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Artigo de método

O sistema Circadian Rave: um sistema acessível, de código aberto e fácil de construir para qualquer experimento baseado em luz

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DOI:

10.3791/68611

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26 de setembro de 2025

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1School of Biochemistry, University of Bristol, 2School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, University of Bristol, 3Neuroscience and Mental Health Innovation Institute, School of Biosciences, Cardiff University

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para construir, programar e executar o Circadian Rave System, um controlador de diodo emissor de luz (LED) baseado em Arduino para gerenciar vários regimes de luz complexos.

Resumo

O controle preciso da iluminação tem amplas aplicações em todas as ciências biológicas, mas nenhuma mais do que na pesquisa circadiana. A vida na Terra desenvolveu relógios circadianos que são reguladores endógenos da fisiologia e do comportamento que se arrastam para o dia solar de 24 horas. Para estudar o relógio, os pesquisadores contam com a manipulação experimental da luz ou da temperatura para arrastar os ritmos circadianos. Atualmente, a maioria dos laboratórios usa equipamentos de iluminação disponíveis comercialmente ou construídos internamente para imitar ou interromper o ciclo natural diurno e noturno. Esses sistemas oferecem programabilidade e precisão limitadas, carecem de padronização e, em alguns casos, acessibilidade. Para resolver esses problemas, desenvolvemos o Circadian Rave System, um pacote de software e hardware sob medida que permite o controle preciso de várias caixas de luz independentes. Tornamos o software de código aberto, juntamente com guias detalhados de construção de hardware, com o objetivo de que pesquisas futuras possam ser padronizadas por meio do uso desse sistema. Para demonstrar a funcionalidade deste sistema e sua utilidade em experimentos circadianos, medimos a longevidade e a atividade de Drosophila em vários paradigmas de luz para mostrar a sincronização circadiana e a interrupção por meio da manipulação da luz. Em conclusão, desenvolvemos um sistema de iluminação padronizado, escalável e acessível que pode ser construído internamente por qualquer pesquisador com conhecimento prévio mínimo em eletrônica ou programação.

Introdução

O controle preciso da luz é fundamental em quase todas as experimentações envolvendo animais. Para a criação em laboratório desses animais, podem ser adquiridas incubadoras disponíveis comercialmente com capacidade limitada para programar regimes complexos de ciclo de luz e escuridão. A capacidade de programar regimes de iluminação complexos é necessária para muitos campos de estudo, mas é crítica na pesquisa circadiana. O relógio circadiano, arrastado para o dia solar, é um oscilador endógeno que regula as mudanças na fisiologia e no comportamento de insetos para mamíferos1. Como tal, a pesquisa circadiana começou a permear muitos campos da pesquisa biológica, como desenvolvimento2, imunidade3 e patologia de doenças humanas4. Os estudos do relógio circadiano dependem fortemente do uso de luz ou temperatura para manipular ou mesmo interromper o relógio por meio do controle preciso do tempo, intensidade e ciclo 5,6. Atualmente, há necessidade de um sistema acessível, escalável e padronizado de controle dessas variáveis para uso em experimentos circadianos.

Além de manipular o relógio circadiano endógeno, várias ferramentas optogenéticas foram desenvolvidas que usam comprimentos de onda específicos da luz para controlar a expressão de transgenes in vivo e in vitro. Por exemplo, a imensa tratabilidade genética da Drosophila melanogaster resultou em muitas ferramentas optogenéticas disponíveis para os pesquisadores. Por exemplo, a variante shineGal4 sensível à luz do fator de transcrição Gal4 pode ser ativada após a exposição à luz azul e é uma ferramenta usada rotineiramente por muitos laboratórios 7,8,9. Os pesquisadores tendem a obter mudanças de luz ligando manualmente as luzes ou por indução a laser, mas ambos os métodos podem introduzir restrições logísticas e técnicas durante o projeto e a implementação experimental. A capacidade de programar o início, a parada, o comprimento de onda específico, o ciclo e a intensidade (dosagem) da luz seria de extremo benefício.

