Microscopia de localização por ultrassom para mapeamento de super-resolução da microvasculatura cerebral de roedores

Resumo

A Microscopia de Localização Ultrassônica (ULM) é uma técnica recentemente desenvolvida que permite um nível de resolução sem precedentes na imagem da microvasculatura in vivo. Neste trabalho, descrevemos em detalhes como obter imagens super-resolvidas da microvasculatura cerebral em roedores usando uma plataforma de ultrassom funcional padronizada projetada para pesquisa pré-clínica.

Resumo

A Microscopia de Localização por Ultrassom (ULM) é uma técnica de imagem de super-resolução que permite a visualização in vivo da arquitetura microvascular do cérebro, ultrapassando o limite de difração do ultrassom convencional. Ao detectar e rastrear microbolhas injetadas por via intravenosa à medida que circulam pelos vasos cerebrais, o ULM produz mapas de alta resolução de densidade vascular, velocidade de fluxo e amplitude de sinal retroespalhado em escalas espaciais de até 5 a 10 μm. Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para a realização de imagens ULM em roedores, incluindo preparação animal, posicionamento da sonda, aquisição de imagens, injeção de microbolhas e processamento de dados, usando uma plataforma de ultrassom funcional dedicada. Dois métodos de preparação são descritos, adaptados para camundongos (transcranianos) e ratos (com janelas cranianas), seguidos por instruções detalhadas para alinhamento da sonda e direcionamento anatômico usando um atlas cerebral integrado. Durante a aquisição, sequências de ultrassom ultrarrápidas são sincronizadas com injeções em bolus de microbolhas para capturar dados de fluxo dinâmico. As etapas de reconstrução subsequentes envolvem filtragem de desordem, interpolação de imagem, detecção de microbolhas, localização de subpixel e rastreamento de trajetória. Os resultados incluem mapas de densidade refletindo a ocupação da embarcação, mapas de velocidade revelando padrões de fluxo e direcionalidade e mapas de amplitude que oferecem contraste adicional para interpretação estrutural. Os resultados representativos ilustram a aquisição bem-sucedida em planos coronais completos e destacam armadilhas comuns, como baixa qualidade de injeção, artefatos de movimento e aberração induzida pelo crânio. O protocolo é compatível com estudos transversais e longitudinais e é particularmente adequado para investigar alterações cerebrovasculares em modelos de envelhecimento, acidente vascular cerebral, aneurisma e doenças neurodegenerativas. Ao combinar penetração em profundidade, alta resolução espaço-temporal e imagens vasculares sem marcadores, o ULM oferece uma ferramenta poderosa para análise não invasiva da microcirculação cerebral em modelos pré-clínicos.

Introdução

Embora o cérebro represente apenas 2% da massa do corpo, ele consome cerca de 20% de seu oxigênio e glicose para sustentar^{a atividade} neuronal. Essa alta demanda metabólica é atendida por uma intrincada rede vascular, desde grandes artérias e veias até microvasos como arteríolas, vênulas e capilares, regulados por meio de acoplamento neurovascular². A interrupção desse processo finamente ajustado tem sido implicada em um amplo espectro de distúrbios neurológicos. O desacoplamento neurovascular, por exemplo, é uma característica patológica precoce em doenças como Alzheimer, Parkinson, Huntington e Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), muitas vezes precedendo as características clássicas da neurodegeneração, como beta-amilóide e patologia tau 3,4,5,6. A imagem da natureza complexa do cérebro in vivo tem sido, portanto, a principal preocupação para atender à crescente necessidade de entender os processos fisiológicos. Os avanços tecnológicos forneceram recursos exclusivos para sondar a função e a atividade cerebral, direta e indiretamente, com precisão, resolução e acessibilidade crescentes.

A ultrassonografia com Doppler emergiu como uma ferramenta poderosa para a medição funcional da atividade cerebral usando o fluxo sanguíneo⁷. Em particular, a imagem com power Doppler, projetada para detectar o movimento dos glóbulos vermelhos (RBCs), transmite pulsos ultrassônicos repetidos aos vasos sanguíneos e registra a amplitude dos ecos ultrassônicos retroespalhados pelo movimento das hemácias⁸. O advento da ultrassonografia ultrarrápida, especificamente o ultrassom funcional (fUS), marcou um ponto crucial na superação das limitações anteriores. De fato, o ultrassom convencional examina o tecido linha por linha - uma abordagem sequencial que limita sua aplicação às principais artérias cerebrais, pois os fluxos sanguíneos lentos típicos da microvasculatura do cérebro não podem ser detectados⁹. A técnica fUS mais recente usa várias transmissões de ondas planas para adquirir milhares de quadros por segundo, melhorando drasticamente a resolução temporal e a relação sinal-ruído (SNR). Crucialmente, o fUS permite a detecção de alterações hemodinâmicas em vasos muito pequenos com velocidades tão baixas quanto 1 mm / s, apoiando imagens funcionais em tempo real da atividade cerebral até o nível das arteríolas⁸.

Embora os métodos Doppler ultrarrápidos tenham melhorado significativamente a imagem microvascular, eles ainda são limitados pela resolução limitada por difração do ultrassom¹⁰. Em conjunto com a fUS, a microscopia de localização por ultrassom (ULM) rompe esse impedimento, permitindo a visualização de estruturas microvasculares no nível capilar, aproveitando agentes de contraste e algoritmos de localização de alta precisão¹¹. Isso fornece informações sem precedentes sobre a morfologia e função vascular. Mais especificamente, no ULM, agentes de contraste feitos de microbolhas estabilizadas cheias de gás, com aproximadamente 1-3 μm de diâmetro, são injetados na corrente sanguínea. Eles atuam como fortes dispersores acústicos que podem ser detectados como fontes pontuais individuais. Dado que as microbolhas são significativamente menores que o comprimento de onda do ultrassom, elas podem ser isoladas espacial e temporalmente, aparecendo como a função de propagação pontual (PSF) do sistema. Inspirada em técnicas de super-resolução óptica, como STORM e PALM, a localização de sub-pixels dessas microbolhas é obtida usando métodos de deconvolução que mapeiam suas posições com alta precisão 10,12,13,14. Isso permite que as estruturas vasculares sejam resolvidas em uma resolução espacial de 5 a 10 μm, muito além do limite imposto pela difração da imagem Doppler ultrarrápida convencional.

