Artigo de método

Classificação de células baseada em zíper de leucina para purificação de células transduzidas por vetor duplo

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para purificar seletivamente células T duplamente transduzidas de uma mistura de células T co-transduzidas. Essa abordagem combina dois vetores retrovirais que codificam um componente de uma metodologia de classificação de células baseada em zíper de leucina emparelhada que permite a purificação imunomagnética seletiva de células transduzidas por vetor duplo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As terapias adotivas com células T, incluindo células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), demonstraram atividade clínica impressionante contra neoplasias hematológicas e estão se mostrando promissoras no tratamento de malignidades de tumores sólidos. Apesar desses sucessos, foram identificados vários mecanismos de resistência à imunoterapia com células T que limitam o sucesso terapêutico, incluindo perda ou expressão fraca de antígenos-alvo, desenvolvimento de exaustão de células T e presença de um microambiente tumoral imunossupressor. Várias estratégias de engenharia celular foram desenvolvidas para superar esses mecanismos de resistência. No entanto, vários mecanismos de resistência podem ocorrer simultaneamente, necessitando de uma combinação de várias estratégias de engenharia para otimizar a atividade antitumoral. As restrições de empacotamento de vetores limitam a entrega de grandes quantidades de informação genética às células T e apresentam um desafio na co-expressão de múltiplas construções projetadas. Aqui, descrevemos um protocolo para co-transdução de células T com dois vetores para codificar vários transgenes, aumentando assim o número de funções projetadas. Ao co-expressar uma metodologia de classificação de células baseada em zíper de leucina, denominada Zip-sort, direcionamos a purificação imunomagnética seletiva de células de transdução dupla que incorporaram dois vetores distintos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A terapia com células T CAR revolucionou o tratamento da leucemia de células B, linfoma e mieloma múltiplo 1,2. As células T CAR também estão sendo investigadas para malignidades de tumores sólidos3. No entanto, mecanismos recorrentes para falha da terapia com células T CAR foram identificados, incluindo má expressão ou perda da molécula do antígeno alvo CAR, desenvolvimento de disfunção de células T (exaustão), imunossupressão ativa pelo microambiente tumoral e tráfego limitado de células T e persistência no microambiente tumoral 3,4,5,6 . Embora soluções de engenharia individuais tenham sido desenvolvidas para tentar superar cada um desses mecanismos de resistência de células T CAR3, a introdução de múltiplas funções de engenharia em um produto de terapia celular para superar simultaneamente vários mecanismos de resistência é um desafio devido à capacidade limitada de empacotamento genético dos sistemas de vetores retrovirais e lentivirais7.

Para superar as limitações na capacidade de empacotamento de vetores, a co-transdução de células T com múltiplos vetores tem sido cada vez mais usada. A co-transdução de vetores tem sido usada para estudar estratégias de engenharia de células T controladas por lógica e reguladas por drogas em estudos pré-clínicos 8,9,10 e em um ensaio clínico recente avaliando células T CD19/CD22 dual-CAR para superar as limitações de empacotamento de vetores11. No entanto, a co-transdução gera produtos de células mistas contendo combinações de células T de transdução simples e dupla, o que pode prejudicar a funcionalidade do produto se depender de componentes codificados por ambos os vetores e também pode levar à competição entre células T de transdução única12.

Para superar esses desafios, desenvolvemos uma metodologia chamada Zip-sort, que usa zíperes de leucina heterodimerizantes - cada um expresso a partir de um dos dois vetores co-transduzidos - para direcionar a purificação imunomagnética de uma única etapa de células duplamente transduzidas13. Neste protocolo, descrevemos métodos para a construção de vetores retrovirais incorporando nossa metodologia Zip-sort, produção e concentração de sobrenadantes retrovirais, ativação e co-transdução de células T e purificação imunomagnética de células duplamente transduzidas (Zip-sort).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os estudos em animais foram conduzidos no Laboratório de Pesquisa Animal Parvin da Cidade da Esperança (COH) sob o protocolo # 23145 aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do COH e no biotério do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) sob o protocolo # 99-07-025, conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do MSKCC. As células T humanas foram isoladas de células mononucleares de sangue periférico não identificadas (PBMCs) que foram purificadas Ficoll-Paque de filtros de redução de leucócitos obtidos do Centro de Doadores de Sangue City of Hope e usadas sob o protocolo # 24427, conforme aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da City of Hope. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas institucionais de biossegurança.