Para dar aos pesquisadores controle total das condições de iluminação, projetamos o Circadian Rave System (CRS). Este é um sistema alternativo, acessível e faça você mesmo (DIY) que pode ser construído e adaptado por pesquisadores, permitindo a personalização total dos regimes de iluminação. O sistema conta com um microcontrolador Arduino que pode controlar até seis canais de LED independentes, tornando o sistema acessível e escalável. Microcontroladores como o Arduinos têm sido usados com sucesso para fazer muitos equipamentos de laboratório DIY devido à sua facilidade de uso 10,11,12. Este sistema pode ser usado em incubadoras existentes e foi testado com sucesso em temperaturas experimentais típicas, fornecendo uma ampla gama de funcionalidades (4-37 °C). Os usuários podem programar o SRI por meio do software de código aberto personalizado que foi desenvolvido para vários sistemas operacionais. O software possui uma interface de usuário fácil de usar, permitindo a programação de regimes de luz complexos para imitar mais de perto os padrões de luz solar. Esses regimes de luz personalizados podem ser criados, salvos e posteriormente carregados no microcontrolador, para que um conjunto de regimes de luz gerados anteriormente possa ser usado, economizando tempo durante a configuração experimental. Uma vez que o dispositivo tenha sido programado, ele pode ser desconectado do computador, o que permite escalabilidade em comparação com sistemas convencionais que requerem computadores dedicados para executar regimes de iluminação. Para testar a confiabilidade do CRS, realizamos análises de vida útil e atividade em Drosophila exposta a vários regimes de luz gerados pelo CRS. Descobriu-se que o CRS executa de forma confiável vários regimes de iluminação continuamente por meses.

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Protocolo

1. Construindo o SRI

NOTA: O SRC foi projetado para ser construído internamente por pesquisadores e, como tal, todos os componentes estão disponíveis comercialmente em vários fornecedores (Tabela de Materiais). As exceções são as placas de circuito impresso (PCB) que devem ser produzidas comercialmente por especialistas em impressão de PCB ou entrando em contato com os autores. Para produção comercial, os arquivos Gerber estão no repositório GitHub (@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB). Os departamentos de engenharia da universidade normalmente têm instalações de impressão de PCB. Abaixo estão instruções detalhadas sobre como construir, verificar a qualidade e programar uma única unidade CRS.

  1. Montagem do circuito
    1. Solde os componentes elétricos na placa de circuito impresso do microcontrolador. Os pinos do conector Arduino A1 são os únicos componentes montados na parte inferior. A colocação dos componentes na placa de circuito impresso corresponde à rotulagem de letras e números na placa de circuito impresso (Tabela 1). Teste as conexões soldadas com um multímetro.
    2. Insira o Arduino na parte inferior do PCB montado usando as conexões A1.
    3. Solde os LEDs ou tiras de LED a um fio de cabo de 12 V (recomendado para ter pelo menos 1 m de comprimento) e aparafuse as extremidades positiva e negativa do fio de 12 V ao bloco de terminais da placa de circuito impresso e, em seguida, prenda no lugar com uma chave de fenda.
      NOTA: Os PCBs de LED personalizados (@Trincatalyst / CRS / Hardware / gerber / LED_PCB) podem ser usados como alternativa para tiras de LED; cada PCB de LED abriga um único LED. Isso oferece a vantagem de usar LEDs com espectros de emissão conhecidos e discretos.
    4. Repita a etapa 1.1.3 para cada um dos seis canais.
      NOTA: Se estiver usando fitas de LED, cada canal de LED pode lidar com até 400 mA de corrente, o que equivale a um máximo de 20x LEDs (20 mA cada). Portanto, o sistema foi projetado para ser usado com fitas de LED de 5 V com até 20 LEDs conectados a cada um dos seis canais de saída.
  2. Gabinete CRS para construção
    1. Coloque o CRS (PCB e Arduino) para garantir a segurança e longevidade dos circuitos.
      NOTA: O repositório GitHub possui um gabinete imprimível em 3D impresso com sucesso em PLA e ABS, protegendo o dispositivo (@Trincatalyst/CRS/Hardware/CRS_enclosure).
  3. Caixas de LED
    1. Integre os LEDs diretamente nas incubadoras, substituindo as configurações de iluminação pré-existentes, ou coloque-os em gabinetes sob medida que podem ser empilhados em uma única incubadora (Figura 1).
    2. Os gabinetes sob medida oferecem os benefícios de maior escalabilidade, acessibilidade e requisitos de espaço reduzidos. A reciclagem de plásticos de laboratório, como caixas de pontas, pode reduzir ainda mais os custos (Figura 1D). "Escureça" essas caixas recicladas com fita isolante para evitar vazamento de luz. No entanto, para uma solução mais durável, os gabinetes de máquina de acrílico, que foram testados com sucesso (@Trincatalyst/CRS/Hardware/LED_enclosure).
      NOTA: Certifique-se de testar se o gabinete é à prova de luz, pois o vazamento pode confundir outros experimentos próximos que estão sendo executados em paralelo e teste se os LEDs não aumentam a temperatura interna do recipiente se estiverem usando tiras de LED em um recipiente pequeno.
  4. Instalando o firmware no CRS
    1. Baixe o firmware do CRS que consiste em dois arquivos: os arquivos definition.h e CircadianRaveSystem.ino. Ambos podem ser encontrados no repositório GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software/PCB_firmware).
    2. Baixe e instale o software de ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) do Arduino do www.arduino.cc/software.
    3. Conecte o Arduino ao computador por meio de um cabo USB e, dentro do IDE do Arduino, selecione a porta de comunicação (COM) correta do Arduino e estabeleça uma conexão.
      NOTA: O Arduino não precisa ser conectado ao circuito PCB durante a configuração do firmware.
    4. Em seguida, vá para Arquivo > Abrir e selecione a pasta que contém os arquivos definition.h e CircadianRaveSystem.ino.
    5. Quando uma nova janela do IDE for aberta, clique em Verificar e em upload. Isso instalará o firmware no Arduino. O terminal de saída deve exibir uma saída de conclusão.
    6. Desconecte o Arduino, que agora está pronto para ser usado como um SRI.
  5. Ligando o SRI
    1. Alimente o CRS inserindo uma fonte de alimentação de 5 V com capacidade de 2.5 A no cilindro de alimentação do PCB.
      NOTA: Cada canal de LED é projetado para lidar com corrente de até 400 mA, o que equivale a um máximo de 20x LEDs a 20 mA cada. O sistema foi projetado para ser usado com fitas de LED de 5 V com até 20 LEDs conectados a cada um dos seis canais de saída. O PCB está equipado com um dispositivo de proteção contra sobretensão e sobrecorrente, que dispara a uma corrente contínua de 3 A ou se o usuário conectar uma tensão de alimentação superior a 6,2 V, a energia será cortada.
  6. Teste de qualidade do SRI
    1. Antes de executar experimentos com o SRI, teste se cada LED/faixa de LED conectada ao SRI funciona de forma confiável por pelo menos 2 dias. Para fazer isso, execute o arquivo CRS_test_profile.txt encontrado no repositório GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software/Test/CRS_test_2days.txt) ou projete um regime de luz dentro do software CRS. A etapa 2.6 dos perfis de carregamento tem instruções sobre como executar o arquivo CRS_test_2days.txt.

