É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Depleção do nervo sensorial da córnea direcionada por injeção subconjuntival: um modelo para investigar a adesão bacteriana e as interações neuroimunes

446 vistas

⸱

DOI:

10.3791/68614

⸱

29 de agosto de 2025

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

Neste artigo

Resumo

Este estudo estabelece um modelo refinado para a depleção do nervo sensorial da córnea usando bupivacaína, revelando seu impacto no nervo corneano e na adesão bacteriana. O modelo simula condições neuropáticas, fornecendo informações sobre interações neuroimunes em infecções oculares e oferecendo aplicações em estudos de administração de medicamentos, neuroproteção, modulação imunológica e modificação genética.

Resumo

Os nervos sensoriais da córnea desempenham um papel fundamental no apoio à integridade da superfície ocular e aos mecanismos de defesa imunológica. A perda dessa inervação tem sido associada ao aumento da vulnerabilidade à invasão microbiana, mas a contribuição precisa da depleção do nervo para a adesão bacteriana na córnea permanece insuficientemente caracterizada. Aqui, apresentamos um método reprodutível e controlado temporalmente para supressão seletiva do nervo sensitivo da córnea usando bupivacaína, um bloqueador dos canais de sódio de ação prolongada. Ao combinar as vias de administração subconjuntival e tópica, essa estratégia de aplicação dupla alcança uma desnervação robusta e sustentada, permitindo uma investigação precisa de como a entrada sensorial alterada influencia a suscetibilidade epitelial da córnea à colonização bacteriana.

Usando este modelo, investigamos como a denervação sensorial influencia a dinâmica de adesão microbiana para Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Pseudomonas aeruginosa, três patógenos clinicamente relevantes com mecanismos de adesão distintos. A inoculação bacteriana padronizada por meio do método de limpeza de laboratório garante uma deposição uniforme na superfície da córnea, seguida de avaliação quantitativa da adesão bacteriana. A depleção nervosa induzida pela bupivacaína se correlaciona com a redução da densidade nervosa da córnea e o aumento da adesão bacteriana, confirmando uma ligação funcional entre a depleção sensorial e a suscetibilidade microbiana.

Ao simular condições neuropáticas, como neuropatia diabética e ceratite neurotrófica, essa abordagem fornece uma nova estrutura para estudar as interações neuroimunes em infecções oculares. Além dos modelos de infecção, essa estratégia de injeção subconjuntival oferece uma plataforma versátil para investigar a farmacocinética de drogas oculares, intervenções neuroprotetoras e modulação imunológica. Além disso, pode ser adaptado para estudos de modificação gênica, incluindo entrega subconjuntival de construções CRISPR/Cas ou vetores virais, ampliando suas aplicações em pesquisa e terapêutica oftalmológica.

Introdução

A inervação sensorial da córnea desempenha um papel crítico na manutenção da integridade da superfície ocular e da homeostase imunológica. A córnea é um dos tecidos mais densamente inervados do corpo, predominantemente suprido pela divisão oftálmica do nervo trigêmeo1. Esses nervos sensoriais não apenas medeiam a nocicepção e os reflexos de piscar, mas também regulam a proliferação epitelial, a cicatrização de feridas e a vigilância imunológica 2,3. Qualquer interrupção na inervação sensorial pode, portanto, comprometer a barreira da córnea, alterando o microambiente da superfície ocular e aumentando a suscetibilidade a infecções microbianas.

A disfunção sensorial da córnea está associada a condições sistêmicas, como diabetes mellitus, e contribui para patologias oculares, incluindo doença do olho seco, ceratopatia diabética, ceratite neurotrófica e complicações pós-cirúrgicas 3,4,5,6,7,8,9,10 . O comprometimento do nervo sensorial leva à redução da produção de lágrimas, afinamento epitelial e retardo na cicatrização de feridas, o que facilita a colonização bacteriana11,12. No entanto, a ligação mecanicista precisa entre a depleção do nervo sensorial e a adesão bacteriana permanece inadequadamente compreendida. Embora os estudos tenham demonstrado aumento da adesão bacteriana após a denervação da córnea, faltam modelos padronizados que permitam a investigação controlada dessa relação.

