::gravata borboleta2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
    3. Baixe o arquivo de sequência do genoma de referência e faça um índice de alinhamento para o alinhamento da gravata borboleta2.
      Ganhe https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      gravata borboleta2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Execute o controle de qualidade das leituras ATAC-seq e ChIP-seq com o FastQC e resuma o relatório de controle de qualidade usando o MultiQC para garantir o viés de GC dos resultados do sequenciamento e complexidade de biblioteca suficiente para análise downstream. Descarte a biblioteca de sequências com resultados de controle de qualidade significativamente diferentes.
    fastqc -o ......
    multiqc
  3. Adaptador de sequenciamento de corte usando guarnição em abundância.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. Mapeie leituras aparadas para a montagem do genoma de referência mm10 com Bowtie2 usando parâmetros padrão e passe parâmetros de adição (--very-sensitive -X 2000) para bowtie2 para ATAC-seq devido à ampla distribuição de comprimento do fragmento ATAC-seq.
    1. Para ATAC-seq:
      gravata borboleta2 -p --very-sensitive -X 2000 -x <índice do genoma da etapa 7.1.3> -1 1> -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
    2. Para ChIP-seq:
      gravata borboleta2 -p -x <índice do genoma da etapa 7.1.3> -1 1> -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
  5. Remova leituras com baixa pontuação de alinhamento (q30) e leituras alinhadas ao genoma mitocondrial e cromossomo não padrão.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'aleatório' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Use o comando Picard MarkDuplicates para remover leituras de duplicatas de PCR.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=true
  7. Chame o pico usando o comando MACS2 callpeak com o parâmetro -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t -g mm -n -B -q 0.01
  8. Gere arquivos BigWig usando o comando Deeptools BamCoverage.
    índice samtools -@ 4
    bamCoverage -b     -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsando RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Use o navegador de genoma IGV para visualizar o arquivo narrowPeak do macs2 e os arquivos BigWig do Deeptools BamCoverage.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para gerar a paisagem de cromatina de colangiócitos primários, otimizamos os protocolos ChIP-seq e ATAC-seq de baixa entrada para números baixos (~ 100.000) de colangiócitos primários. Os resultados da eletroforese em gel de agarose para colangiócitos primários indicaram que, para 1 × 105 colangiócitos primários, 0,02 U MNase a 37 °C por 5 min resultou na produção de mononucleossomos, que foi identificada como a concentração ótima (Figura 1).

Vi...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para mapear de forma sistemática e abrangente a dinâmica do estado da cromatina subjacente à transição de estado dos colangiócitos císticos, otimizamos com sucesso ChIP-seq e ATAC-seq de baixa entrada para um número limitado de colangiócitos primários. Embora este estudo tenha se concentrado em colangiócitos primários, estamos confiantes de que o protocolo também pode ser aplicado a outras células primárias de alta viabilidade com disponibilidade limitada. Da mesma forma, embora este est...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82402166 para RJ).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7,5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8,0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Gel de agaroseBiosharpBS081
ATAC DNA Library Kit de preparaçãoVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stock
Kit de preparação para biblioteca de DNA ChIPVazymeND607
DNA Clean beadsVazymeN411
SolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) estoque
FluorômetroInvitrogenQ33226
GlicogênioThermo ScientificR0561
HemocitômetroQIUJINGXB. K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% estoque
Separador magnéticoPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881,5 M estoque
MNaseSigmaN37550,01 U/µ L stock
NaClSangon BiotechA6104765 M stock
NP40SolarbioN8030
Água livre de nucleaseLife TechnologiesAM9937
Instrumento de PCRApplied Biosystems4484073
Kit de purificação de PCRQIAGEN28106
Inibidor de proteaseRoche
Contas de Proteína GInvitrogen10004D
Proteinase KTransGenGE201-01
RotatorKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010%  estoque
Desoxicolato de sódioSigmaS1827
Thermomixer confortoEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
trim-galore0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
Reagente de extração de DNA 04693132001

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Multi omics TechniquesChromatin StateLow input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
Vídeo em breve

Artigos relacionados