2. Executando um experimento

  1. Siga os próximos passos para instalar o software CRS que permite a programação, execução e verificação de regimes de iluminação complexos.
  2. Instalando o software CRS
    1. Baixe o software CRS diretamente do repositório GitHub (@CRS/CRS_software).
      NOTA: O software foi exaustivamente testado e é totalmente compatível com os seguintes sistemas operacionais:
      Para Windows 10 e 11, baixe @Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip.
      Para macOS Ventura, baixe @Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zip.
    2. Localize e abra o software CRS baixado. Isso iniciará a instalação e, uma vez concluída, estará pronto para uso.
      NOTA: Recomenda-se alterar a localização do software para uma pasta mais acessível.
  3. Conectando ao dispositivo CRS
    1. Ligue o SRI.
    2. Use um cabo da Future Technology Devices International (FTDI) para conectar o dispositivo CRS a um computador com o software CRS pré-instalado.
    3. Abra o software CRS e clique no menu suspenso Selecionar porta na guia View , selecione o CRS e as seis tabelas de LED devem ser atualizadas quando conectadas. Se os experimentos estivessem em execução, cada perfil seria atualizado de acordo. Cada LED CRS está pronto para ser programado.
  4. Programação CRS
    NOTA: O CRS foi projetado com experimentos circadianos em mente, e o máximo de funcionalidade relevante possível foi adicionado. Por exemplo, um experimento complexo típico pode exigir arrastamento de luz por dias, seguido de escuridão por alguns dias e, em seguida, um novo arrastamento.
    1. Programe totalmente o experimento no SRC antes da experimentação. Programe cada um dos LEDs/fitas de LED em cada um dos seis canais de saída independentemente usando as guias de LED de um a seis (Figura 1B). Encontre uma representação gráfica dos regimes de iluminação programados dentro de cada guia LED e use-a como referência durante a programação.
    2. Os regimes de iluminação foram divididos em três etapas distintas, e cada uma pode ter uma intensidade de luz e duração definidas. As etapas 1 e 3 fazem ciclos e podem atuar como etapas de sincronização entre diferentes canais de LED, ou seja, permitindo o carregamento de amostras nos gabinetes de LED em momentos diferentes. Repita a etapa 2 usando um alternância de ciclismo, que normalmente é programado para abranger um período de 24 horas.
    3. Ao alternar a intensidade da luz e as durações de T1, T2, T3 e T4, regimes de luz complexos são criados. T1 e T3 atuam como intermediários, permitindo aumentar e diminuir a intensidade da luz, imitando mais de perto o dia natural e o ciclo da luz. Depois que um programa for definido, salve e execute.
      NOTA: Quando um regime de luz programado estiver em execução, o regime gráfico será atualizado de acordo e a guia View será atualizada.
  5. Armazenamento e carregamento de perfis leves
    1. Para regimes de luz que são repetidos entre experimentos, salve o perfil usando o botão Salvar , que converterá o perfil em um arquivo txt legível por SRC.
    2. Carregue perfis salvos anteriormente no CRS usando o botão Carregar , agilizando a programação futura.
  6. Carregando e executando perfis
    1. Para teste, execute o testador profile para cada faixa de LED simultaneamente. Vá para as guias LED , clique no perfil Carregar e clique no CRS_test_profile.txt.
    2. Clique em Programa para carregar o perfil no SRC. O gráfico deve ser atualizado junto com as estatísticas do perfil.
    3. Clique em Iniciar e o gráfico será atualizado ao vivo com o progresso da execução. Repita isso para todos os seis perfis de LED.
  7. Desconectando do hardware CRS
    1. Desconecte com o botão Desconectar localizado na guia Exibir . Agora, remova o cabo FTRI com segurança.
  8. Verificando o progresso dos experimentos
    1. Para verificar o status dos regimes de luz enquanto o SRI está em execução, abra o software SRC e, na guia Exibir , clique no menu suspenso Selecionar porta e selecione o SRC. A guia de exibição tem todas as informações atuais de todas as seis guias de LED. Desconecte conforme descrito anteriormente.