O ULM é uma ferramenta poderosa e eficaz para o mapeamento vascular até a escala capilar e supera as limitações de muitos métodos ópticos restritos às camadas superficiais. Sua capacidade de realizar imagens microvasculares em animais vivos, permitindo estudos longitudinais e farmacológicos, é outra vantagem importante do ULM sobre outras técnicas que requerem fixação e coloração cerebral. As informações extraídas vão além dos mapas vasculares estáticos, fornecendo estimativas quantitativas do fluxo sanguíneo até o nível capilar, abrindo assim caminhos promissores para aplicações pré-clínicas e clínicas. Para facilitar a reprodutibilidade, descrevemos um fluxo de trabalho completo para imagens cerebrais baseadas em ULM em roedores, implementadas usando uma plataforma de imagem de ultrassom funcional padronizada projetada para pesquisa pré-clínica.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos neste estudo foram conduzidos em conformidade com a Diretiva do Conselho da Comunidade Europeia de 22 de setembro de 2010 (010/63/UE) e aprovados pelo comitê de ética local (Comitê d'éthique en matière d'expérimentation animale número 59, 'Paris Centre et Sud', projeto #2020-16). Os experimentos foram realizados em camundongos machos adultos C57BL/6 Rj (2 meses de idade, 20-30 g) e ratos Sprague-Dawley Rj:Han (200-300 g) de origem comercial. Os animais foram alojados em grupos de quatro por gaiola sob um ciclo claro/escuro de 12 horas, com temperatura constante de 22 °C, e com comida e água fornecidas ad libitum. Antes do início dos experimentos, todos os animais foram submetidos a um período mínimo de uma semana de aclimatação às condições de alojamento. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

1. Anestesia e preparo animal em camundongos
   1. Coloque o camundongo na câmara de indução de isoflurano, administrando isoflurano a 2% com ar (0,075 L/min) e oxigênio (0,175 L/min, ou ar medicinal).
   2. Após 5 min de indução anestésica, transfira o animal para a estrutura estereotáxica, que é colocada sobre uma almofada de aquecimento ajustada a 37 °C para manter a temperatura corporal e garantir a administração contínua de Isoflurano por meio de uma máscara na mesma concentração e taxa de fluxo.
   3. Confirme a profundidade adequada da anestesia verificando a ausência de reflexos em resposta a um beliscão no dedo do pé ou na cauda usando pressão firme, mas não prejudicial. Se houver um reflexo, aumente ligeiramente a concentração de isoflurano. Reavalie antes de prosseguir.
   4. Aplique pomada para os olhos para prevenir a formação de catarata.
   5. Raspe a cabeça do mouse usando um aparador. Aplique um creme depilatório, deixe descansar por 1-1,5 min, depois enxágue com água morna e seque com gaze. Repita conforme necessário até que todo o cabelo seja removido. Evite deixar o creme depilatório por longos períodos de tempo, pois pode causar danos químicos à pele.
   6. Aplique gel de ultrassom centrifugado (sem bolhas, desgaseificado) na cabeça para garantir o acoplamento acústico.
2. Anestesia e preparo animal em ratos
   1. Após pesar o rato, administrar uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) usando uma seringa de 1 mL. Raspe o pelo no topo da cabeça e limpe a pele com uma solução de iodo.
      NOTA: A cetamina é uma substância altamente regulamentada em muitos países e pode exigir autorização especial para aquisição e uso. Esquemas anestésicos alternativos podem ser usados para obter anestesia em nível cirúrgico.
   2. Posicione o animal em um aparelho estereotáxico que é colocado sobre uma almofada de aquecimento regulada para 37 °C para manter a temperatura corporal. Aplique uma quantidade generosa de pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento e a formação de catarata.
   3. Injetar meloxicam (2 mg/kg) por via subcutânea utilizando uma seringa de 1 ml para analgesia intraoperatória.
   4. Confirme a profundidade adequada da anestesia verificando a ausência de reflexos em resposta a um beliscão do dedo do pé ou da cauda usando pressão firme, mas não prejudicial. Se um reflexo estiver presente, administre uma dose adicional igual a um quarto da dose inicial do anestésico. Aguarde aproximadamente 5 min antes de reavaliar a profundidade da anestesia. Prossiga apenas quando um plano cirúrgico de anestesia for confirmado e reavalie a cada 20-30 minutos.
   5. Faça uma incisão longitudinal ao longo da sutura sagital usando um bisturi, garantindo que o corte seja profundo o suficiente para incluir a pele e os tecidos conjuntivos presos ao crânio.
   6. Mantenha os tecidos circundantes bem hidratados durante toda a cirurgia usando solução salina fisiológica.
   7. Usando uma broca rotativa, trace levemente o contorno da janela craniana marcando a camada superficial do crânio. Para um acesso ideal ao cérebro, a janela deve ter cerca de 14 mm na dimensão lateral e pelo menos 2 mm na dimensão anteroposterior, dependendo do tamanho do crânio.
   8. Continue fresando ao longo do contorno até que não haja resistência óssea. Durante a perfuração, aplique periodicamente algumas gotas de soro fisiológico para resfriar o osso e minimizar os danos térmicos. Uma espátula fina e arredondada deve ser facilmente inserida na lacuna sem força.
   9. Usando movimentos curtos e unidirecionais, afine a última camada de osso até que a resistência seja quase imperceptível.
   10. Insira uma espátula fina e ligeiramente curvada com bordas arredondadas na borda lateral da janela craniana.
   11. Mova lentamente a espátula em direção ao centro, destacando suavemente o osso das meninges. Quando não houver resistência, levante e remova totalmente a peça óssea destacada.
   12. Aplique gel de ultrassom centrifugado em cima da dura-máter. Uma descrição da configuração experimental é representada na Figura 1.

