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Reprogramação Xenolivre Definida de Progenitores do Sangue do Cordão Umbilical para Células-Tronco Pluripotentes e Semelhantes a Blastômeros Induzidas

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DOI:

10.3791/68613

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22 de agosto de 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve métodos quimicamente definidos para reprogramação episomal de células estaminais induzidas por células estaminais induzidas por humanos convencionais (hiPSC). Esses XF / FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) podem ser eficientemente revertidos para células-tronco naïve reguladas por inibidores de Tankyrase / PARP1 semelhantes a blastômeros (TIRN-SC) possuindo diferenciação aumentada e potencial de quimera interespécies.

Resumo

A reprogramação do progenitor mieloide do sangue do cordão umbilical humano (CB) para um estado de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) de alta fidelidade pode ser alcançada usando vetores epissómicos não integradores e sinais estromais. Essas linhagens CB-hiPSC convencionais e preparadas podem ser posteriormente revertidas quimicamente com alta eficiência para um estado de célula-tronco ingênua regulada por tankirase / inibidor de PARP (TIRN-SC) semelhante a um blastômero com totipotência funcional. Os TIRN-SCs regulados por PARP são células-tronco humanas com alta plasticidade epigenética, impressões epigenômicas estáveis e têm maior potência de diferenciação do que os hiPSCs convencionais preparados por linhagem. Aqui, métodos otimizados de XF / FF são descritos para reprogramação epissomal eficiente ativada pelo estroma mesenquimal de progenitores mielóides CD34 + CD33 + CB em hiPSC XF / FF convencional. A reversão TIRN potencializou de forma reprodutível o hiPSC convencional XF / FF para adotar características transcricionais, epigenéticas e funcionais de células embrionárias humanas em estágio de clivagem com expressão gênica reduzida de linhagem preparada. Validamos que o XF-hiPSC derivado de CB revertido por TIRN exibiu melhora acentuada na diferenciação de várias linhagens direcionadas (incluindo linhagens hematovasculares) em um amplo repertório de origens geneticamente independentes. Esses métodos servem como um primeiro passo para gerar linhas TIRN-SC compatíveis com cGMP para bancos de doadores 'Universais' definidos por HLA de grau clínico TIRN-SC (UTIRN-SC). A derivação de linhagens UTIRN-SC com versatilidade de diferenciação aprimorada de progenitores CD34+ CD33+ CB pode ter um alto impacto na medicina regenerativa. Por exemplo, os UTIRN-SCs podem gerar bancos de tecidos de progenitores cardíacos, vasculares e neurais criopreservados definidos por HLA para terapias celulares abrangentes de várias linhagens "prontas para uso".

Introdução

Embora as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) ofereçam oportunidades promissoras para terapias celulares personalizadas, sua aplicação clínica enfrenta grandes desafios, incluindo tumorigenicidade, imunogenicidade e heterogeneidade fenotípica e funcional1, que afetam sua segurança, eficácia e custo-efetividade. Além disso, progenitores comprometidos com a linhagem derivados de linhagens hiPSC convencionais e preparadas são gerados com eficiências de diferenciação entre linhas altamente variáveis2 e exibem enxerto e funcionalidade in vivo limitados. No entanto, tais limitações podem ser superadas usando métodos de reprogramação otimizados3 ou estados alternativos de células-tronco 4,5.

Embora as eficiências de reprogramação episófica não viral das células somáticas da pele ou do sangue em hiPSC sejam baixas (~ 0,01% -2%)6, a reprogramação de quatro fatores altamente otimizada de progenitores CB pode ser alcançada e pode atingir até 50% de eficiência em massa em condições de co-cultura ativadas por progenitor de tronco estromal mesenquimal (MSC)7. Neste sistema, a reprogramação celular de progenitores mielóides CB foi acelerada por sinais estromais solúveis e dependentes de contato. As linhagens hiPSC derivadas de CB episómicas preparadas para estroma (SP) diferenciaram-se em progenitores vasculares (VP) com maior eficiência do que as hiPSC derivadas de fibroblastos convencionais 3,5. O VP derivado de SP-CB-iPSC exibiu identidade transcricional de VP embrionária mais autêntica, senescência reduzida e sensibilidade a danos no DNA 3,4. A VP derivada de SP-CB-iPSC também demonstrou enxerto in vivo mais robusto do que a VP convencional derivada de hiPSC após transplante sistêmico ou direto no vítreo de camundongos adultos imunodeficientes com lesão de isquemia-reperfusão retiniana 3,4.

Zimmerlin et al. estabeleceram um sistema de reprogramação química em duas etapas ('LIF-5i -> LIF-3i') que faz a transição de células-tronco pluripotentes humanas convencionais preparadas para um estado TIRN-SC com potencial de diferenciação multi-linhagemaprimorado 5. Os progenitores vasculares diferenciados derivados de TIRN-SC exibiram maior funcionalidade, maior estabilidade genômica e enxerto in vivo superior, como demonstrado por sua capacidade aprimorada de migrar e revascularizar as camadas neurais profundas da retina isquêmica4. O TIRN-SC foi submetido à reprogramação proteogenômica para adquirir um estado funcional híbrido semelhante ao blastômero com alta contribuição no ensaio de quimera interespecífica8. TIRN-SC manteve a expressão de DNMT1 e foi protegido contra a erosão em regiões de impressão genômica metilada por CpG. Curiosamente, SP-CB-hiPSC foram revertidos em TIRN-SC de forma mais eficiente do que hiPSC derivados por métodos alternativos e menos eficientes 5,9.

Assim, os TIRN-SCs são um estado alternativo de células-tronco com capacidade aprimorada de diferenciação de várias linhagens e contribuição eficiente de quimeras. Otimização adicional de
A reprogramação TIRN-SC em condições de cultura definidas e compatíveis com cGMP facilitará a geração de uma ampla gama de tipos de células e tecidos funcionais e enxertáveis para terapias. Para atender à necessidade de progenitores terapêuticos econômicos, esses métodos podem ser aplicados para produzir bancos de grau cGMP de 'Doador Universal' TIRN-SC (UTIRN-SC) usando CB hematopoiético CD34+ definido por HLA ou progenitores de sangue periférico. Os progenitores derivados de UTIRN-SC definidos por HLA podem atender às necessidades de um número maior de pacientes que requerem regeneração imediata e multilinhagem de tecidos complexos.