1. Design vetorial de classificação por zíper

  1. Selecione o vetor de expressão de escolha para modificar geneticamente as células de interesse.
    NOTA: A metodologia zip-sort compreende zíperes secretados e zíperes de captura, ambos expressos a partir de vetores diferentes, e que emparelham intracelularmente e trafegam para a superfície celular para permitir a purificação seletiva de células incorporando ambos os vetores (Figura 1A-D) 13 . Os zíperes secretados são expressos a partir do Vetor 1 e contêm uma etiqueta de afinidade. Os zíperes de captura são expressos a partir do Vetor 2 e retêm o zíper secretado na superfície da célula. A modificação do zíper de bloqueio é composta por um segundo zíper ligado covalentemente, que bloqueia o emparelhamento de zíper extracelular não específico do zíper secretado. A modificação do zíper de bloqueio é necessária para evitar o emparelhamento extracelular ao adicionar um zíper de captura a proteínas com domínios extracelulares alongados (normalmente domínios extracelulares maiores que um domínio de dobradiça curta).
  2. Selecione um conjunto de zíperes secretados e de captura da Tabela Suplementar 1 e do Arquivo Suplementar 1 para testar e criar vetores.
  3. Clone sequências de zíper em vetores de expressão emparelhados usando técnicas padrão de biologia molecular13- cada um dos dois vetores codificará o zíper secretado pela etiqueta de afinidade ou o zíper de captura (Figura 1D).
    1. Consulte a Tabela Suplementar 1 e o Arquivo Suplementar 1 para obter sequências de construção de zíper. As sequências de zíper foram colocadas no 5' (terminal N) de uma mensagem policistrônica para melhorar sua expressão e, assim, aumentar o rendimento da classificação. Coloque os transgenes subsequentes a jusante, separados por peptídeos 2A autoclivados (Figura 1D). No entanto, experimentos anteriores tiveram sucesso em colocar os zíperes em uma configuração de 3 'se a alta expressão for mantida.

2. Produção de retrovírus

  1. Prepare células Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, vírus trópico de camundongo) ou células Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (adição de ɑ-V β-3 projetado para aumentar a adesão de Phoenix-Eco) ou 293Vec-RD11414 (vírus trópico humano) ou 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 células (adição de ɑ-V β-3 projetado para aumentar a adesão de 293Vec-RD114) 1 dia antes da transfecção.
    NOTA: Este protocolo não requer modificação de linhas de embalagem com integrinas ɑ-V β-3, mas esta modificação melhora a adesão desta linha celular a frascos de cultura de tecidos e facilita a coleta de sobrenadantes retrovirais.
    1. Tripsinizar células em frasco T175 contendo células Phoenix ou 293Vec-RD114 em ~ 80% de confluência com 0,25% de tripsina-EDTA.
      1. Remova o meio, lave as células aderentes com 10 mL de PBS, mantendo as células não perturbadas para remover os componentes séricos que inibem a tripsina, adicione 5 mL de tripsina-EDTA a 0,25% e incube as células a 37 ° C por 5 min.
      2. Dissocie e colete as células em 5 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de GlutaMAX (referido como DMEM completo).
      3. Pulverizar as células num tubo cónico de 15 ml, centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Decantar mídia.
    2. Ressuspenda as células peletizadas por centrífuga em 10 mL de DMEM completo e coloque em uma placa de cultura de tecidos de 10 cm aproximadamente 1,5 x 106 células Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, células 293Vec-RD114 ou 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 células contadas com um hemacitômetro.
    3. Agite ou rode suavemente a placa para distribuir as células uniformemente e incube durante a noite a 37 °C para permitir que as células adiram à placa.
  2. Aproximadamente 18-24 h depois, verifique se as células são 60%-70% confluentes, com células saudáveis e aderentes exibindo projeções dendríticas.
  3. Transfect estavelmente células Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, células 293Vec-RD114 ou 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 com construções de vetor LZRS retrovirais (Addgene Plasmid # 31601, transfecção estável episomal baseada em EBNA) ou construções de vetor PB13 (integração genômica estável baseada em transposon piggyBac, Arquivo Suplementar 1) usando o kit de transfecção (Tabela de Materiais) conforme descrito abaixo.
    1. Combine 2 μg de DNA vetorial LZRS ou DNA vetorial PB e 16 μL de reagente intensificador em 300 μL de tampão EC em um tubo de microcentrífuga para cada reação de transfecção.
    2. Para integração estável de construções vetoriais PB, adicione também 1 μg do vetor de transposase piggyBac hiperativo pCMV-hyPBase15 (Sanger Institute).
    3. Agite suavemente por 5 s e incube em temperatura ambiente por 5 min. Adicione 20 μL de reagente de transfecção, vórtice por 10 s e incube em temperatura ambiente por 10 min para gerar complexos de micelas de DNA.
    4. Adicione 300 μL de DMEM completo ao tubo, pipete várias vezes para misturar bem e adicione a suspensão micelar gota a gota às células da linha de embalagem revestida usando uma pipeta de 1 mL.
    5. Agite suavemente para garantir a deposição uniforme das micelas. Após 24 h, tripsinizar as células transfectadas e avaliar a expressão inicial da construção codificada retroviral por citometria de fluxo.
    6. Transfira as células tripsinizadas para um frasco T75 com 20 mL de DMEM completo e adicione 2 μg / mL de puromicina ou 10 μg / mL de blasticidina, dependendo dos genes de resistência a antibióticos, para selecionar as células transfectadas. Quando as células atingirem 70% -75% de confluência, tripsinize e transfira para um frasco T175 com 40 mL de DMEM completo. Manter a seleção de antibióticos no meio durante a expansão da linha de embalagem.
    7. Quando as células estiverem 80% -85% confluentes, tripsinize novamente e confirme a expressão do construto por citometria de fluxo. Congele uma alíquota de células usando meio de congelamento (50% DMEM completo, 40% FBS, 10% DMSO) e células de passagem em dois frascos T175 (proporção de divisão 1:10-1:12) com 40 mL de DMEM completo.
  4. Colete e concentre o sobrenadante retroviral de linhas de embalagem estáveis totalmente selecionadas cultivadas em frascos T175 quando as células atingirem 80% -85% de confluência.
    1. Remova os antibióticos do meio antes da primeira colheita, substituindo o meio em T175 por 40 mL de DMEM fresco e completo 24 h antes da primeira coleta pretendida.
    2. Colete e filtre os sobrenadantes 24 h após a substituição do meio, passando o sobrenadante coletado por seringas de 50 mL equipadas com filtros de seringa (0,45 μm, fluoreto de polivinilideno). Colete em um tubo cônico de 50 mL.
    3. Adicione 5x concentrado de solução de polietilenoglicol (PEG) (40% (peso / vol) PEG 8.000 MW contendo 2,4% (peso / vol) NaCl) sobrenadante filtrado e inverta o tubo várias vezes para misturar completamente (etapa de precipitação PEG).
    4. Adicione 40 mL de DMEM completo de volta ao frasco T175 colhido originalmente, incube por mais 24 horas e colete o sobrenadante viral diariamente por mais 2 dias consecutivos no total.
    5. Precipitar o vírus durante 1-2 dias a 4 °C. O vírus precipitado aparecerá como material floculante, flutuante ou sedimentado.
    6. Centrifugar a suspensão do vírus precipitado por PEG a 2.100 x g por 15 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante não precipitado.
    7. Ressuspenda cada pellet viral precipitado por PEG em 500 μL de RPMI suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de GlutaMAX, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não essenciais e 0,1% de β-mercaptoetanol (referido como RPMI completo).
    8. Use o vírus ressuspenso imediatamente para transdução ou transferência para um tubo de microcentrífuga e armazene a -80 ° C.