Figura 1: Esquema da configuração experimental para imagens cerebrais ULM em roedores. O sistema de imagem consiste em uma unidade de aquisição de ultrassom conectada a uma sonda de alta frequência montada em uma platina de posicionamento motorizada. Tanto camundongos quanto ratos são mostrados em quadros estereotáxicos: o camundongo apresenta um couro cabeludo raspado para imagens transcranianas, enquanto o rato passa por imagens através de uma janela craniana preparada cirurgicamente. Um cateter de veia caudal é colocado para injeção de agente de contraste em ambas as espécies. Essa configuração permite a aquisição estável de dados de ultrassom funcional de alta resolução durante a injeção de microbolhas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cateterismo da veia caudal
   1. Use um conjunto de infusão alada de 27 G × 1/2" conectado a uma agulha de 18 G × 1/2" com tubo de 8". Encurte a tubulação, se possível, para minimizar o volume morto.
   2. Gire suavemente a cauda do animal 90 graus para expor as veias laterais da cauda (veja a Figura 2). Prenda a cauda no lugar usando fita adesiva para garantir a estabilidade e evitar movimentos desnecessários durante o cateterismo.
   3. Identifique a veia da cauda começando na extremidade distal (ponta da cauda) e movendo-se em direção à base. Para facilitar esta etapa, a cauda pode ser aquecida com água morna para promover a vasodilatação e melhorar a visibilidade das veias.
   4. Usando um dedo, aplique uma leve pressão na base da cauda e deslize-a em direção ao local da injeção (ou seja, contra a direção do fluxo sanguíneo). Essa manobra impede temporariamente o retorno venoso, fazendo com que as veias caudais se distendam e se tornem mais proeminentes, facilitando a inserção do cateter.
   5. Insira a agulha de 27 G × 1/2" do conjunto de infusão alada paralelamente à veia, certificando-se de que o chanfro esteja voltado para cima.
   6. Observe o tubo quanto à presença de flashback de sangue, o que confirma o posicionamento correto da agulha.
      NOTA: Comece o cateterismo na extremidade da cauda distal para evitar vazamentos de punções anteriores durante as injeções subsequentes. Se o cateterismo da veia da cauda for desafiador ou malsucedido, rotas centrais alternativas podem ser consideradas. Estes incluem o seio retro-orbital, a veia jugular ou a veia safena.

Figura 2: Anatomia transversal da cauda do roedor ilustrando marcos vasculares para cateterismo. Um desenho esquemático de uma seção transversal através da cauda distal do roedor, mostrando as posições relativas dos principais vasos sanguíneos. Duas artérias estão presentes perto da linha média: a artéria caudal dorsal, localizada na região superior (dorsal), e a artéria caudal ventral, posicionada na parte inferior (ventral) da seção transversal da cauda. Essas artérias são normalmente evitadas durante procedimentos intravenosos. Flanqueando as artérias lateralmente estão as veias caudais, que correm simetricamente em ambos os lados e ficam logo abaixo da pele, tornando-as os locais de acesso preferidos para cateterismo ou injeção de microbolhas. Essa visão anatômica auxilia na localização precisa das veias, especialmente quando aprimorada pelo aquecimento para promover a vasodilatação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Posicionamento da sonda usando o software IcoScan
   1. Na plataforma de aquisição, inicie o software de aquisição fUS (por exemplo, IcoScan para Iconeus One) e crie uma sessão de experimento. Ajuste a posição da sonda de ultrassom.
      NOTA: Posicione a sonda aproximadamente 1 mm acima da cabeça do animal. Certifique-se de que a sonda esteja em contato com o gel de ultrassom antes de iniciar qualquer sequência de imagem.
   2. Inicie a aquisição no Live View e ajuste a posição da sonda conforme necessário usando imagens de volume sanguíneo cerebral (CBV) em tempo real. O cérebro deve estar centrado na imagem. Otimize os parâmetros de imagem, como contraste e compressão, para melhorar a qualidade da visualização.
   3. Abra o menu Angio3D no software de aquisição. Ajuste os parâmetros de varredura (Primeira Fatia, Última Fatia e Tamanho do Passo), garantindo que eles cubram todo o cérebro. Inicie a aquisição.
      NOTA: Ao configurar os parâmetros de varredura, certifique-se de que a varredura cubra a parte posterior do cérebro, ou seja, todas as artérias posteriores.
   4. Mantenha o software de aquisição aberto e inicie o software IcoStudio para análise e visualização de dados. Carregue a varredura Angio3D .
   5. Vá para o painel Brain Registration e registre a varredura no Allen Mouse Common Coordinate Framework usando o modo de registro totalmente automático ou manual.
   6. Salve o registro como um arquivo .bps.
   7. Em seguida, vá para o menu Brain Navigation . No painel do Atlas Manager , use o navegador de árvore Pai/Filho para navegar no Allen Mouse Brain Atlas. Selecione as regiões anatômicas de destino, que serão sobrepostas à varredura no painel de 3 visualizações.
   8. Escolha um plano de imagem que se sobreponha às regiões de interesse. Defina manualmente dois marcadores na visualização coronal para definir a fatia de imagem desejada.
   9. Clique no Sistema de Posicionamento Cerebral (BPS) para extrair as coordenadas motoras correspondentes à posição da sonda para obter imagens do plano selecionado. Verifique a visualização da imagem, calculada a partir da varredura Angio3D, e clique em Copiar coordenadas BPS.
   10. Mude para o software IcoScan e abra o painel Posicionamento da sonda . Clique em Inserir coordenadas BPS e cole os valores extraídos na etapa 1.4.9. A sonda se moverá e se alinhará automaticamente com o plano de imagem selecionado.
   11. Execute uma aquisição de Visualização direta para confirmar se o plano de imagem atual corresponde ao plano previsto da etapa 1.4.8.
       NOTA: Ao salvar e reutilizar os mesmos marcadores espaciais, o plano de imagem pode ser redefinido de forma consistente entre as sessões, permitindo o reposicionamento preciso da sonda para estudos longitudinais.