Os paradigmas desenvolvidos para o transplante clínico de medula óssea (TMO) podem orientar o desenvolvimento de bancos UTIRN-SC a partir de células-tronco hematopoiéticas parcialmente compatíveis com HLA ou haplo-idênticas HLA de registros nacionais de doadores. Uma análise computacional preditiva e global dos 10 principais haplótipos combinados de 18 países, incluindo os EUA, forneceria uma cobertura média de pacientes de 68,4% desses 'haplobancos' hiPSC10. Um banco UTIRN-SC definido poderia não apenas fornecer progenitores comprometidos com a linhagem, mas também apoiar aplicações terapêuticas TIRN-SC de sistemas de complementação de blastocisto interespecíficos em animais domésticos (por exemplo, porcos) para geração de órgãos inteiros11,12, incluindo a geração de progenitores hematopoiéticos indutores de tolerância para reduzir a rejeição do enxerto em populações com ampla diversidade genética (por exemplo, EUA).

Este protocolo de reprogramação modificado para gerar linhas XF/FF hiPSC competentes para TIRN é um primeiro passo para o desenvolvimento de futuros bancos UTIRN-SC compatíveis com cGMP. Este protocolo descreve a reprogramação gradual e a validação funcional de progenitores mielóides CB humanos em linhas convencionais de XF-hiPSC. Esses XF-hiPSC demonstraram reversão fácil para TIRN-SC, com eficiência semelhante aos métodos não-XF7 e alcançaram pluripotência funcional irrestrita, incluindo capacidade aprimorada de produzir teratomas bem formados com redução de viés de linhagem (em relação ao XF-hiPSC isogênico com primer) 4 , 5 , 9 . Também descrevemos protocolos que validam o XF-hiPSC revertido por TIRN por sua diferenciação direta aprimorada e robusta para linhagens hematovasculares.

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Protocolo

Todos os experimentos de reprogramação estavam em conformidade com as diretrizes publicadas pela Academia Nacional de Ciências e pela Sociedade Internacional de Pesquisa com Células-Tronco (ISSCR). Para a geração de hiPSC, os protocolos de coleta de células de doadores e o consentimento informado do doador foram aprovados pela supervisão do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade Johns Hopkins (JHU). Todos os experimentos foram conduzidos sob a alçada da JHU Institutional Stem Cell Research Oversight (ISCRO) e estão em conformidade com os padrões institucionais relativos ao consentimento informado e avaliação de proveniência. Além disso, todo o uso de animais e procedimentos cirúrgicos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê do Instituto de Cuidados e Uso de Animais da JHU (IACUC). Todos os experimentos envolvendo procedimentos em animais (por exemplo, injeções subcutâneas / intramusculares de NOD. Camundongos Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) para análise de teratoma e transferência de blastocisto para camundongos pseudogránhes ICR) foram revisados e aprovados pelo JHU IACUC. Essas revisões incluíram considerações sobre sacrifício ético, alojamento humano e medidas apropriadas para minimizar o desconforto dos animais.