Para resolver essa lacuna, desenvolvemos um modelo direcionado de depleção do nervo sensorial da córnea usando bupivacaína, um bloqueador dos canais de sódio de ação prolongada que imita a neuropatia clínica sem causar danos permanentes aos nervos 13,14,15. Essa abordagem farmacológica fornece um método controlado e reprodutível para estudar a depleção do nervo corneano e seus efeitos na superfície ocular15. Ao integrar este modelo com ensaios de adesão bacteriana, podemos avaliar sistematicamente o impacto da depleção sensorial do nervo na colonização microbiana, mimetizando os principais aspectos da ceratopatia diabética e da ceratite neurotrófica.

A adesão microbiana é um evento precoce crítico nas infecções da córnea, influenciado pela composição do filme lacrimal, propriedades da superfície epitelial e respostas imunes do hospedeiro. Dentre os diversos patógenos capazes de colonizar a superfície ocular, S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa representam três bactérias clinicamente significativas com mecanismos de adesão distintos. P. aeruginosa, uma bactéria Gram-negativa altamente virulenta, utiliza pili, flagelos e fatores de virulência secretados para aderir e invadir rapidamente as células epiteliais da córnea, muitas vezes levando a ceratite ulcerativa grave16,17. Em contraste, S. epidermidis, uma bactéria comensal Gram-positiva, explora predominantemente superfícies epiteliais interrompidas e alterações no filme lacrimal para estabelecer biofilmes, contribuindo para infecções persistentes e muitas vezes subclínicas18,19. As diferenças nas estratégias de adesão entre essas espécies destacam a necessidade de entender como a depleção do nervo corneano altera o microambiente ocular para favorecer a colonização bacteriana.

Um dos principais desafios no estudo da adesão bacteriana é a escolha de um modelo de inoculação apropriado. O modelo convencional de lesão por arranhão, frequentemente utilizado em estudos de infecção, cria defeitos epiteliais para facilitar a adesão bacteriana. Embora eficaz na simulação de infecções induzidas por trauma, essa abordagem introduz variáveis de confusão significativas, incluindo dano tecidual excessivo e uma resposta inflamatória exagerada, que não representam com precisão os estágios iniciais da colonização bacteriana em córneas neuropáticas. Além disso, a variabilidade na lesão mecânica dificulta a obtenção de resultados reprodutíveis. Para superar essas limitações, é necessário um método de inoculação bacteriana mais controlado e fisiologicamente relevante.

A técnica de wipe blotting de laboratório oferece uma abordagem padronizada para a deposição bacteriana, garantindo uma aderência bacteriana uniforme sem romper a barreira epitelial20. Este método imita de perto os cenários de suscetibilidade do mundo real, onde a adesão bacteriana ocorre na ausência de trauma mecânico evidente, mas sob condições de composição lacrimal alterada e homeostase epitelial. Ao eliminar a variabilidade associada à lesão mecânica, o método de limpeza laboratorial fornece uma avaliação mais precisa da dinâmica da adesão microbiana em córneas neuropáticas. Além disso, permite a avaliação controlada das contribuições do filme lacrimal para a colonização bacteriana, o que é particularmente relevante em casos de disfunção sensorial da córnea, onde a secreção lacrimal é prejudicada.

Dado o papel crítico dos nervos sensoriais da córnea na regulação da produção de lágrimas e da homeostase epitelial, é essencial estabelecer um modelo reprodutível para estudar as consequências da depleção do nervo sensorial na adesão microbiana. Este estudo tem como objetivo refinar um protocolo para depleção direcionada do nervo sensorial da córnea usando bupivacaína, um anestésico local de ação prolongada, para avaliar seus efeitos na secreção lacrimal e na adesão bacteriana. Ao empregar uma combinação de aplicação subconjuntival e tópica de bupivacaína, essa abordagem garante a depleção sensorial localizada e sustentada em um ponto de tempo definido de eficácia máxima. Usando este modelo, investigamos como a denervação sensorial altera a dinâmica de adesão de S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa, fornecendo informações valiosas sobre a relação entre depleção nervosa, alterações do filme lacrimal e suscetibilidade microbiana. Essas descobertas têm implicações mais amplas para a compreensão da suscetibilidade à infecção em condições neuropáticas, como ceratopatia diabética e ceratite neurotrófica, e oferecem uma base para estudos futuros sobre interações neuroimunes oculares e intervenções terapêuticas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os padrões estabelecidos pela Association for Research in Vision and Ophthalmology e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do New England College of Optometry e aderiram à política do PHS sobre o cuidado humano e uso de animais de laboratório. Camundongos C57BL / 6J machos e fêmeas de seis a oito semanas de idade (tipo selvagem; cepa nº 000664) foram obtidos do Laboratório Jackson, e os camundongos foram criados sob ritmos circadianos normais (um ciclo claro / escuro de 12 horas) e receberam comida e água. Mantenha a técnica estéril durante todos os procedimentos.