2. Aquisição da ULM

1. Preparação de microbolhas
   NOTA: Uma variedade de agentes de contraste de ultrassom disponíveis comercialmente pode ser usada. No entanto, a composição do gás, a concentração de bolhas, o diâmetro e a estabilidade podem variar dependendo do produto utilizado. Siga as recomendações do fabricante em relação à preparação e armazenamento.
   1. Usando uma seringa estéril, injete 5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% no frasco através do septo.
      NOTA: Para administrações repetidas em bolus ou infusão contínua, um volume menor de solução de cloreto de sódio a 0,9% pode ser usado para preparar uma suspensão de microbolhas mais concentrada. Ajustar o factor de diluição em conformidade com a aplicação prevista.
   2. Agite o frasco vigorosamente por 20 s para ressuspender totalmente as microbolhas e obter uma dispersão uniforme.
2. Gravação ULM
   1. Predefina os parâmetros de gravação, incluindo a sequência de ultrassom, a taxa de quadros e o tempo total de gravação.
      NOTA: Os parâmetros recomendados para gravação são de 5 a 10 minutos a 2.5 Hz.
   2. Desenhe o volume de microbolhas a serem injetadas e inicie a aquisição. Uma vez iniciada a aquisição, prossiga com a injeção de microbolhas. Recomenda-se a injeção de 200 μL para ratos e 100 μL para camundongos, na diluição apropriada.
   3. Confirme o aprimoramento de contraste na imagem no modo Live View. Imediatamente depois, lave as microbolhas restantes no volume morto injetando fluido fisiológico no cateter. Um exemplo típico de um perfil de intensidade de microbolhas é mostrado na Figura 3.
   4. Aguarde a conclusão da aquisição e salve os dados.
   5. Ao final da aquisição, proceda da seguinte forma, dependendo do protocolo utilizado:
      1. Para camundongos (protocolo não invasivo): Reverter a anestesia interrompendo a administração de isoflurano e monitorar o animal durante a recuperação em um ambiente quente até ficar totalmente acordado.
      2. Para ratos (protocolo invasivo com janela craniana): Eutanásia do animal por injeção intraperitoneal de Euthasol (pentobarbital sódico, 140 mg/kg), de acordo com as diretrizes institucionais e éticas.

Figura 3: Intensidade do sinal de microbolhas ao longo do tempo. (A) Ilustração da região de interesse (ROI) usada para extração de sinal, abrangendo toda a fatia do cérebro coronal. (B) Curso de tempo da intensidade do sinal de microbolhas durante uma aquisição de 5 minutos. O bolus de microbolhas foi injetado aos 30 s, resultando em um aumento característico na amplitude do sinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Reconstrução de imagem usando o software IcoLab

1. Abra o IcoLab e navegue até ULM clicando na guia ULM na parte mais à esquerda da tela.
2. Clique em Compute ULM Maps para iniciar o fluxo de trabalho de processamento, conforme detalhado na Figura 4.
3. Selecione a pasta de origem que contém os dados adquiridos.
4. Escolha a verificação específica a ser processada e ajuste os limites de tempo de processamento, se necessário.
5. Clique em Avançar para prosseguir para a etapa Relatório. Na etapa Relatórios, configure o caminho da pasta de saída onde os arquivos processados serão salvos. Defina os parâmetros de visualização para as imagens que serão incluídas no relatório do PowerPoint.
6. Revise o resumo das opções selecionadas exibidas na tela final.
7. Quando estiver pronto, clique em EXECUTAR para iniciar o processamento. Assim que o processamento estiver concluído, um arquivo .trk será gerado, contendo todas as coordenadas das microbolhas localizadas, juntamente com arquivos TIFF rasterizados para densidade, velocidade e amplitude retroespalhada (BSA).
   NOTA: Uma aquisição de 5 minutos pode exigir várias horas de processamento. Esta etapa é melhor executada durante a noite ou em uma estação de trabalho dedicada.
   1. Geração de mapas de densidade de microbolhas: As posições localizadas de todas as microbolhas detectadas são acumuladas ao longo do tempo de aquisição selecionado. Mapeie essas posições em uma grade espacial de resolução fixa.
      NOTA: Cada pixel no mapa de densidade resultante reflete a contagem de microbolhas localizadas nesse compartimento espacial. O resultado final é uma imagem em tons de cinza (TIFF) em que a intensidade do pixel corresponde à ocupação do vaso, permitindo a reconstrução de alta resolução da rede vascular.
   2. Geração de mapas de velocidade: O software rastreia microbolhas individuais em quadros consecutivos para formar trajetórias. Para cada trajetória, o software calcula um vetor de velocidade dividindo o deslocamento pelo tempo decorrido (produzindo um vetor de velocidade em mm/s).
      NOTA: Dois tipos de mapas de velocidade podem ser gerados: mapas de velocidade absoluta, onde cada pixel armazena a magnitude média da velocidade das microbolhas que passam, e mapas de velocidade direcional, onde a velocidade é decomposta ao longo de um eixo anatômico escolhido (ou seja, x ou z), e o componente assinado correspondente é armazenado. Esses mapas são rasterizados na mesma grade espacial e salvos como imagens TIFF individuais.
   3. Geração de mapas BSA: Para cada microbolha localizada, a amplitude do sinal de ultrassom bruto (intensidade retroespalhada) é exibida. Projete essas amplitudes na grade espacial, acumulando a intensidade do sinal em cada pixel. O mapa BSA resultante destaca as regiões onde as microbolhas passaram pela área focal do feixe, fornecendo contraste que complementa os mapas de densidade e velocidade¹⁵.

