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Artigo de método

Modelo de Resseção Tumoral Translacional Relevante para Modelos Pré-clínicos de Múrino de Carcinoma Escamoso Oral

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DOI:

10.3791/68621

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3 de abril de 2026

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1Katz Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The University of Texas Health Science Center at Houston, School of Dentistry, 2Department of Head and Neck Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Bioengineering, Rice University

Neste artigo

Resumo

Um método único para ressecar cirurgicamente tumores de carcinoma escamoso oral estabelecidos na cavidade oral é apresentado aqui.

Resumo

Atualmente, o tratamento de primeira linha para a forma mais comum de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (HNSCC), o carcinoma escamoso da cavidade oral (OSCC), é a resseção cirúrgica, seguida por tratamentos adaptados ao risco, como quimiorradioterapia. No entanto, com o padrão atual de cuidado e até mesmo o surgimento de novos tratamentos, como o bloqueio por checkpoint, a sobrevivência geral para doenças avançadas e recorrentes permanece alta, e a prevalência de câncer de cabeça e pescoço deve continuar aumentando nos próximos anos. Assim, é necessária uma investigação mais aprofundada sobre as modalidades atuais de padrão de cuidado, além de novas terapêuticas, para traduzir opções de tratamento potenciais e promissoras para pacientes com HNSCC. Modelos pré-clínicos são utilizados para avaliar a segurança e eficácia das intervenções de tratamento potenciais. Infelizmente, os modelos pré-clínicos atuais não conseguem incorporar totalmente o procedimento cirúrgico que muitos pacientes recebem, pois envolvem principalmente modalidades de tratamento não cirúrgicas, como radioterapia, quimioterapia ou imunoterapia. Além disso, os modelos cirúrgicos existentes são limitados por reagentes adicionais necessários para apoiar o estabelecimento de tumores em locais ortotópicos e a necessidade de microcirurgia para remoção tumoral. Isso justifica a geração de modelos pré-clínicos aprimorados e simplificados para investigar terapêuticas e obter insights sobre a recorrência tumoral locoregional e a resistência ao tratamento. Este artigo descreve um novo modelo de resseção ortotópica murina subtotal sincênica, clinicamente relevante, que recapitula o padrão de cuidado no OSCC. Esse modelo simplifica os modelos existentes e resulta em recidiva mensurável após resseção cirúrgica de tumores da mucosa bucal. O uso desse modelo pode levar a insights valiosos sobre a recidiva tumoral e a resistência ao tratamento em pacientes com CCOS. O estabelecimento desse modelo pré-clínico abre caminho para trabalhos adicionais que investiguem como o OSCC responde às terapias adjuvantes pós-ressecção, capturando o estado tumoral na janela clinicamente relevante em que os pacientes geralmente iniciam esses tratamentos subsequentes.

Introdução

Malignidades originadas na laringe, faringe, hipofaringe, cavidade nasal, glândulas salivares e cavidade oral são categorizadas como cânceres de cabeça e pescoço. O carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (HNSCC), que representa mais de 90% desses casos, se desenvolve a partir das células epiteliais escamosas que revestem esses sítiosanatômicos. Mais especificamente, o carcinoma de células escamosas da cavidade oral (CCOS) é uma malignidade confinada à região da cavidade oral. Em 2022, o câncer de cabeça e pescoço foi o sexto mais prevalente no mundo, com uma estimativa de 947.000 novos casos registrados no mundo e 482.000 mortesanuais 2.

A resseção cirúrgica é geralmente a modalidade de tratamento de primeira linha para cânceres de cabeça e pescoço, incluindo OSCC, frequentemente seguida por quimiorradioterapia 1,3,4. Embora essas terapias padrão de cuidado possam ser curativas em casos localmente restritos ou em estágio inicial, ainda existe uma alta taxa de recorrência locoregional e distante em pacientes com CCOS. Na verdade, menos de dois terços dos pacientes com OSCC sobrevivem além de cinco anos e sofrem efeitos colateraissignificativos 5,6,7. Há evidências crescentes de que o estresse traumático sofrido durante a cirurgia desencadeia os processos fisiológicos envolvidos no dano aos tecidos e na cicatrização dasferidas 8,9. Além disso, estudos também relataram que a resseção cirúrgica contribui para disfunções imunológicas que podem, por sua vez, contribuir para o potencial derecidiva 10.