1. Reprogramação episómica de hiPSC xenofree sem alimentador

  1. Preparação de células progenitoras hematopoiéticas do doador
    1. Use células-tronco/progenitoras hematopoiéticas CD34+ criopreservadas (por exemplo, 1x106 células CB neonatais) imediatamente após o parto ou armazene criogeniais em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Certifique-se de que as células foram mantidas continuamente em um estado congelado durante o transporte e manuseio.
      NOTA: Alternativamente, células doadoras não criopreservadas também podem ser utilizadas imediatamente após a coleta e enriquecimento de CD34 usando protocolos aprovados.
    2. Antes de descongelar as células no banho-maria, abra suavemente o criovial esterilizado dentro de um gabinete de biossegurança para liberar qualquer gás preso dentro do frasco e, em seguida, feche bem o frasco.
    3. Colocar o frasco para injetáveis num banho-maria a 37 °C durante 1 a 2 min. Agite suavemente o frasco para injetáveis até quase não restar gelo. Remova o frasco do banho-maria e esterilize-o completamente (ou seja, spray de etanol a 70%).
      NOTA: Todas as etapas requerem técnica asséptica adequada e são realizadas dentro de um gabinete de segurança biológica estéril.
    4. Transfira suave e lentamente as células para um tubo cônico estéril vazio de 50 mL. Lave o frasco para injetáveis com 1 ml de meio de expansão de progenitor hematopoiético xenolivre frio (XF-HP) (Tabela 1) e combine suavemente (gota a gota ao longo das bordas do tubo) com as células para diluir o crioprotetor DMSO.
    5. Deixe o tubo em pé em um rack por 30 s e lentamente (gota a gota) adicione 2 mL de meio XF-HP frio. Gire suavemente a suspensão celular enquanto adiciona o meio. Repita esta etapa duas vezes adicionando sequencialmente 4, 8 e 4mL de meio XF-HP frio (até 20 mL de volume total). Centrifugue as células diluídas a 100 x g durante 10 min a 4 °C.
      NOTA: Não pipete as células para cima e para baixo na solução crioprotetora e durante as etapas de diluição. Adicione XP-HP médio gota a gota e lentamente até que o DMSO seja diluído pelo menos 10 vezes. Use meio frio, pois a diluição do DMSO resulta em uma reação exotérmica.
    6. Aspirar sobrenadante livre de células em uma cabine de biossegurança. Desaloje suavemente o pellet celular. Ressuspenda em 2 mL de meio de expansão XF-HP para contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
    7. Transfira as células descongeladas para placas de cultura de células de ligação ultrabaixa com vários poços (por exemplo, transfira 2 mL de mistura de célula / meio XF-HP para 1 poço de uma placa de 6 poços).
    8. Enrole firmemente o prato em filme plástico Saran para imitar condições hipóxicas. Transfira a placa para uma incubadora (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida). Em alternativa, coloque a placa não embalada numa incubadora com controlo de O2 (5% O2, 5% CO2, atmosfera húmida).
    9. Cultivar os progenitores hematopoiéticos durante 3 dias em meio XF-HP.
  2. Preparação de células-tronco progenitoras mesenquimais (MSC)
    1. Descongelar uma alíquota (0,75 - 1x106 células) de MSC humana de passagem baixa (p2 a p3) incubando uma alíquota criopreservada em banho-maria a 37 °C durante 1 a 2 min. Agite suavemente o frasco para injetáveis até quase não restar gelo. Remova o frasco do banho-maria e esterilize completamente (ou seja, etanol 70%).
      NOTA: As MSC humanas de baixa passagem (p2) podem ser adquiridas ou preparadas a partir da medula óssea humana usando protocolos estabelecidos e criopreservadas. As MSC podem ser descongeladas com cerca de 7 a 10 dias de antecedência e irradiadas/plaqueadas como uma camada alimentadora no dia anterior à nucleofecção (Figura 1).
    2. Suave e lentamente (gota a gota ao longo das bordas do tubo), transfira as células para um tubo cônico de 15 mL contendo meio de células-tronco mesenquimais sem soro sem soro frio (XF-MSC) (Tabela 1) dentro de um gabinete de biossegurança para diluir o crioprotetor DMSO pelo menos 10 vezes (por exemplo, transfira 1 mL de alíquota de células criopreservadas para 9 mL de meio XF-MSC).
    3. Use 1 ou 2 mL de meio XF-MSC frio para enxaguar o tubo e combinar no tubo cônico. Centrifugar as células diluídas a 100 x g durante 5 min a 4 °C.
    4. Aspirar sobrenadante livre de células em uma cabine de biossegurança. Ressuspenda suavemente o pellet celular em 1 mL de meio XF-MSC para contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
    5. Transfira as células descongeladas para placas de cultura de células tratadas com tecido (por exemplo, 5.000-6.000 células por cm2 ou cerca de 50.000 células em 1 poço de uma placa de 6 poços). Coloque as placas em uma incubadora (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida). Atualize o meio XF-MSC a cada 2-3 dias em um gabinete de biossegurança.
    6. No dia anterior à nucleofecção, aspire o sobrenadante livre de células em um gabinete de biossegurança. Lave o MSC uma vez com PBS (2 mL / poço). Aspirar PBS. Adicione 1 mL / poço de reagente de dissociação celular (por exemplo, 1X solução de tripsina-EDTA). Incubar durante 5 min a 37 °C numa incubadora de CO2 .
    7. Neutralize o reagente de dissociação adicionando 1 mL de meio XF-MSC (diluição de pelo menos 2 vezes) e triture suavemente com uma pipeta em uma suspensão de célula única. Recolha a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 100 x g por 5 min.
    8. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio XF-MSC para contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
    9. Irradie progenitores mesenquimais (2.000 rad) sob 5 passagens usando um irradiador de raios g ou X e placa em placas de superfície sintética revestidas com peptídeo Arg-Gly-Asp (RGD) de 6 poços (2x105 células por poço) em meio XF-MSC. Manter as placas durante a noite em uma incubadora (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).
  3. Reprogramação episómica Xenofree
    1. Colete culturas de CB HP de 3 dias em meio de expansão XF-HP em um tubo cônico de 15 mL em um gabinete de biossegurança. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
    2. Aspirar sobrenadante livre de células em uma cabine de biossegurança.  Ressuspenda suavemente o pellet celular em 1 mL de meio de expansão XF-HP para contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células.
    3. Combine 1x106 células HP expandidas com 100 μL de solução de nucleofecção de células CD34+ humanas (kit nucleofector de células CD34+ humanas). Adicione 6 μg de epissoma concentrado purificado (<5 μL) e transfira cuidadosamente para uma cubeta nucleofector usando a pipeta de transferência de plástico do kit de nucleofecção. Evite bolhas. Coloque a cubeta no dispositivo nucleofector e use o programa U-008.
      NOTA: Prepare estoques do vetor pCEP4 baseado em EBNA epissomal pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) por transformação de rotina em TOP10 E. coli e purifique usando kits de plasmídeo Maxi-prep. No dia da nucleofecção, limpe e concentre o plasmídeo usando um kit de purificação por PCR 7.
    4. Imediatamente após a nucleofecção, adicione 500 μL de meio de expansão XF-HP pré-aquecido na cubeta e transfira as células em 1 mL de meio XF-HP para 1 poço de placa de 6 poços de cultura de células de fixação ultrabaixa usando uma pipeta de transferência estéril.
      NOTA: As células nucleofectadas são muito frágeis e não sobreviverão à tensão de cisalhamento das pontas de pipeta regulares de 1 mL. A transferência para placas de cultura de fixação ultrabaixa é uma etapa que promove a recuperação celular pós-nucleofecção antes da fixação final em placas revestidas com RGD.
    5. Embrulhe bem o prato em filme plástico para imitar condições hipóxicas. Coloque a placa em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida). Em alternativa, coloque a placa não embalada numa incubadora com controlo de O2 (5% O2, 5% CO2, atmosfera húmida). Incubar por 4 a 6 horas.
      NOTA: Esta etapa permitirá que as células HP nucleofectadas se recuperem antes de serem transferidas para as monocamadas MSC.
    6. Colete as células em um tubo cônico de 15 mL em um gabinete de biossegurança. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
    7. Aspirar o sobrenadante dentro de uma cabine de biossegurança. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de expansão XF-HP. Células HP nucleofectadas em placas MSC irradiadas a uma densidade de cerca de 17.500 células por cm2 em placas revestidas com RGD em meio de expansão XF-HP (2 mL / poço) suplementado com inibidor de ROCK Y-27632 (concentração final de 10 μM). Coloque a placa em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).
    8. Dois dias após a nucleofecção, adicione 2 mL (volume igual) de meio E8 em cada poço dentro de um gabinete de biossegurança.
    9. Substitua metade do volume do meio de cultura em dias alternados por meio E8. Colete as células flutuantes em um tubo cônico de 15 mL, centrifugue a 200 x g por 5 min e adicione as células recuperadas de volta à cultura.
    10. No dia 21, prepare placas de 6 poços tratadas com cultura de tecidos revestidas com vitronectina. Adicione 1 mL de solução diluída de vitronectina (por exemplo, 40 mL / mL para Vitronectina-XF) a 1 poço de uma placa de 6 poços e incube por 1 hora em temperatura ambiente.
    11. Escolha manualmente colônias individuais de XF-hiPSC usando um microscópio invertido dentro de um gabinete de biossegurança. Triturar com pipeta e transferir colônias simples para placas revestidas de vitronectina em meio E8 suplementado com inibidor de ROCK Y-27632 (concentração final de 5 μM). Coloque a placa em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).
    12. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o meio por meio E8 sem suplementação com inibidor de ROCK. Troque o meio E8 todos os dias a partir de então (2 mL / poço) em um gabinete de biossegurança.