Figura 4: Fluxograma do pipeline de processamento para reconstrução do mapa ULM. A figura ilustra as etapas de processamento sequencial realizadas no software de análise para gerar mapas ULM a partir de dados brutos de ultrassom. A partir de quadros compostos (n = 200), a Etapa 1 aplica a filtragem de desordem de decomposição de valor singular (SVD) para isolar sinais de microbolhas (MB) do fundo do tecido. Na Etapa 2, os sinais MB passam por interpolação de Lanczos, resultando em uma pilha de imagens pré-processada. A etapa 3 executa a detecção de máximos locais e os correlaciona com a função de propagação de pontos (PSF) do sistema para identificar locais de microbolhas candidatas. Na Etapa 4, a localização de subpixels (detecção de centróide) e o rastreamento de partículas são usados para extrair trajetórias de microbolhas, a partir das quais os mapas de velocidade e amplitude retroespalhada são calculados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Visualização de dados usando o software IcoStudio

1. Carregue um arquivo .trk no IcoStudio para iniciar a exploração de dados.
2. Ajuste os parâmetros de visualização, como contraste, compactação e mapa de cores, no painel do lado direito para refinar a representação dos dados.
3. Defina o tempo de integração usando o controle deslizante duplo na parte inferior da exibição principal para definir os quadros inicial e final.
4. Abra a guia Densidade para visualizar as ocorrências de microbolhas e selecione entre Densidade absoluta (contagem por pixel) e Densidade direcional (ponderada axialmente).
5. Use a guia Velocidade para exibir a velocidade da microbolha em mm/s por meio de vários modos: Absoluto, Direcional, Axial e Lateral. Ajuste os limites de contraste, compactação e velocidade para aprimorar a visualização.
6. Explore a guia BSA para visualizar a refletividade das microbolhas, fornecendo um mecanismo de contraste alternativo que destaca as estruturas microvasculares e o movimento fora do plano. Exporte capturas de tela PNG de alta resolução ou gere arquivos TIFF para análise quantitativa com configurações personalizáveis de tamanho de pixel e tipo de dados.

Resultados

Os exemplos representativos na Figura 5 mostram um exemplo típico de dados ULM de um cérebro de rato adquirido ao longo de 1 minuto de gravação após 200 μL de injeção em bolus de microbolhas, com uma resolução de 10 μm.

Figura 5: Saídas representativas de ULM adquiridas de um rato craniotomizado após uma única injeção de microbolhas. Exemplos de mapas de densidade de microbolhas (MB) (esquerda), velocidade (centro) e amplitude retroespalhada (direita) são mostrados para uma fatia cerebral coronal completa, adquirida ao longo de 1 minuto de gravação após uma injeção de bolus de 200 μL de microbolhas. Barra de escala: 2mm. As inserções ampliadas destacam a microvasculatura cortical esquerda (barra de escala: 0,5 mm). O mapa de densidade reflete a distribuição espacial das ocorrências de RO, revelando a estrutura da rede vascular. O mapa de velocidade ilustra a velocidade do fluxo e a direcionalidade de MBs individuais, permitindo a diferenciação entre os tipos de vasos. O mapa de amplitude mostra o sinal de ultrassom retroespalhado dos MBs, fornecendo um mecanismo de contraste adicional que melhora a visualização da morfologia do vaso e do movimento fora do plano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os mapas resultantes ilustram três visões complementares da microvasculatura cerebral: densidade de microbolhas (MB) (esquerda), velocidade (centro) e amplitude retroespalhada (direita). Cada mapa corresponde a uma fatia coronal completa do cérebro, com inserções ampliadas destacando a microvasculatura cortical esquerda (barras de escala: 2 mm e 0,5 mm, respectivamente).

O mapa de densidade mostra a distribuição espacial das ocorrências de MB no campo de visão. A morfologia dos vasos é resolvida muito abaixo do limite de difração, revelando grandes vasos e estruturas capilares finas. Esse tipo de mapa permite a visualização clara da topologia da rede vascular, incluindo bifurcações e padrões de ramificação, mesmo em regiões corticais profundas.

O mapa de velocidade exibe a velocidade do fluxo de MBs individuais projetados ao longo da direção axial (z). Essa projeção produz valores de velocidade sinalizados, onde as velocidades negativas refletem o fluxo ascendente para o córtex e os valores positivos refletem o fluxo descendente. No córtex cerebral de roedores, a arquitetura vascular é altamente estereotipada: arteríolas penetrantes descem da superfície pial para as camadas corticais, enquanto as vênulas sobem do córtex de volta à superfície para drenar o sangue desoxigenado¹⁶. Esse arranjo anatômico consistente permite o uso de medidas de velocidade direcional para distinguir entre os tipos de vasos, com velocidades axiais positivas geralmente indicando fluxo arterial e velocidades negativas indicando drenagem venosa. No geral, os valores de velocidade medidos com o MSU são consistentes com as faixas relatadas anteriormente na literatura^10,17, variando de 10-20 mm/s em arteríolas penetrantes a vários centímetros por segundo nas principais artérias intracranianas. Esses achados estão de acordo com observações anteriores de que as microbolhas em fluxo imitam de perto o comportamento reológico dos glóbulos vermelhos¹⁸, validando o uso de ULM para quantificar a dinâmica fisiológica do fluxo sanguíneo em microescala.