1. Preparação animal para injeção subconjuntival

  1. Induza a anestesia usando 2-3% de isoflurano em oxigênio por meio de um vaporizador calibrado. Monitore a profundidade da anestesia verificando a ausência de resposta reflexiva a um leve beliscão do dedo do pé.
  2. Observe continuamente o animal em busca de sinais de desconforto ou angústia grave.
  3. Se for observado sofrimento, induza anestesia profunda com isoflurano a 5% e confirme a falta de resposta.
  4. Realize a luxação cervical para garantir a eutanásia.
  5. Caso contrário, execute imediatamente a enucleação usando uma pinça de enucleação curva para análises a jusante.

2. Bloqueio do nervo corneano usando injeção subconjuntival

NOTA: Implemente um protocolo de duas etapas envolvendo injeção subconjuntival e aplicação tópica de bupivacaína para alcançar a depleção do nervo sensorial da córnea direcionada. Injeções subconjuntivais completas e aplicações tópicas em 15 minutos para minimizar a exposição sistêmica ao anestésico.

  1. Preparação e incisão do local
    1. Faça uma pequena incisão (~0,5 mm) na região límbica superotemporal usando uma agulha de 30 G. Evite vasos sanguíneos e minimize o trauma tecidual. Use a incisão para acessar o espaço subconjuntival para administração controlada de medicamentos.
  2. Injeção de bupivacaína
    1. Prepare uma solução de cloridrato de bupivacaína a 0,5% em condições estéreis.
    2. Carregue 5 μL da solução em uma seringa Hamilton de 10 μL equipada com uma agulha romba de cubo pequeno de 33 G (ponto 3).
    3. Injete a solução no espaço subconjuntival em um ângulo de 15-20° para minimizar o refluxo e garantir uma distribuição uniforme.
    4. Observe a formação de bolhas no local da injeção; Deixe-o persistir por 5-10 s e se dispersar dentro da bolsa subconjuntival até que seja totalmente absorvido.
  3. Reforço tópico da dessensibilização da córnea
    1. Aplique 5 μL adicionais de bupivacaína a 0,5% diretamente na córnea central imediatamente após a injeção subconjuntival.
      NOTA: Use esta etapa para aumentar a dessensibilização do nervo da superfície e prolongar o efeito anestésico local.
  4. Grupo controle
    1. Administre 5 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) por meio de injeção subconjuntival e aplicação tópica em pontos de tempo idênticos para animais de controle. Combine as etapas processuais e o volume para levar em conta os efeitos relacionados à injeção.
  5. Duração do tratamento e análise do ponto final
    1. Administre o tratamento com bupivacaína em dias alternados por 15 dias para obter depleção sustentada do nervo sensorial, minimizando a toxicidade.
    2. No dia 15, eutanasiar camundongos 4 h após o tratamento final com bupivacaína usando isoflurano a 5% em oxigênio por meio de um vaporizador calibrado, seguido de luxação cervical.
    3. Colete imediatamente córneas de um grupo de camundongos (consulte a etapa 5.5.) para avaliar as alterações da densidade nervosa usando imuno-histoquímica (consulte a Figura 1 e a Seção 6 do protocolo) e de outro grupo para análise de adesão bacteriana (consulte a Figura 1 e a Seção 5 do protocolo).