Apesar da maioria dos pacientes submeter-se à resseção cirúrgica como terapia de primeira linha para OSCC, atualmente ainda existe a necessidade de modelos pré-clínicos relevantes de resseção ortotópica para OSCC que padronizem o estabelecimento de tumores e ressecção subtotal e preservem os mecanismos imunológicos associados à recidiva tumoral, a fim de fornecer um contexto crítico para a pesquisa nessaárea 11, 12,13. Estudos anteriores que relataram modelos de resseção em animais incluem um modelo de resseção de tumor de mama 4T1 que tem sido usado para estudar os efeitos imunossupressores dacirurgia 14. Para estudos em OSCC, o uso de um modelo heterotópico de resseção subtotal de tumor MOC1-OVA no flanco murino foirelatado 15. Em locais ortotópicos, o uso da linha celular do CPE orofaríngea do HPV, mEERL95, tem sido utilizado para estabelecer tumores submentânicos para modelagem de resseção e recidiva, enquanto transferem cirurgicamente linfonodos drenantes para camundongos ingênuos para estudosposteriores 16. Estudos ortotópicos relevantes investigando recidiva em camundongos imunodeficientes também foramrelatados 13.

Aqui está um protocolo recém-estabelecido para um modelo pré-clínico OSCC, imunocompetente, sintético e ortotópico de cirurgia padrão de tratamento, sobrevivência e recidiva em ressecção tumoral, observado dentro de uma semana após a ressecção. Esse procedimento simplifica ainda mais os modelos existentes, realizando a remoção do tumor sem microcirurgia e utilizando a linha celular de tumores de câncer oral murino (MOC2), que não requer a adição de matriz celular ou de membrana basal para estabelecer tumores.

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Protocolo

O procedimento a seguir, assim como a hospedagem e manutenção dos animais, foi realizado no Centro de Medicina e Cuidado de Animais de Laboratório do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Houston (UTHealth), em coordenação com o Comitê de Bem-Estar Animal institucional. O protocolo associado foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) e está de acordo com os princípios e diretrizes éticas estabelecidos na política do Serviço de Saúde Pública dos EUA sobre o cuidado e uso humanitário de animais de laboratório. Por favor, assegure o cumprimento de todas as políticas estabelecidas pela IACUC local e que um protocolo de uso de animais aprovado pela IACUC (ou equivalente) esteja em vigor antes de prosseguir com as seguintes seções. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento de tumores bucais ortotópicos na mucosa bucal oral

NOTA: Para este protocolo específico, células MOC2 foram usadas para estabelecer os tumores17. No entanto, outras linhagens ou tipos celulares também podem ser utilizados. A quantidade de células tumorais necessárias para estabelecer tumores in vivo depende da linhagem celular e deve ser otimizada antes da inoculação para cirurgia.