O mapa de amplitude retroespalhada (BSA) fornece uma representação espacial da intensidade do sinal de ultrassom retornado por cada MB. Como a energia retroespalhada é maximizada quando os MBs passam pela região focal, este mapa oferece contraste com base na posição de elevação. Ele ajuda a refinar a segmentação identificando movimentos fora do plano ou vasos de baixa amplitude, principalmente em profundidades maiores ou perto das bordas focais. Os mapas BSA também são valiosos para detectar atenuação de sinal relacionada à profundidade ou identificar incompatibilidades no alinhamento focal¹⁵.

Para demonstrar a reprodutibilidade do direcionamento do plano com o Sistema de Posicionamento Cerebral, a Figura 6A mostra os mapas de densidade vascular do ULM adquiridos no mesmo camundongo sob anestesia no dia 0 (Semana 1) e no dia 7 (Semana 2), visando o mesmo plano coronal. A sobreposição de ambos os mapas mostra uma forte correspondência espacial do sinal vascular, confirmando a precisão do reposicionamento plano e a confiabilidade dos experimentos longitudinais, como mostrado anteriormente¹⁹.

A análise quantitativa pode ser aplicada a qualquer uma dessas saídas. Por exemplo, os usuários podem segmentar vasos usando limiares de intensidade ou algoritmos de agrupamento e, em seguida, extrair estatísticas regionais, como densidade de vasos, velocidade média de fluxo e parâmetros morfométricos, incluindo raio do vaso, comprimento médio, número de ramificações e outros descritores estruturais da rede vascular. Comparações entre regiões corticais ou grupos experimentais (por exemplo, drogas injetáveis versus controle) podem ser realizadas diretamente nesses mapas ou por meio de estatísticas paramétricas derivadas em vasos comumente identificados^20,21. Como exemplo dessa análise, realizamos quantificações regionais de parâmetros vasculares no córtex somatossensorial esquerdo (S1BF, Figura 6B) e no tálamo esquerdo (Figura 6C). Os mapas de densidade foram primeiro binarizados, esqueletizados e os raios dos vasos foram estimados usando uma transformada de distância euclidiana. As velocidades de fluxo foram obtidas diretamente das trajetórias do MB, e a taxa de fluxo foi derivada do raio do vaso usando a lei de Poiseuille, conforme detalhado anteriormente²¹. A mesma metodologia descrita nesse estudo foi aplicada aqui. Os gráficos de bigode exibem as distribuições do raio do vaso, velocidade e taxa de fluxo para d0 e d7, demonstrando boa reprodutibilidade entre as sessões. Juntos, esses resultados ULM multimodais permitem uma caracterização abrangente da rede microvascular do cérebro, oferecendo insights anatômicos e dinâmicos com resolução sem precedentes.

Figura 6: Reprodutibilidade longitudinal do direcionamento plano e exemplo de quantificações vasculares usando o Sistema de Posicionamento Cerebral. (A) Mapas de densidade vascular ULM adquiridos do mesmo camundongo anestesiado no dia 0 (Semana 1) e no dia 7 (Semana 2), visando o mesmo plano coronal usando o Sistema de Posicionamento Cerebral (barra de escala = 1 cm). A sobreposição de ambos os mapas mostra uma forte correspondência espacial do sinal vascular, ilustrando a reprodutibilidade do posicionamento do plano entre as sessões. (B, C) Quantificação representativa de parâmetros vasculares extraídos de duas regiões de interesse: córtex somatossensorial esquerdo (S1BF, B) e tálamo esquerdo (C). Para cada região, exibimos o mapa de densidade vascular em d0 (barra de escala = 0,5 cm), juntamente com gráficos de bigode mostrando a distribuição do raio do vaso (μm), velocidade do fluxo (mm/s) e taxa de fluxo (mm³/s) em d0 e d7 (mediana, percentil 25-75, bigodes = 1,5×IQR, outliers plotados individualmente). Esses resultados ilustram a capacidade do pipeline de extrair métricas morfométricas e hemodinâmicas dos dados ULM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A Microscopia de Localização por Ultrassom (ULM) representa um avanço transformador na imagem de ultrassom, permitindo a visualização em super-resolução da microvasculatura além do limite de difração convencional. Esta discussão destaca as etapas críticas do protocolo ULM, aborda possíveis modificações e estratégias de solução de problemas, explora as limitações do método, avalia sua importância em comparação com modalidades alternativas de imagem e considera sua importância e possíveis aplicações na pesquisa biomédica.

Etapas críticas no protocolo ULM

Várias etapas são cruciais para a implementação bem-sucedida do ULM, e sua influência é ilustrada na Figura 7. Uma das etapas mais importantes é a administração de microbolhas, pois tanto a concentração quanto a qualidade da entrega afetam diretamente os resultados da imagem. Uma concentração ideal é necessária para equilibrar a resolução espacial e a detectabilidade. A entrega inadequada, como má colocação do cateter ou extravasamento, pode resultar em sinal vascular muito baixo e reconstruções incompletas, como mostrado na Figura 7B, onde apenas um número esparso de microbolhas atinge a corrente sanguínea. A imagem de alta taxa de quadros, normalmente na faixa de kilohertz, é essencial para capturar o movimento rápido de microbolhas e permitir um rastreamento confiável entre os quadros. Qualquer instabilidade durante a aquisição, como movimento introduzido pela respiração, má fixação ou anestesia insuficiente, pode degradar a precisão da localização. Um exemplo disso é ilustrado na Figura 7C, onde o movimento excessivo durante a aquisição resulta em um mapa de densidade borrado e inutilizável.