2. Cultura e manutenção de hiPSC de rotina

  1. Quando as colônias se tornarem maiores 5 a 6 dias depois (ou seja, 0,5 a 1 mm de diâmetro ou cerca de 80% de confluência), aspire o meio em um gabinete de biossegurança.
  2. Adicione 2 mL/poço de PBS para lavar as células. Aspire o PBS. Adicione 1 ml de solução de dissociação celular à base de EDTA. Incubar durante 5 min numa incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmosfera húmida). Verifique se as células estão frouxamente presas (por exemplo, células redondas brilhantes, mas ainda presas à placa) usando um microscópio.
  3. Aspire suavemente a solução de dissociação dentro de um gabinete de biossegurança sem interromper as células.
  4. Colete as células em 1-2 mL de meio E8 suplementado com inibidor de ROCK Y-27632 (concentração final de 5 μM) com pipetagem não vigorosa para manter os aglomerados celulares. Transfira aglomerados de células para placas tratadas com cultura de células de 6 poços revestidas com vitronectina (ver secção 1.3.11) (equivalente a 10 colónias por alvéolo ou divisão de 1:10). Coloque a placa em uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% CO2, atmosfera úmida).
  5. Continue a subcultura usando solução de dissociação celular à base de EDTA a cada 5-7 dias.
    NOTA: Subclonagem adicional ou coleta manual de colônias geralmente não é necessária para a reprogramação de SP-CB-hiPSC, mas se os clones hiPSC contiverem colônias com morfologia anormal (por exemplo, diferenciação espontânea, como fibroblastos ou formação de corpo embrióide, surgimento de colônias não planas anormais), selecione manualmente as colônias usando uma micropipeta e um microscópio dentro de um gabinete de biossegurança ou descarte clones aberrantes. A reprogramação não eficiente e não estável do hiPSC não é compatível com a reversão TIRN-SC.

3. Validação fenotípica de clones XF-hiPSC

  1. Expanda os clones XF-hiPSC por pelo menos 5-7 passagens para validação inicial (Figura 2), conforme descrito na seção 2, antes da criopreservação de longo prazo e aplicação em estudos funcionais. Registre o número de passagens em cada frasco criopreservado.
    NOTA: A caracterização inicial de clones XF-hiPSC de baixa passagem pode ser confirmada por vários ensaios, como atividade de fosfatase acilina e antígeno TRA-1 ou imunodetecção de NANOG.
  2. Realize a validação e enumeração de XF-hiPSC com coloração de fosfatase alcalina ( Figura 2A, B ).
    NOTA: As eficiências de reprogramação em culturas em massa podem ser determinadas em P0 3-5 semanas após nucleofecções episômicas, enumerando o número de colônias totalmente reprogramadas por células de entrada únicas plaqueadas no dia 3 7,13.
    1. Aspirar meio de cultura em uma cabine de biossegurança.
    2. Lave as células com PBS (2 mL por poço). Aspirar PBS. Fixe as células adicionando solução de paraformaldeído / PBS a 2%. Incube por 10 min em temperatura ambiente.
    3. Remova e descarte a solução de paraformaldeído/PBS de acordo com as diretrizes de segurança de resíduos químicos.
    4. Lave as células com PBS (2 mL por poço). Aspirar PBS. Adicione 1-2 mL de substrato de fosfatase alcalina e incube por 10 a 15 min em temperatura ambiente com agitação lenta.
    5. Lave 3 vezes com PBS para interromper a reação. Fotomicrografia e enumerar.
      NOTA: Evite tempo ou temperatura de incubação excessivos, pois isso pode resultar em coloração falsa positiva.
  3. Realize a validação e enumeração da coloração XF-hiPSC com imunocolorações do antígeno TRA-1 (Figura 2C).
    NOTA: Para reprogramação epissómica, a detecção da expressão transgênica e do esqueleto do vetor EBNA1 durante as passagens iniciais deve ser realizada usando protocolos publicados7. A validação de rotina inclui cariótipo por bandas G (Figura 2D) ou ensaios de cobertura baseados em matriz de genoma inteiro. A pluripotência funcional básica também pode ser testada usando protocolos de diferenciação de teratoma (Figura 2E) ou scorecards quantitativos de expressão multigênica de diferenciações de corpos embrióides não direcionados14.
    1. Em um gabinete de biossegurança, a imunocoloração replica os poços para antígenos TRA-1-60 ou TRA-1-81 por 30 minutos, adicionando anticorpos vivos conjugados com fluorocromo ao meio E8 na concentração apropriada.
    2. Aspire o meio de cultura. Lavar duas vezes com meio E8 (2 ml por alvéolo).
    3. Fotomicrografia e enumerar em meio E8 ou meio sem vermelho de fenol.
      NOTA: Como alternativa, fixe as células usando solução de paraformaldeído / PBS a 2% por 10 minutos em temperatura ambiente e imunocore para antígenos TRA-1 usando anticorpos padrão.
  4. Validar o imunofenótipo XF-hiPSC por citometria de fluxo.
    1. Em um gabinete de biossegurança, aspire o meio de cultura.
    2. Lave as células em PBS (2 mL por poço). Aspirar PBS. Adicione reagente de dissociação enzimática (por exemplo, Accutase, 1mL por poço). Incubar a placa durante 5 min a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% CO2, atmosfera húmida).
    3. Coletar células adicionando um volume igual de meio de cultura e passar por um filtro de células (filtro de 40-70 μm). Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
    4. Ressuspenda o pellet celular em PBS com 5% de FBS (1 mL por equivalente de poço). Conte o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células. Distribua cerca de 100.000-200.000 células em tubos de fundo redondo por ensaio FACS (mantendo os volumes em cerca de 100 μL por ensaio).
    5. Para colorações extracelulares, após uma etapa de bloqueio opcional usando soro de camundongo puro (adicionar 5 μL por ensaio, 5 min à temperatura ambiente), incubar com anticorpos conjugados com fluorocromo (por exemplo, TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) de acordo com as instruções do fabricante. Lave com 3 mL de PBS. Centrifugue por 5 min a 300 x g. Ressuspenda no buffer FACS (por exemplo, PBS com 5% FBS) e adquira usando um instrumento FACS.
      NOTA: sempre use controles de isotipo apropriados e core amostras paralelas para validar a especificidade das proteínas imunodetectadas.
    6. Para colorações intracelulares (por exemplo, NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE), siga as instruções do fabricante para as etapas de fixação/permeabilização. Incubar com anticorpos conjugados com fluorocromo ou controles de isotipo correspondentes. Adquira usando um instrumento FACS.