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Resultados

Visão geral do SRC
O SRI é uma combinação de hardware e software que permite aos usuários programar regimes de iluminação complexos para até seis faixas de LED independentes por dispositivo (Figura 1A). O software pode ser facilmente baixado do repositório GitHub (@Trincatalyst/CRS/Software) e na página principal do software, instruções de uso mais detalhadas podem ser encontradas (Figura 1B). O hardware foi projetado para ser acessível e fác...

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Discussão

Para investigar como a luz influencia a fisiologia e o comportamento, são necessários cronogramas de iluminação complexos, normalmente com várias condições funcionando em paralelo. O controle preciso do tempo e da intensidade da exposição à luz também é fundamental para dados confiáveis e reprodutíveis nesses experimentos circadianos. O ciclo de luz pode ser alcançado com incubadoras disponíveis comercialmente ou LEDs ligados a plugues temporizadores mecânicos. No entanto, esses sistemas...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Edgar Buhl e ao Prof. James Hodge pelo uso do sistema DAM e orientação de configuração. Também gostaríamos de agradecer ao Prof. Paul Martin por seu apoio e orientação no desenvolvimento do CRS. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa BBSRC BB / T001984 / 1 concedida ao Prof. Paul Martin.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1 µ F Capacitor de cerâmicaFarnell 2507749Quantidade = 2
100 kΩ resistor THT axial 250 mWFarnell 3951804Quantidade = 6
100 e ômega; resistor THT axial 250 mWFarnell 3496799Quantidade = 6
1 µ F Capacitor de cerâmicaFarnell 2819603Quantidade = 2
Montagem Horizontal de Cabeçalho de Furo Passante de 2,54 mm de passo - FTDI Farnell 3756363Quantidade = 6
Cabeçalhos Arduino 10 viasFarnell 1593417Quantidade = 1
Cabeçalhos Arduino 3 viasFarnell 1593412Quantidade = 1
Cabeçalhos Arduino 8 viasFarnell 1593416Quantidade = 1
Arduino Uno R3Arduino A000066Quantidade = 1
Macaco de barrilFarnell 224959Quantidade = 1
PCB do sistema Rave circadianoLaboratório MartinLaboratório Martin1 (120 tiras ou 1 componente de LED com uma placa de circuito impresso de LED)
Diodo Farnell 4245041Quantidade = 1
Proteção de Circuito eFuseFarnell 4178928Quantidade = 1
Cabo FTDIFarnell 2419945Quantidade = 1
LedsRS 855-5933120 tiras ou 1 componente LED com uma placa de circuito impresso LED
FONTE DE ALIMENTAÇÃO 15WFarnell 2815857Quantidade = 1
Terminais de parafuso Farnell 2314973Quantidade = 6
ST Microelectronics MOSFET de canal N STP30NF10Farnell 9946403Quantidade = 6

Referências

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