A localização e o rastreamento de microbolhas dependem de algoritmos avançados de processamento de imagem que detectam bolhas individuais, realizam a localização de subpixels e reconstroem trajetórias com precisão de subdifração. Mesmo com aquisição e processamento adequados, fatores anatômicos, como aberrações induzidas pelo crânio, ainda podem afetar a qualidade da imagem. Em imagens transcranianas, particularmente em camundongos mais velhos, o espessamento do crânio pode introduzir distorção acústica. Isso leva a artefatos de sombreamento característicos sob a sutura sagital, onde nenhuma microbolha é detectada, conforme ilustrado na Figura 7D. Tais aberrações reduzem a relação sinal-ruído e podem obscurecer as estruturas vasculares, a menos que sejam corrigidas com filtragem adaptativa ou refinando o posicionamento da sonda.

Quando todas as etapas são executadas com sucesso, mapas ULM de alta qualidade são alcançáveis, conforme mostrado na Figura 7A, onde uma rede vascular densa e bem resolvida é reconstruída por meio de uma abordagem transcraniana.

Figura 7: Exemplos de referência e solução de problemas para qualidade de imagem ULM em camundongos. O painel (A) mostra um mapa de densidade de microbolhas (MB) transcraniano ULM de alta qualidade adquirido em um camundongo adulto jovem, ilustrando o mapeamento vascular bem-sucedido em todo o plano coronal. O painel (B) exibe um exemplo de sinal vascular fraco devido ao extravasamento de microbolhas ou acesso venoso insuficiente, resultando em detecções esparsas de MB. O painel (C) mostra uma aquisição afetada pelo movimento excessivo do animal, produzindo um mapa de densidade borrado e não interpretável. O painel (D) destaca a aberração acústica induzida pelo crânio comumente observada em camundongos mais velhos, visível como um cone de sombra abaixo da sutura sagital, onde nenhum MBs é detectado devido à redução da relação sinal-ruído. Esses exemplos servem como referências visuais para identificar e abordar artefatos experimentais comuns em imagens ULM. Barra de escala: 1mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Limitações do método

Apesar de suas muitas vantagens, o ULM possui limitações inerentes que afetam sua aplicabilidade. O viés do vaso fora do plano é um problema significativo na imagem 2D, pois os vasos que se estendem para fora do plano de imagem não são reconstruídos adequadamente, levando a mapas vasculares incompletos. Essa limitação pode ser mitigada pela transição para abordagens de imagem volumétrica (3D)²², embora isso aumente a complexidade computacional. Os desafios do cateterismo intravenoso também representam um obstáculo, especialmente em modelos de pequenos animais, onde alcançar a entrega consistente de microbolhas pode ser tecnicamente exigente. A estabilidade das microbolhas também é um fator limitante, especialmente durante sessões de imagem prolongadas. Devido à sua meia-vida de circulação curta, as microbolhas podem exigir injeções repetidas em bolus ou protocolos de infusão contínua para manter o contraste adequado durante todo o período de aquisição. Os artefatos de movimento continuam sendo uma preocupação significativa, principalmente para indivíduos acordados, onde mesmo pequenos movimentos involuntários podem degradar a imagem de super-resolução. Finalmente, a penetração em profundidade no ULM é inerentemente limitada pela atenuação do ultrassom. Embora isso geralmente não seja problemático para imagens de roedores em altas frequências (por exemplo, 15 MHz), torna-se mais desafiador em animais maiores, como suínos ou primatas não humanos. Nesses casos, sondas de frequência mais baixa podem ser necessárias para atingir profundidade de imagem suficiente, mas isso tem o custo de resolução espacial reduzida - ressaltando uma troca importante entre profundidade e detalhes que deve ser considerada ao traduzir ULM para modelos pré-clínicos maiores.

Importância do ULM em comparação com os métodos existentes

A Microscopia de Localização Ultrassônica (ULM) oferece vantagens substanciais sobre as modalidades de imagem convencionais, particularmente no contexto de imagens microvasculares. Entre seus pontos fortes mais notáveis está sua capacidade de ultrapassar o limite de difração do ultrassom tradicional, alcançando imagens de subdifração em escalas espaciais comparáveis a técnicas ópticas, como microscopia de dois fótons. Ao contrário desses métodos ópticos, no entanto, o ULM fornece penetração mais profunda no tecido, permitindo o acesso a regiões cerebrais que, de outra forma, seriam difíceis de visualizar de forma não invasiva.

O ULM também oferece recursos de imagem funcional, permitindo a avaliação quantitativa da velocidade do fluxo sanguíneo, dinâmica de perfusão e remodelação vascular. Essas características o tornam altamente adequado para investigar processos fisiológicos e alterações patológicas em redes neurovasculares. Comparado à ressonância magnética e ao PET, o ULM é mais econômico, não requer infraestrutura pesada e evita o uso de agentes de contraste com riscos de toxicidade conhecidos, contando com microbolhas cheias de gás com perfis de segurança favoráveis.

A combinação de alta resolução espacial e temporal torna o ULM particularmente valioso para uma variedade de aplicações de pesquisa. É especialmente poderoso em estudos direcionados a estruturas microvasculares e núcleos cerebrais profundos, onde as modalidades tradicionais geralmente ficam aquém. Além disso, ao contrário das abordagens histológicas que requerem fixação e coloração do tecido, o ULM permite imagens em tempo real em animais vivos, apoiando projetos longitudinais e intervenções dinâmicas, como desafios farmacológicos.