4. Criopreservação e descongelamento de clones XF-hiPSC

  1. Expanda os clones XF-hiPSC por pelo menos 5-7 passagens para realizar a validação inicial (Figura 2) antes da criopreservação de longo prazo e aplicação em estudos funcionais. Registre o número de passagens em cada frasco criopreservado.
    1. Aspirar meio de cultura em uma cabine de biossegurança.
    2. Lave as células com PBS (2 mL por poço). Aspirar PBS.  Adicione a solução de descolamento celular à base de EDTA (1 mL por poço) para dissociar as colônias XF-hiPSC em aglomerados celulares. Incubar a placa durante 5 min numa incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmosfera húmida). Verifique se as células estão frouxamente presas (por exemplo, células redondas brilhantes) usando um microscópio.
    3. Aspire suavemente a solução de dissociação sem interromper as colônias de monocamada celular e colete as células em meio E8 de 1-2 mL com pipetagem não vigorosa para manter os aglomerados celulares (10-50 células por aglomerado). Colete XF-hiPSC em um tubo cônico estéril de 15 mL. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
    4. Aspirar o sobrenadante em uma cabine de biossegurança. Ressuspenda o pellet celular em solução de congelamento (Tabela 2, ~ 1 equivalente de poço por mL).
    5. Transfira as células para tubos criogênicos de armazenamento de longo prazo. Coloque os tubos em um recipiente de congelamento lento e deixe as amostras congelarem durante a noite em um freezer a -80 °C. No dia seguinte, coloque os criogenianos em um freezer de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
  2. Para descongelar, preparar uma placa pré-revestindo com vitronectina (ver secção 1.3.11).
    1. Coloque o frasco congelado em banho-maria a 37 °C e descongele as células por ~ 1-2 min. Esterilize (ou seja, spray de etanol).
    2. Transfira lentamente o XF-hiPSC para um tubo cônico estéril de 15 mL que contenha 9 mL de meio de descongelamento (Tabela 2) para diluir lentamente as células 10 vezes dentro de um gabinete de cobertura de segurança biológica estéril.
      NOTA: Não pipete vigorosamente.
    3. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
    4. Aspire o sobrenadante livre de células em um gabinete de biossegurança. Ressuspenda o pellet celular em meio E8 (1-2 mL) suplementado com inibidor de ROCK (concentração final 5 mM).
      Nota: A exclusão do Y-27632 resultará em baixas eficiências de recuperação pós-descongelamento.
    5. Transfira as células descongeladas para 1 ou 2 poços revestidos de vitronectina de uma placa de 6 poços. No dia seguinte, troque o meio por meio E8 regular sem inibidor de ROCK para expansão celular.

5. Diferenciação hematovascular xenolivre de XF-hiPSC

  1. Diferencie XF-hiPSC usando nosso protocolo otimizado de diferenciação hematovascular xenolivre (Figura 3)4.
    NOTA: Este protocolo é modificado a partir de15.
    1. Prepare XF-hiPSC em ~ 40-50% de confluência (1-3 dias após a passagem).
    2. Aspirar meio de cultura e adicionar 2 mL de meio de determinação mesodérmica (Tabela 2) em uma cabine de biossegurança.
    3. Após 2 dias, aspirar o meio e adicionar 2 mL/poço de meio de diferenciação vascular (Tabela 2) em um gabinete de biossegurança. Se muitas células mortas ou flutuantes forem visíveis nesta etapa, lave uma vez com 2 mL de PBS.
    4. Substitua o meio de diferenciação vascular em dias alternados em um gabinete de biossegurança até o dia 11.
      NOTA: Se o meio ficar amarelo devido à alta densidade celular e baixo pH, adicione 1 mL de meio fresco ou substitua todos os dias.
  2. Após 7 a 10 dias de cultura em meio de diferenciação vascular, purifique as células vasculares CD31+ ou CD34+ da monocamada aderente com um método de classificação de células de esferas magnéticas.
    NOTA: Cada clone individual pode exibir cinética distinta de diferenciação. Determine o ponto de tempo de pico para a expressão de CD31 / CD34 por análise FACS (Figura 4A). É necessária uma análise FACS de enriquecimento de esferas pré e pós-magnéticas. Os progenitores hematopoiéticos (HP) podem ser recuperados nesta fase do sobrenadante e enriquecidos com microesferas de CD34. O HP derivado de CD34 + XF-hiPSC pode ser validado usando o ensaio de metilcelulose ( Figura 4B-C ) 16 .
    1. Em um gabinete de biossegurança, aspire o meio de cultura e lave as células em PBS (2 mL por poço). Aspire PBS e dissocie colônias de hiPSC em células únicas adicionando reagente de dissociação enzimática (por exemplo, Accutase, 1 mL por poço). Incubar as células durante 5 min a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% CO2, atmosfera húmida).
    2. Em um gabinete de biossegurança, colete as células adicionando um volume igual de meio de cultura. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
    3. Ressuspender o pellet celular em meio de diferenciação vascular (Tabela 2). Conte o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células. Separe cerca de 50.000-100.000 células para o ensaio FACS de enriquecimento de esferas pré-magnéticas usando anticorpo anti-CD31 ou anti-CD34 diretamente conjugado.
    4. Centrifugue as células restantes a 300 x g por 5 min. Ressuspenda o pellet celular em tampão de enriquecimento de esferas magnéticas (PBS pH 7,2, albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 mM) em um gabinete de biossegurança.
    5. Passe as células por um filtro de células (filtro de 40-70 μm). Centrifugue a 300 x g por 5 min. Ressuspender em tampão de enriquecimento de esferas magnéticas de 60 μL.
    6. Adicione 20 μL de reagente bloqueador de FcR e, em seguida, adicione 20 μL de microesferas CD31 ou CD34 e incube por 15-20 min a 4 ° C.
    7. Lave as células com tampão de enriquecimento de esferas magnéticas de 2 mL em uma cabine de biossegurança e centrífuga (300 x g, 5 min).
    8. Ressuspenda o pellet celular em tampão de enriquecimento de esferas magnéticas de 1 mL em um gabinete de biossegurança.
    9. Coloque uma coluna LS no campo magnético de um separador de células magnéticas dentro do gabinete de biossegurança. Coluna de lavagem com tampão de enriquecimento de esferas magnéticas de 3 mL.
    10. Aplicar células à coluna.  Colete as células não marcadas em um tubo cônico de 15 mL. Lave a coluna 3 vezes com tampão de enriquecimento de esferas magnéticas de 3 mL.
    11. Remova a coluna do separador e coloque-a em um novo tubo cônico de 15 mL.
    12. Lave as células marcadas magneticamente adicionando 3-5 mL de meio de crescimento endotelial. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
    13. Ressuspenda em meio de crescimento endotelial de 1 mL em um gabinete de biossegurança. Conte o número de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células. Separe cerca de 50.000 células para a pureza do tipo de enriquecimento pós-magnético por meio da análise FACS usando anticorpo anti-CD31 ou anti-CD34 diretamente conjugado.
    14. A VP isolada pode ser expandida ainda mais em placas de frascos tratadas com cultura de tecidos revestidas com fibronectina (10 μg/mL) em meio de crescimento endotelial.