3. Preparação animal para inoculação bacteriana

  1. Administre cetamina intraperitoneal (80-100 mg / kg) e dexmedetomidina (0,25-0,5 mg / kg) para anestesiar camundongos quatro horas após a injeção final de bupivacaína e aplicação tópica no dia 15.
  2. Confirme a anestesia profunda verificando a ausência de respostas reflexivas ao pinçamento do dedo do pé.
  3. Enxágue a superfície ocular 3x usando uma pipeta com 5 μL de PBS estéril para remover o fluido lacrimal residual e detritos, garantindo uma superfície córnea limpa para estudos de adesão bacteriana (ver Figura 1)
  4. No grupo experimental designado, use um tecido sem fiapos de limpeza de laboratório para secar a superfície da córnea de maneira padronizada.
    1. Dobre o lenço de papel para garantir uma aderência segura.
    2. Limpe suavemente a córnea do camundongo anestesiado 4x, começando na córnea central e usando um movimento rotacional para a direita e para a esquerda para incluir as regiões periféricas20.
      NOTA: Aplique pressão mínima para evitar lesões mecânicas enquanto remove efetivamente o fluido lacrimal para facilitar a adesão bacteriana.

4. Preparação do inóculo bacteriano e inoculação da córnea

  1. Cultura e preparação bacteriana
    1. Cultive S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 e P. aeruginosa O1 em ágar tríptico de soja (TSA) e incube a 37 ° C com água estéril colocada na incubadora para manter a umidade.
    2. Colha colônias individuais e suspenda em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Centrifugue a suspensão a 5.000 × g por 5 min uma vez para remover células mortas e subprodutos metabólicos.
    3. Ressuspenda o pellet bacteriano em PBS e ajuste a concentração para ~ 10 ¹ ¹ UFC / mL para garantir uma alta carga bacteriana para estudos de adesão.
  2. Protocolo de inoculação da córnea
    1. Aplique uma alíquota de 5 μL da suspensão bacteriana preparada na superfície da córnea uma vez a cada hora durante 4 h sob anestesia sustentada.
    2. Posicione os camundongos em uma ligeira inclinação para evitar o escoamento e garantir uma exposição consistente ao inóculo.
    3. Repita a inoculação em intervalos de uma hora para imitar a exposição bacteriana persistente relevante para cenários clínicos de infecção.
  3. Eutanásia pós-inoculação e avaliação da adesão bacteriana
    1. Após 4 h, administre uma injeção intraperitoneal de cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (5-10 mg / kg) para garantir uma anestesia profunda.
    2. Realize a luxação cervical para sacrificar os camundongos humanamente.
    3. Enuclear os olhos usando pinças estéreis de ponta curva, mantendo condições assépticas estritas para evitar contaminação.
    4. Enxágue a superfície ocular 5-6x com 2 mL estéreis de PBS em uma placa de Petri agitando suavemente para remover completamente as bactérias não aderentes.
    5. Homogeneizar os olhos enucleados em 1 mL de PBS estéril usando um homogeneizador mecânico de tecidos para garantir uma recuperação bacteriana consistente e manter condições assépticas para evitar contaminação.
    6. Efectuar diluições sêxtuplas em série do homogenato em PBS estéril.
    7. Alíquotas de cada diluição em placas TSA e incubar durante a noite a 37 °C para permitir o crescimento das colónias.
    8. Conte as unidades formadoras de colônias (UFCs) e expresse os resultados como log UFC por córnea para comparação quantitativa.