Além do mapeamento vascular estático, o ULM também permite imagens funcionais de alta resolução, capturando a dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral com excepcional precisão espacial e temporal. Avanços recentes demonstraram sua viabilidade para neuroimagem funcional de todo o cérebro em roedores, revelando mudanças dependentes de atividade espontânea e evocadas por estímulos no fluxo sanguíneo no nível capilar em redes cerebrais distribuídas². Isso posiciona o ULM como uma ferramenta poderosa para estudos funcionais, preenchendo efetivamente a lacuna entre a imagem hemodinâmica de mesoescala e o mapeamento da atividade neuronal.

Considerações sobre usabilidade, eficiência e reprodutibilidade

O fluxo de trabalho ULM descrito neste protocolo foi otimizado para facilitar a implementação e a reprodutibilidade em diferentes configurações experimentais. O uso de componentes disponíveis comercialmente, incluindo microbolhas aprovadas pela FDA e EMA e procedimentos padrão de anestesia para roedores, garante ampla acessibilidade. Além disso, a integração de todo o pipeline de processamento dentro do software dedicado (IcoLab) melhora muito a usabilidade, automatizando etapas complexas, como localização de microbolhas, reconstrução de trajetória e geração de mapas. Essa interface simplificada reduz a necessidade de código personalizado e minimiza a intervenção do usuário, oferecendo suporte a resultados consistentes entre usuários e experimentos. Embora o processamento ULM de alta resolução seja computacionalmente intensivo, especialmente para aquisições longas ou dados volumétricos, as ferramentas de processamento em lote e a aceleração de GPU reduzem significativamente o tempo de análise. O design modular do protocolo também suporta reprodutibilidade, permitindo que os pesquisadores ajustem os parâmetros de aquisição e processamento, mantendo uma estrutura analítica robusta. O protocolo também inclui uma seção dedicada ao posicionamento da sonda usando o IcoScan e o IcoStudio, que permite aos usuários reposicionar a sonda de forma confiável exatamente na mesma fatia de imagem nas sessões, com uma precisão de aproximadamente 100 μm. Esse recurso é particularmente valioso para estudos longitudinais, onde a consistência espacial precisa é essencial para rastrear as alterações vasculares ao longo do tempo. Esses recursos reduzem coletivamente a barreira de entrada para novos usuários e suportam a implantação escalável do ULM em estudos de imagem exploratórios e longitudinais.

Conclusão

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho completo para implementar a Microscopia de Localização por Ultrassom (ULM) em imagens cerebrais de roedores, abrangendo preparação cirúrgica, administração de microbolhas, aquisição de imagens e mapeamento vascular de alta resolução usando uma plataforma padronizada de aquisição e análise otimizada para pesquisa pré-clínica. O ULM representa um grande avanço na imagem biomédica, oferecendo visualização in vivo de super-resolução da microvasculatura com detalhes sem precedentes. Em comparação com as modalidades de imagem existentes, o ULM fornece uma combinação única de alta resolução espacial, quantificação de fluxo funcional e acessibilidade, tornando-o especialmente adequado para estudos de desenvolvimento vascular, acoplamento neurovascular e fisiopatologia da doença. À medida que a tecnologia continua a amadurecer, o ULM está prestes a se tornar uma pedra angular na pesquisa pré-clínica e, eventualmente, nas aplicações de neuroimagem clínica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Controlador de temperatura animal (placa térmica acoplada a uma sonda retal)	Fisitem	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, França	Antisedan	Solução injetável de 5 mg/mL
C57BL/6 camundongos	Janvier Labs	SC-C57J-M	C57BL/6Rj camundongos machos, 8 semanas de idade
Broca dentária	Foredom, EUA	Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidade K.1070
Creme depilatório	Vichy	N/A
Pomada para os olhos	TVM, Reino Unido	Ocry-gel
Aparador de cabelo	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
Software de processamento IcoLab (v 1.2.0.0)	Iconeus, França	IcoLab
Configuração do Iconeus One Xpand	Iconeus, França	IconeusOne Xpand
Sonda IcoPrime 15MHz	Iconeus, França	Sonda IcoPrime-15MHz
Software de aquisição IcoScan (v1.9.0)	Iconeus, França	IcoScan
Software de análise IcoStudio (v2.2.0)	Iconeus, França	IcoStudio
Solução de iodo	Mylan, França	N/A
Estação de anestesia isoflurano	Minerve, Esternay, França	N/A
Ketamina	Virbac, França	Ketamine1000	Solução injetável de 100 mg/mL
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	Solução injetável de 0,5 mg/mL
Agulhas	Terumo, França	AN*1838R1	18 G x & frac12; ” agulha de 8" Tubulação
Água salina	Laboratoire Gilbert Physiodose, Farmácia, França	N/A
Bisturi	DREXCO Medical, França	80011
Microbolhas SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Espátula	Phymed, França.	Kit de Micromotor Rotativo de Alta Velocidade K.1070
Sprague-Dawley RJ:Rats Han	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - ratos machos Sprague Dawley, 200-300 g
Quadro estereotáxico	David Kopf (Tujunga, EUA)	900-WA	Usando Adaptador de Mouse  (Ref: 922) e Barras Auriculares Sem Ruptura (ref: 922)
Seringa	DREXCO Medical, França	2058
Gel de ultrassom	DREXCO Medical, França	Medi'Gel
Conjunto de infusão alado	Terumo, França	SV*27EL
Xylazine 2%	Bayer, França	Rompun	Solução injetável de 20 mg/mL