6. Diretrizes de desenho experimental para validação funcional de XF-hiPSC

  1. Estabelecer estoques de XF-hiPSC validados nas primeiras passagens usando um método não integrador estabelecido, como reprogramação episomal 7,17, vírus Sendai18 ou mRNA19.
    NOTA: Uma comparação da eficiência e confiabilidade dos métodos de não reprogramação é fornecida em outro lugar6. A depuração de material transgênico em métodos de reprogramação episómica ou do vírus de Sendai pode ser verificada durante as passagens iniciais usando métodos de PCR 7,20. A retenção de transgenes não é compatível com a geração TIRN-SC.
  2. Validar cariótipo normal em clones XF-hiPSC por bandagem G ou ensaios de cobertura baseados em matriz de genoma completo9.
  3. Validar a expressão gênica e a integridade epigenômica das linhas XF-hiPSC (ou seja, impressões parentais, ativação X) usando matrizes de metilação de DNA e expressão gênica ou métodos de sequenciamento 5,11,14.
  4. Valide a pluripotência funcional básica usando protocolos de diferenciação de teratoma (Figura 2E), ensaios quantitativos de diferenciação de corpo embrióide (EB) usando matrizes de RT-PCR14 ou ensaios de diferenciação direcionados para as 3 camadas germinativas9.
    NOTA: Métodos quantitativos para capacidade de diferenciação de múltiplas linhagens e índice proliferativo intra-linhagem de ensaios de teratoma usando caracterização histológica por microscopia são fornecidos em outro lugar4. Protocolos de diferenciação direcionada para linhagens mesodérmicas e especificação hematovascular (Figura 4A-C) foram previamente detalhados 4,5,9, bem como ensaio de diferenciação direcionada para endoderma definitiva (Figura 4D)5. Exemplos de ensaio de diferenciação direcionada para ectoderma são fornecidos em outro lugar 4,5.

7. Adaptação química TIRN de XF-hiPSC

  1. Compre ou prepare alimentadores internos de MEF de baixa passagem de embriões de camundongos híbridos E13.5 CF1 ou CF1 x DR4 seguindo os protocolos publicados 9,21. Placa 200.000 alimentadores de MEF por poço em uma placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos gelatinizada (0,1% em água, 1 mL por poço) pelo menos um dia antes da etapa de adaptação do TIRN (protocolos TIRN detalhados são fornecidos em outro lugar 4,5,9).
  2. Mantenha e expanda culturas XF-hiPSC livres de transgenes com cariótipos normais validados em um sistema de cultura livre de alimentador (por exemplo, meio E8, consulte a Tabela 1 para formulação interna).
  3. Substitua o meio E8 pelo meio LIF-5i (2 mL por poço; Tabela 1) após as culturas de XF-hiPSC atingirem ~50% de confluência (ou seja, 3-5 dias após o plaqueamento inicial) em um gabinete de biossegurança.
  4. No dia seguinte, aspire o meio de cultura e lave o XF-hiPSC adaptado ao LIF-5i uma vez com PBS (2 mL por poço) em um gabinete de biossegurança. Aspire o sobrenadante e adicione 1 mL de reagente de dissociação celular enzimática a cada poço. Incubar durante 5 min a 37 °C numa incubadora de CO2 .
  5. Triturar suavemente com uma pipeta em uma suspensão de célula única em um gabinete de biossegurança. Neutralize com meio LIF-5i (1mL por poço). Recolha a suspensão celular em um tubo cônico estéril de 15 mL.  Centrifugue a 200 x g por 5 min.
  6. Aspirar o sobrenadante em uma cabine de biossegurança. Ressuspenda o pellet celular em 2 mL de meio LIF-5i.
    NOTA: Se possível, pegue uma alíquota para contagem de células. É possível neutralizar a atividade enzimática com meio LIF-5i/LIF-3i sem suplementação com inibidores ou fatores de crescimento.
  7. Lave a placa de MEF duas vezes com PBS (2 mL por poço em placas de 6 poços) e adicione células (1 poço equivalente de células adaptadas ao LIF-5i em 1 poço de alimentadores de MEF em meio LIF-5i de 2 mL).
    NOTA: A otimização das densidades iniciais de revestimento para cada linha XF-hiPSC individual é opcional. Se as células foram contadas na etapa anterior, coloque um mínimo de 1x106 células por poço nos alimentadores.  Transfira a placa para uma incubadora de CO2 (37 °C, 5% de CO2, atmosfera úmida).
  8. Cultive e mantenha XF-hiPSC por 3-5 dias em LIF-5i em MEF em uma incubadora de CO2 (37 ° C, 5% CO2, atmosfera úmida). Troque o meio LIF-5i diariamente.
  9. Quando as colônias TIRN-SC em forma de cúpula são formadas (após 3-5 dias de cultivo em comedouros), aspire o meio de cultura em um gabinete de biossegurança. Lave cada poço com 2 mL de PBS.
  10. Aspirar PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células (por exemplo, Accutase) a cada poço. Incubar durante 5 min a 37 °C numa incubadora de CO2 (5% de CO2, atmosfera húmida).
  11. Adicione 1 mL de meio LIF-3i (Tabela 1) a cada poço em um gabinete de biossegurança para neutralizar o reagente de dissociação. Triture suavemente e colete as células em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
  12. Aspirar o sobrenadante em uma cabine de biossegurança. Ressuspenda em meio LIF-3i (1 mL por poço) para contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador automático de células. Placa ~ 5 x 105 células em meio LIF-3i de 2 mL por poço em MEF irradiado em placas gelatinizadas de 6 poços em um gabinete de biossegurança.
    NOTA: repita os passos 7.12 5o 7.16 para todas as passagens subsequentes.  Após a cultura inicial adaptada ao LIF-5i, culturas em placas de LIF-3i em uma densidade mais baixa (2x105 células/poço) e passagem a cada 3-4 dias.
  13. Passagem XF-hiPSC revertida por TIRN por pelo menos 6-7 passagens contínuas em meio LIF-3i antes do uso em estudos funcionais ou criopreservação. Registre o número de passagens em meio de cultura com primer xenolivre (por exemplo, E8) ou meio LIF-5i / LIF-3i TIRN.
    NOTA: A reversão TIRN de linhas XF-hiPSC de passagem alta (por exemplo, >p40) é ineficiente e não recomendada. As linhas de passagem alta geralmente abrigam defeitos cromossômicos ou subcromossômicos, que não são compatíveis com a reversão eficiente do TIRN e resultarão em eficiências de reversão ruins e estabilidade de cultura limitada. Além disso, o uso de culturas TIRN que tenham sofrido mais de 15 passagens em meio LIF-3i não é recomendado para estudos funcionais. O impacto funcional da reversão TIRN de XF-hiPSC é mais proeminente entre 7 e 15 passagens no meio LIF-3i.