  1. Quando a cultura celular tumoral atingir aproximadamente 80% de confluência, colhe-se as células aspirando e descartando o meio de cultivo.
  2. Para remover o soro restante, lave as células com soro tampão fosfatado (PBS) sem magnésio nem cálcio, em volume suficiente para cobrir completamente a superfície do vaso (por exemplo, um frasco) com as células anexadas.
  3. Adicione 0,05% de tripsina ao frasco de cultura para cobrir suficientemente o fundo do frasco. Incubar células a 37 °C com 5% de CO2 por aproximadamente 5 minutos para o descolamento celular.
    NOTA: O período de incubação necessário (2-15 min) para descolar células pode variar dependendo das células (ou seja, linhagem celular) utilizadas. No entanto, a exposição prolongada à tripsina pode ser prejudicial às células. Se for necessário tempo adicional para um destacamento celular adequado, monitore as células periodicamente e de perto.
  4. Após a observação do descolamento celular, têmpe-se com pelo menos 2 vezes o volume de tripsina usado em meio completo (por exemplo, para 5 mL de tripsina, têmper com pelo menos 10 mL de meio completo).
  5. Centrifuge a suspensão da célula a 350 x g por 5 minutos em temperatura ambiente e aspire o sobrenadante.
  6. Resuspenda em PBS frio e pegue uma aliquota para contar. Repita os passos 1.5-1.6 para uma lavagem adicional e remover qualquer material restante.
  7. Usando PBS adicional, ajuste à concentração otimizada de células para inoculação (ou seja, 3 x 10 célulasde 4 MOC2 por volume de 30 μL). Mantenha a suspensão das células no gelo até estar pronta para uso.
  8. Anestesie o camundongo usando isoflurano de 1%-3%, suplementado com 1,5 L/min de oxigênio em uma câmara de pequenos animais.
    NOTA: A remoção de pelos não é necessária, mas recomendada nesta fase para ajudar na visualização do local da inoculação e na melhoria da consistência da inoculação. Se for removido nesta etapa, siga as instruções nos passos 3.3-3.5.
  9. Misture bem a suspensão celular para garantir uma distribuição uniforme e colete em uma seringa de insulina de 0,3 mL.
  10. Imobilize o camundongo sedado abraçando a nuca posterior com uma mão para que o lado anterior murino fique voltado para o condutor e a cabeça para cima, para que a boca fique aberta e acessível.
  11. Insira cuidadosamente a seringa na boca aberta, em um ângulo descendente em direção ao vestíbulo mandibular inferior esquerdo. Continue inserindo a agulha pela mucosa bucal inferior.
  12. Administre 30 μL de suspensão celular nessa região e remova cuidadosamente a seringa, mantenha essa posição por 5 segundos, depois retire lentamente a seringa para evitar suspensão adicional de células na remoção.
  13. Certifique-se de que o camundongo esteja em condição física e comportamental normal após a inoculação.
  14. Monitore o peso do mouse e o crescimento do tumor com balanço e pinças digitais, respectivamente. Monitore o desenvolvimento do tumor regularmente, 2 vezes por semana ou conforme protocolo especificado.

2. Montagem de materiais para cirurgia

NOTA: É altamente recomendado que pelo menos outro cirurgião ou assistente cirúrgico esteja presente para auxiliar na configuração e organização durante todo o procedimento, garantindo a manutenção da esterilidade.

  1. Escolha uma sala de procedimentos limpa, com porta que se feche e tráfego limitado.
  2. Pré-aqueça uma nova gaiola, contendo roupa de cama limpa e seca e um ninho de papel toalha, colocando-a parcialmente sobre um aquecedor elétrico.
  3. Aqueça um esterilizador de esferas até a temperatura de operação (250-265 °C).
  4. Instale a câmara de indução de isoflurano e o dispositivo portátil de anestesia, com o cone nariz apropriado, e conecte-se ao isoflurano, oxigênio e ao sistema de saquejação correspondente.
    NOTA: Ao usar a câmara de indução, anestesie camundongos com a temperatura em aproximadamente 3% de isoflurano. Ao usar o cone nasal, anestesie os camundongos com isoflurano de 1%-2%.
  5. Ligue o almofado cirúrgico aquecido a 38,9 °C e fixe a fonte de isoflurano na cabeça do almofado.
  6. Higienize a superfície de trabalho pretendida e o almofadinho cirúrgico com um desinfetante e cubra o espaço de trabalho com um tapete de bancada limpo.

figure-protocol-1
Figura 1: Instrumentos cirúrgicos e materiais selecionados para resseção tumoral. (1) Luvas cirúrgicas, (2) pano, (3) gaze, (4) seringa de insulina de 0,3 mL, (5) pano de toalha, (6) almofada de cotonete com álcool isopropílico, (7) lâmina de bisturi, (8) bisturi sem lâmina, (9) hemostato Hartman, (10) pinças hemostáticas de mosquito, (11) tesouras microdissecadoras, (12) pinças microdissecadoras, (13) pinças Brown-Adson, (14) micro-pinças de dissecação, (15) aplicadoras de ponta de algodão, (16) aparadora, (17) sutura de vicryl revestida 4-0, (18) Bupivacaína 0,25% e (19) pomada lubrificante para os olhos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Preparação do animal para cirurgia