5. Imuno-histoquímica

  1. Eutanasiar camundongos por luxação cervical no dia 15 após o tratamento.
  2. Enuclee cuidadosamente os olhos e enxágue uma vez com PBS em temperatura ambiente sob rotação suave.
  3. Fixe os olhos enucleados em paraformaldeído a 2% (PFA) por 1 h para preservar a integridade estrutural
  4. Lave os olhos fixos 3 x 10 min em 1 mL de PBS sob rotação suave à temperatura ambiente.
  5. Siga o protocolo de dissecção da córnea descrito anteriormente21,22
    1. Dissecar as córneas dentro de uma placa de Petri de 35 mm de largura preenchida com uma quantidade mínima de PBS.
    2. Use uma pinça de borda reta para estabilizar o olho enucleado e uma tesoura cirúrgica para criar uma pequena incisão na face posterior do globo.
    3. Use o pequeno ponto de incisão para cortar cuidadosamente ao longo do aspecto posterior 360°.
    4. Descarte a retina murina, o nervo óptico, o cristalino, o pigmento da íris e quaisquer estruturas de tecido adicionais que não sejam a córnea.
    5. Remova qualquer excesso de tecido usando uma pinça de borda reta ou incisando cuidadosamente com uma tesoura cirúrgica, mantendo a córnea intacta.
    6. Lave as córneas dissecadas 3 x 10 min em 1 mL de PBS colocado em tubos de microcentrífuga sob rotação suave à temperatura ambiente.
  6. Incube as córneas em 1 mL de solução de bloqueio (3% BSA + Triton X-100 em PBS) por 1 h em temperatura ambiente com rotação contínua.
  7. Aumente a permeabilização do tecido incubando córneas em 1 mL de EDTA a 20% por mais uma hora nas mesmas condições.
  8. Incubar as córneas durante a noite a 4 °C com anticorpo primário anti-β-Tubulina III de coelho sob rotação suave à temperatura ambiente.
  9. No dia seguinte, incube os tecidos com anticorpo secundário IgG de cabra conjugado com Alexa Fluor 488 e DAPI para coloração nuclear por 2-3 h a 4 ° C no escuro.
  10. Lave as córneas 3 x 10 min com PBS sob rotação suave.
  11. Siga o protocolo de montagem plana da córnea descrito anteriormente21,22
    1. Monte as córneas manchadas em lâminas de vidro, colocando a córnea na borda da lâmina para remover o excesso de fluido.
    2. Reposicione a córnea no centro da lâmina do microscópio com o lado epitelial voltado para baixo, em contato com a superfície da lâmina.
    3. Faça quatro incisões retas (1-2 mm de comprimento) da borda periférica em direção ao centro usando uma lâmina de penas cirúrgica para criar semi-quadrantes.
    4. Aplique 20 μL de mountant e coloque uma lamínula de vidro de 8 mm sobre a córnea.
    5. Pressione suavemente a lamínula para remover quaisquer bolhas de ar e evitar o enrugamento da córnea.
    6. Armazene a amostra em temperatura ambiente no escuro para secar.
    7. Sele as bordas da lamínula com protetor de unhas transparente para evitar a secagem ao ar e guarde as lâminas no escuro até que estejam prontas para a imagem.

6. Exames de imagem

  1. Realize a microscopia confocal usando um microscópio confocal vertical de dois fótons com uma objetiva de imersão em água de 20x/1,00 NA.
  2. Coloque as amostras de montagem plana no microscópio stage e configure a lente objetiva de imersão em água 20x/1.00 NA.
  3. Diminua as luzes da sala e cubra o microscópio com um pano preto opaco para minimizar a interferência da luz externa durante a imagem.
  4. Visualize os nervos da córnea usando o canal de laser Alexa Fluor 488 nm e detecte núcleos celulares usando o canal de laser DAPI 405 nm.
  5. Defina o tamanho do quadro para 1.536 x 1.536, o orifício para 1 unidade Airy (AU) e a velocidade de digitalização para 1,02 μs. Ative a varredura bidirecional e aplique a média de 2x.
  6. Ajuste o ganho mestre (~750 V) e minimize a intensidade da potência do laser para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade, garantindo uma captura de imagem nítida.
  7. Realize imagens Z-stack para capturar a espessura total da córnea. Defina o primeiro plano focal no aspecto mais anterior e o último no aspecto mais posterior da amostra.
  8. Adquira pilhas Z em intervalos de passo de 0,8 μm ou 1,0 μm, capturando aproximadamente 60 a 80 pilhas totais por amostra.
  9. Avaliação da densidade do nervo corneano
    1. Analise a densidade do nervo corneano usando o software Imaris.
    2. Confirme a espessura total da imagem verificando as dimensões do volume.
    3. Ative a opção de renderização de volume para gerar uma reconstrução 3D.
    4. Crie uma projeção de intensidade máxima para converter a pilha Z em uma visualização 2D para visualização e quantificação.
    5. Classifique a densidade do nervo corneano em uma escala de 0 a 10 por avaliadores cegos para garantir uma avaliação objetiva.