8. Diretrizes de projeto experimental para diferenciação direcionada de TIRN-SC derivado de hiPSC XF / FF.

  1. Utilize diretamente o TIRN-SC derivado de hiPSC XF/FF em protocolos de diferenciação direcionada estabelecidos sem qualquer etapa de "re-priming" (ou seja, sem necessidade de voltar as células-tronco TIRN para condições convencionais "primed" antes de seu uso em ensaios de diferenciação direcionada).
  2. Para avaliação funcional do impacto do TIRN no XF-hiPSC, configure culturas isogênicas irmãs, com número de passagem equivalente em paralelo. Manter culturas XF-hiPSC isogênicas primed/TIRN em paralelo em seus respectivos meios (por exemplo, E8 em vitronectina vs. LIF-3i em MEF) e, simultaneamente, realizar ensaio de teratoma (Figura 5) ou diferenciar usando corpo embrióide idêntico ou protocolos e materiais de diferenciação direcionada (Figura 6).
  3. Realizar avaliação funcional de linhagens diferenciadas terminais, quando possível. Por exemplo, os progenitores vasculares podem ser avaliados pela expressão de proteínas, ensaio de captação de lipoproteína de baixa densidade acetilada conjugada com DiI (LDL) e ensaio de tubo de Matrigel (Figura 7).
    NOTA: Ensaios funcionais adicionais para VP derivados de CB-hiPSC e TIRN-SC (ou seja, ensaios de captação/senescência/proliferação/migração de DiI-Ac-LDL, ensaios in vitro em tubo de Matrigel, ensaio de plugase de Matrigel animal, ensaios de xenotransplante) são detalhados em outro lugar 3,4.
  4. Ajuste e otimize as densidades e cinéticas iniciais de plaqueamento (Figura 6) para cada clone XF-hiPSC individual em cada ensaio de diferenciação.
    NOTA: As culturas XF-hiPSC revertidas por TIRN têm uma capacidade proliferativa e de diferenciação mais robusta em ensaios de diferenciação direcionada do que as culturas XF-hiPSC com primer.

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Resultados

Este protocolo otimiza os métodos publicados para a reprogramação eficiente do progenitor mieloide para um estado pluripotente de alta fidelidade usando vetores epissómicos e sinais estromais7. O protocolo (Figura 1) descreve métodos definidos para reprogramação episómica XF/FF primed pelo estroma de progenitores CB CD34+ humanos em XF-hiPSC e instrui como validar sua funcionalidade por meio de especificação hematovascular direcionada, seguida pela...

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Discussão

O grupo Zambidis relatou originalmente um método episódico de quatro fatores altamente otimizado para reprogramar progenitores mieloides CB comprometidos com a linhagem em CB-hiPSC com eficiências em massa atingindo até 50% em células purificadas que expressam epissoma7. Aqui, apresentamos uma versão modificada do protocolo original de reprogramação epissomal do progenitor CB humano em condições de estroma XF / FF. Este método empregou a capacidade de reprogramaçã...