  1. Pese o camundongo 24 horas antes do procedimento para determinar a anestesia adequada e a dosagem adequada do analgésico, conforme protocolo especificado.
  2. Anestesie o rato na câmara de indução por aproximadamente 2 minutos e depois administre analgésicos pelo menos 30 minutos antes da cirurgia. Isso deve ser injetado subcutâneamente na nuca do pescoço murino.
  3. Se não foi feito anteriormente no momento da inoculação ou se o cabelo já removido já tiver começado a crescer novamente, adicione uma pequena quantidade de creme depilante usando um aplicador de ponta de algodão diretamente no pelo no local da resseção tumoral, com margens suficientes para manter o cabelo fora do espaço da incisão durante o procedimento.
  4. Deixe o creme agir por aproximadamente 10 segundos e limpe o cabelo com gaze seca e limpa.
  5. Remova qualquer creme restante do local com gaze umedecida com soro ou água, depois seque a área com gaze seca e limpa.
    NOTA: A remoção de pelos com aparador eletrônico é um método alternativo aceitável, mas menos preferido, pois a pele ao redor da cabeça e do pescoço pode ser fina e delicada. Ao usar aparador, evite áreas sensíveis, como os olhos, e mantenha a pele solta esticada para evitar lesões indesejadas ao rato.
  6. Administrar analgésico sistêmico por via subcutânea e analgésico local no local da incisão.
  7. Coloque o rato anestesiado sobre a bolsa térmica, deitando-se de costas com o lado anterior voltado para cima. O nariz deve ficar logo dentro da tampa do cone nasal.
  8. Aplique uma pequena quantidade (ou seja, suficiente para cobrir o olho) de pomada lubrificante estéril em cada olho do camundongo para evitar o ressecamento dos olhos durante o procedimento.
  9. Usando um aplicador limpo em forma de ponta de algodão, aperte o local da resseção com álcool isopropílico 70% seguido de iodo 10% 3 vezes, certificando-se de remover o iodo após a última passagem com álcool isopropílico 70%.
  10. Usando luvas estéreis e equipamentos de proteção individual apropriados (roupão, protetor de cabelo), prepare o campo estéril de pelo menos 18"W x 26"L e disponha todas as ferramentas e materiais apropriados (gaze de algodão estéril, cotonetes estéreis, soro fisiológico, aplicadores de álcool isopropílico, ferramentas cirúrgicas) (Figura 1).
  11. Cubra o camundongo com uma tela estéril e corte um orifício de acesso imediatamente acima do local da resseção usando tesoura estéril.

4. Resseção cirúrgica de tumores orais estabelecidos

NOTA: Durante todo o procedimento, o cirurgião ou assistente deve verificar a respiração e o reflexo do camundongo para garantir a oxigenação adequada enquanto ele está sob anestesia. Ajuste o isoflurano conforme as orientações veterinárias e a política institucional, conforme necessário.