7. Análise estatística

  1. Avalie a distribuição dos dados usando os testes de Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov.
  2. Se a maioria dos dados seguir uma distribuição normal, apresente os resultados como a média ± desvio padrão (DP).
  3. Para comparações entre dois grupos, aplicar o teste t de Student e usar ANOVA de uma via seguida do teste de comparações múltiplas de Tukey para análises envolvendo três ou mais grupos.
  4. Considere um valor de p < 0,05 estatisticamente significativo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A menos que especificado de outra forma, todos os experimentos foram realizados independentemente em triplicata, com cada réplica incluindo 3-4 camundongos por grupo.

Redução significativa da densidade nervosa da córnea após o tratamento com bupivacaína
Para avaliar sistematicamente o impacto da depleção do nervo sensorial da córnea direcionada, a densidade do nervo da córnea foi avaliada usando imunomarcação e microscopia confocal. Os camundongos receberam injeções subconj...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Os nervos sensoriais da córnea desempenham um papel fundamental na manutenção da integridade da superfície ocular, regulando a homeostase epitelial e modulando as respostas imunes. A neurite da córnea, caracterizada por degeneração e inflamação do nervo, é comumente observada em condições sistêmicas, como diabetes mellitus, onde a hiperglicemia crônica contribui para a neuropatia periférica, incluindo a perda do nervo da córnea. Estudos demonstraram que a neuropatia diabética leva à redu...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de cloridrato de bupivacaína a 0,5% Pfizer INC. EUANDC 00409-1162-01
Agulha de 30 GFabricante: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA305106
Agulha sem corte de cubo pequeno de 33 G (estilo de ponta 3) Hamilton Company, Reno, NV, EUA7803-05
4',6-Diamidino-2-fenilindo, dicloridratoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAD1306
Albumina de soro bovinoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUARolamento A7906
Camundongos C57BL/6J (tipo selvagem) Laboratório Jackson. 000664
Rotador de cantrífugoThe Lab Depot, Inc. (Dawsonville, GA, EUA)R2020
Protetor de unhas transparenteMolhado e selvagemN/A
Microscópio de dissecação (SMZ-160-TLED Microscópio estéreo (dissecação) com porta trinocular)Stellar Scientific (Baltimore, MD, EUA)1.1002E+12
Ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAE6511
IgG anti-coelho para cabras Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAA-11008
Hamilton 10-μ L seringaHamilton Company, Reno, NV, EUA7635-01
Micro tesouras de dissecação de alta precisãoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA08-953-1B
IsofluranoPatterson Veterinary, EUA07-890-8115
Vaporizador de isofluranoKent Scientific, EUAVETFLO1205S
Cloridrato de cetaminaDechra Produtos Veterinários, Overland Park, KS, EUADP00050
Papel de seda sem fiapos KimwipeKimberly-Clark Professional, Roswell, Geórgia, EUA34155
Pinça de microdissecação frontal curva (para enucleação)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUAF4142-1EA
Pinça de microdissecação frontal retaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUARolamento F4017
Placas de Petri (100 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA263991
Placas de Petri (35 mm)Avantor, via VWR International (Radnor, PA, EUA).25373-041
Solução salina tamponada com fosfato Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUAC987D24
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUAPág. 36930
Coelho anti-β-Tubulina IIISigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) T2200
Lamínula Redonda Vidro Alemão (8 mm)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA50-949-314
Cabos de bisturiSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) S2896-1EA
Lâminas para microscópioSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) S8902-1PAK
Tubos de microcentrífuga de baixa retenção Snap CapThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA3453
Sorvall Instruments RT6000B Centrífuga de BancadaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA3367898
Lâminas de penas cirúrgicasInstrumentos de precisão mundiais (Sarasota, FL, EUA)504169 
Ágar soja trípticaSigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) 22091
Xilazina Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA1236-20-8

Referências

  1. Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
  2. Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
  3. Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
  4. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  5. Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
  6. Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
  7. Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
  8. Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
  9. Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
  10. Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
  11. Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
  12. Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
  13. Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
  14. Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
  15. Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
  16. Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
  17. Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
  18. Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
  19. Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
  20. Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
  21. Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
  22. Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
  23. Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
  24. Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
  25. Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
  26. Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
  27. O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  28. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
  29. Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
  30. Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
  31. Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
  32. Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Integridade da Superf cie OcularDenerva o SensorialInje o de Bupivaca naSuscetibilidade MicrobialModelo de Infec o OcularCeratite Neurotr fica
Vídeo em breve
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.