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Divulgações

Nenhuma divulgação a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações do NIH / NEI (R01EY032113; ETZ), o Fundo de Pesquisa de Células-Tronco de Maryland (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) e a Fundação Lisa Dean Moseley (ETZ).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaAAB-1001
anticorpo anti-CD143 (BB9), conjugado com APC BD Biociências557929use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD144, PE conjugado BD Biociências560410use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD146, PE conjugado BD Biociências550315use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD184/CXCR4, conjugado com APC BD Biociências555976use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD31BD Biociências550389diluir 1:100 em solução de bloqueio para ensaio de imunofluorescência
anticorpo anti-CD31, conjugado com APC eBiociência17-0319-42use 2 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD34, conjugado com APC BD Biociências555824use 5 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-CD45, PE conjugado BD Biociências555483use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-NANOG, PE conjugadoBD Biociências560483use 10-20 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-OCT4, PE conjugadoR& D SistemasIC1759Puse 10 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-SOX17, conjugado com Alexa488BD Biociências562205use 5 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-SOX2, PE conjugadoR& D SistemasIC2018Puse 10 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-SSEA-4, conjugado com APC R& D SistemaFAB1435Ause 5 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-SSEA-4 GloLIVE, conjugado NL493R& D SistemaNLLC1435GUtilização a uma diluição de 1:50 (imunocolorações vivas e fixas)
kit conjugado anti-TRA-1-60 A488ThermoFisher ScientificA25618
anticorpo anti-TRA1-60, PE conjugadoBD Biociências560193use 10 µ L por ensaio (FACS)
anticorpo anti-TRA-1-60 GloLIVE, conjugado NL557 R& D SistemasNLLC4770RUse at  uma diluição de 1:50 (imunocolorações vivas e fixas)
anti-TRA-1-60 StainAlive Anticorpo, conjugado DyLight 488Stemgent09-0068Utilizar numa diluição de 1:100 (imunocolorações vivas e fixas)
anticorpo anti-TRA1-81, PE conjugadoBD Biociências560161use 10 µ L por ensaio (FACS)
anti-TRA-1-81 StainAlive Anticorpo, DyLight 488 conjugadoStemgent09-0069Utilizar numa diluição de 1:100 (imunocolorações vivas e fixas)
Kit CD31 MicroBead, humanoMiltenyi Biotec130-091-935
Kit CD34 MicroBead, humanoMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Doadores Mistos,  Sangue do cordão umbilical, 1 milhão de célulasTodas as célulasCB, CR, CD34+, Misto, PS, CS10, 1Mfontes alternativas de células incluem fígado fetal, medula óssea adulta e sangue periférico mobilizado
Mouse CF1Rio Charles023
CHIR99021R& D SistemaL5283reconstituir a 100 mM em DMSO
Placas de 6 poços tratadas com cultura de tecidos Corning CostarCorning3506
Substrato Corning Synthemax II-SC, frasco de 10 mgCorning3535use em 5 μ g/cm2 como substituto do Corning 3978
Placa de 6 poços Corning Synthemax-RCorning3978descontinuado e substituído para 3535
Placa de 6 poços Costar Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment 6-wellCorning3471
Condessa  corrediça da câmara de contagem de célulasThermo Fisher CientíficoC10228
Contador de células automatizado CountessThermo Fisher CientíficoAMQAX1000
CryoStore CS10Tecnologias de células-tronco100-1061
DII-Ac-LDLThermo Fisher CientíficoL3484use em 5-15 µ g/mL
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Científico11995065
DMEM/F-12 , suplemento GlutaMAXThermo Fisher Científico10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Científico11330032
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma AldrichD2650
Mouse DR4O Laboratório Jackson3208
Essencial 8 (E8) médioTecnologias de células-tronco5940
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher CientíficoSH30071.03
CORRIGIR & Kit de permeabilização de células PERMThermo Fisher CientíficoGÁS004
ForscolinaStemgent04-0025reconstituir a 100 mM em DMSO
Gelatina (suína)Sigma AldrichG1890-100Gressuspender em água e esterilizar com autoclave
nucleofector de células CD34+ humanas kitLonzaVPA-1003
Isotipo camundongo IgG1 PE conjugadoBD Biociências554680
Isotipo camundongo IgG2a PE conjugadoBD Biociências558595
Isotipo rato IgG2b PE conjugadoR& D SistemasIC013P
Reposição de soro KnockOutThermo Fisher Científico10828-028
Ácido L-ascórbicoMillipore SigmaRolamento A8960
L-Glutamina (100X)Thermo Fisher Científico25030-081
Colunas LSMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237use 200 µ L/poço em placas de 48 poços
MEM Aminoácido não essencial (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Científico11140-050
MethoCult SF H4436Tecnologias de células-tronco04436
Separador MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 médioTecnologias de células-tronco85850
Frascos criogênicos NalgeneThermo Fisher Científico5000-0020
Solução de paraformaldeído, 4% em PBSThermo Fisher CientíficoJ19943. K2diluir até a concentração necessária usando PBS
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstituir a 100 mM em DMSO
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Científico15140-122
epissomo de pEP4 E02S EM2KAddgene20923Os plasmídeos foram propagados em TOP10 E.  coli (Invitrogen) e purificado com kits Maxi de plasmídeo QIAGEN. 
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Indústrias Biológicas02-023-1A
Células-tronco mesenquimais humanas poiéticasLonzaPT-2501750.000 células na passagem 2 podem ser descongeladas e expandidas de acordo com as instruções do fabricante para 1-2 passagens antes do uso ou banco secundário
PurmorlaminaStemgent04-0009reconstituir a 10 mM em DMSO
Activina A recombinantePeprotech120-14Eressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
FGF2 humano recombinantePeprotech100-18Bressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
FGF-básico humano recombinante (bFGF)Peprotech100-18Bresupend em 100 µ g/mL em soro bovino/albumina humana a 0,1% em PBS
ligante FLT3 humano recombinanteR& D Sistemas308-FKHB ou  308E-GMPressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
insulina humana recombinanteBiogemas10-365
ligante Kit humano recombinanteR& D SistemasBT-SCF ou BT-SCF-GMPressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
LIF humano recombinantePeprotech300-05resupend em 100 µ g/mL em albumina sérica bovina/humana a 0,1% em PBS
TGF e beta humano recombinante; 1Peprotech  100-21resupend em 100 µ g/mL em albumina sérica bovina/humana a 0,1% em PBS
trombopoetina humana recombinante R& D Sistemas288-TPN ou 288E-GMPressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
transferrina humana recombinanteMillipore SigmaT3705
BMP4 humano recominantPeprotech120-05ressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
SB431543SelleckchemS1067reconstituir a 10 mM em DMSO
SIGMAFAST, substrato de fosfatase alcalina, cromogénico, comprimidoMillipore SigmaB5655dissolver 1 comprimido em 10 mL de água purificada
Selenito de sódioMillipore SigmaS5261
Stemolecule Y27632 em soluçãoStemgent04-0012-02Inibidor de ROCK em solução (10 mM)
Reagente de dissociação celular StemPro AccutaseThermo Fisher CientíficoA11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher CientíficoA1067501Prepare o meio XF-MSC misturando 5mL de suplemento StemPro MSC SFM XenoFree com 500 mL de meio basal StemPro MSC SFM. O meio alíquota pode ser criopreservado a -20 ° C.
StemSpan SFEMTecnologias de células-tronco9600
Thermo Scientific Mr. Recipiente de Congelamento GeladoThermo Fisher Científico5100-0001
Ulex europaeus aglutina I (UEA-1), biotiniadaLaboratórios de vetoresB-1065-2diluir 1:200 em solução de bloqueio para ensaio fluorescente
VEGFPeprotech100-20ressuspender em  (100 µ g/mL) em PBS estéril, 0,1% de albumina de soro humano ou bovino
Solução de VerseneThermo Fisher Científico15040066
Matriz de vitronectina XFTecnologias de células-tronco7180diluir a 40 µ L/mL no tampão de diluição CellAdhere
XAV939Sigma AldrichX3004reconstituir a 100 mM em DMSO
β-mercaptoetanolThermo Fisher Científico21985-023sensível à luz

Referências

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

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