  1. Usando um novo bisturi cirúrgico, crie uma incisão submandibular, logo abaixo do tumor e ao longo da linha da mandíbula esquerda, ocupando todo o comprimento do tumor (Figura 2A,B).
  2. Use cuidadosamente os hemostáticos Hartman para alargar a abertura em direção ao tumor. Se necessário, toque qualquer sangue com gaze estéril.
  3. Localize o tumor e use pinças para mantê-lo no lugar (Figura 2B).
    NOTA: Um assistente pode ajudar neste momento no uso de pinças para manter o acesso ao local do tumor (ou seja, puxar a pele para longe).
  4. Usando tesoura cirúrgica, corte ao redor da base do tumor para ressecar todas as partes visíveis (Figura 2C). Reposicione a pele sobre o local do tumor ressecado e feche a incisão com quatro a seis pontos interrompidos, usando suturas de vicryl 4-0 de longa duração (Figura 2D).
    NOTA: Tome cuidado para não prender os pontos de forma muito apertada para preservar a pele sem prejudicar ainda mais os camundongos, além de evitar possíveis lesões na remoção posterior dos pontos.
  5. Para continuar com cirurgias adicionais, limpe as superfícies dos instrumentos cirúrgicos com álcool isopropílico a 70% e coloque-os no esterilizador de esferas aquecidas por 10 a 15 segundos antes de cada uso adicional. O mesmo conjunto de ferramentas pode ser usado para realizar cirurgias em até 5 camundongos ou, conforme especificado por diretrizes e práticas institucionais.
    NOTA: Tumores ressecados podem ser descartados ou levados para processamento e análise posterior (ou seja, fixação para histologia e imagem; dissociação de tecidos e coloração imune para análise de fenotipagem de citometria de fluxo, conforme os planos experimentais específicos deestudo 18,19 (Figura 2E).

figure-protocol-2
Figura 2: Tumores orais, estabelecidos transoralmente através da mucosa bucal inferior, podem ser ressecados por meio de abordagem submandibular sem complicações de cicatrização. (A) Tumor estabelecido (seta vermelha) na cavidade oral. (B) Incisão submandibular expondo o tumor. (C) O tumor ressecado. (D) Fechamento da ferida com múltiplas suturas de vicryl interrompidas. (E) Tumor excisado. (F) Esquema resumo para inoculação transoral. Imagem criada no BioRender. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Cuidados pós-resseção

  1. Após fechar a incisão, desligue o fluxo de anestesia para 0% e continue apenasO2 a 1,5 L/min até o camundongo começar a recuperar a consciência (menos de 5 min). Se o camundongo permanecer imóvel e sem resposta após vários minutos, consulte as políticas institucionais sobre intervenção veterinária.
  2. Transfira o rato com cuidado para a gaiola pré-aquecida. Continue monitorando o rato para consciência e mobilidade pós-operatórias. Deve recuperar a consciência e mobilidade total em 10 minutos.
  3. Realizar monitoramento pós-operatório diário de acordo com protocolos aprovados e políticas institucionais.
  4. Imediatamente após a cirurgia, forneça comida "macia" para o rato colocando pellets embebidos em água em um recipiente acessível (ou seja, um barco plástico de pesagem) diretamente na gaiola. Se não houver complicações, o camundongo pode voltar a comer alimentos sólidos normalmente na próxima alimentação rotineira.
  5. Monitore camundongos duas vezes ao dia nas primeiras 48 horas (2 dias) e uma vez por dia por um mínimo de 96 horas (4 dias) após a operação. Em seguida, retome um cronograma normal de monitoramento (ou seja, 2 vezes por semana).
  6. No sétimo dia pós-cirurgia, remova os pontos sob anestesia, tomando cuidado para não cortar ou ferir os camundongos.
  7. Continuar monitorando camundongos e, uma vez que atingirem seu ponto final humanitário, eutanasiar os animais de acordo com os critérios de protocolo aprovado para eutanásia e a Associação Médica Veterinária Americana.
    NOTA: A análise estatística da cinética do crescimento tumoral e da sobrevivência animal são métricas relevantes para esta metodologia. Para as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, análises estatísticas usando o teste log-rank/Mantel-Cox foram realizadas por meio de software de análise estatística. Para curvas de crescimento tumoral, o teste de comparações múltiplas de Šídák, por meio de uma análise ANOVA bidirecional, foi utilizado para comparar tamanhos tumorais entre grupos não ressecados e ressecados. Valores p menores que 0,05 foram considerados significativos.

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Resultados

Observações da mucosa bucal murina MOC2
Utilizando a linha celular MOC2, tumores foram estabelecidos na mucosa bucal murina da cavidade oral (Figura 2A-F). Tumores primários estabelecidos foram ressecados com tamanho tumoral de 25-36mm2. Após a ressecção, os camundongos normalmente recuperavam a mobilidade total em 5-10 minutos. Os camundongos foram posteriormente monitorados para cuidados pós-...

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Discussão

Aqui, este artigo descreve um procedimento simples para o estabelecimento e resseção subtotal de tumores na mucosa bucal da cavidade oral em camundongos. Estudos anteriores demonstraram de forma semelhante a viabilidade de estabelecer tumores por meio da língua murina, mucosa bucal ou assoalho da boca para análise a jusante de tumores ressecados, bem como para investigar recidivas locais subsequentes e metástases regionais e distantes, cada uma com suas própriaslimitaçõ...

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Agradecimentos

Esse trabalho foi financiado pela 1R21DE034543 (NIH-NIDCR). Também reconhecemos a equipe administrativa, veterinária e de manutenção do Centro UTHealth para Medicina e Cuidados com Animais de Laboratório pelo apoio e cuidado.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,05% TripsinaCorning25-052-CL0,53 mM EDTA, 1 x [-] bicarbonato de sódio  
Injeção de Bupivacaína HCl a 0,25%McKesson10772802,5mg/kg-1mg/kg, ID/SC 20-30uL
0,9% cloreto de sódio, USPMcKesson1617365 mL/kg, SC, IV 1,5 mL
Agulha 23 GBecton, Dickinson e Companhia [McKesson]402
Vicryl Revestido 4-0McKesson100700
Tubos cônicos de 50 mLTermo Científica33965
Pads de bancada absorventesVWR115-0684
Swab de álcool Álcool Isopropílico 70%Becton, Dickinson and Company [VWR]326895
Bolsa Auto-Selante 5 & frac14; ” x 10"  McKesson960944
EquilíbrioOhaus [VWR]30253019
Bioclave MiniBenchmark ScientificB4000-M
Pinças Brown-AdsonROBOZ [VWR]RS-5231
Aplicador com ponta de algodão estéril de 6 pol.McKesson999736
Phophate da Dulbecco com solução salina tamponada / ModificadaCytivaSH30028.02[-] cálcio, magnésio
Ethiqa XRÒ*Saúde Animal FidelisNDC 86084-100-303,25 mg/kg SC
Drape de Uso GeralMcKesson68107
Esterilizador de Contas de VidroVWR75999-324
Contas de VidroVWR75999-332
Hartman HemostatsFerramentas de Ciência Fina [VWR]13003-10
Dispositivo Portátil de Anestesia de Alta QualidadeVeterinária Patterson07-8915662
Isoflurane, USPMcKesson8032504-5% Indução, 1-3% Manutenção
MedLED & Ograve; Chrome (Farol)KLS MartinML-MC7-HT-HK-X21
Pinças MicrodissecantesROBOZ [VWR]RS-5174
Tesoura Micro DissecadoraROBOZ [VWR]RS-5914
Seringas de Insulina MonójetoSaúde Cardinal [McKesson]8881600145
Pinça Hemostática de MosquitoROBOZ [VWR]RS-7100
Creme Corporal Nair DepiladorIgreja & Dwight Co., Inc.
Suporte de agulhaROBOZ [VWR]RS-7154
Solução de Preparação PVP 10% Povidona IodoMcKesson911740
BisturiROBOZ [VWR]RS-9843
Lâminas de Bisturi Aço Carbono Nº 10McKesson862685
Tapete Aquecido para Pequenos AnimaisK& Produtos H Pet [Amazon]9 x 12in 20W
Pequena Câmara do RatoVeterinária Patterson07-893338
Cone Pequeno do NarizVeterinária Patterson78909681
Steri-DrapeMcKesson5713
Compressas de gaze estéreis 2" x2" – 12 PLYDukal Corporation [Amazon]REFERÊNCIA: 1212
Pomada Ocular Lubrificante EstérilMcKesson730979
Luvas CirúrgicasMcKesson20-2070N
Seringa 1ccMcKesson1065984
Pinças digitais de fibra de carbono rastreáveisMarca Fischer15-077-957
Kit de AparadorWAHL [Amazon]BravMini

Referências

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