3. Dia 0: Enriquecimento e ativação de células T de camundongo

  1. Cubra uma placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos com 1,5 mL de PBS por poço contendo 2 μg / mL anti-CD3 (clone 145-2C11) e 2 μg / mL anti-CD28 (clone 37.51). Incubar durante 2 h a 37 °C.
  2. Colha o baço de camundongos doadores, dissocie as células por meio de um filtro de 40 μm e colete esplenócitos em RPMI completo. Esplenócitos de pellets por centrifugação a 340 x g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Camundongos BALB/cJ fêmeas com idades entre 6 e 8 semanas foram usados como camundongos doadores neste estudo.
  3. Descarte o sobrenadante, suavemente o pellet de vórtice, adicione 1 mL de tampão de lise de hemácias, pipete 3x-5x para misturar, incube em temperatura ambiente por 1 min, resfrie com 10 mL de RPMI completo e gire as células centrifugando a 340 x g por 5 min a 4 ° C.
  4. Descarte o sobrenadante, adicione 800 μL de PBS com 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA (conhecido como tampão MACS) e adicione 200 μL de microesferas de CD19 de camundongo. Pipetar para misturar e incubar durante 15 min a 4 °C.
  5. Prepare 1 coluna LD por baço de camundongo. Fixe a coluna LD em um separador MACS. Coloque um tubo cônico de 15 mL embaixo para coletar esplenócitos depletados de CD19. Umedeça a coluna com 2 mL de tampão MACS.
  6. Após a incubação com microesferas CD19, lave as células com 5 mL de tampão MACS frio, pellet células centrifugando a 340 x g por 5 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Ressuspenda em 1 mL de buffer MACS e adicione células à coluna LD. Aguarde a passagem da suspensão antes de lavar com 1 mL e depois 2 mL de tampão MACS.
  7. Colete o fluxo dos esplenócitos depletados de CD19 para usar a jusante. Rejeitar a coluna LD, centrifugar a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda em 18 mL de RPMI completo. Adicionar IL-2 humana recombinante (rhIL-2) a uma concentração final de 50 UI/ml.
  8. Descarte a solução de anticorpos da placa de 6 poços revestida com anticorpos. Adicione 3 mL de esplenócitos depletados de células B ressuspensas a cada poço da placa de 6 poços revestida com anticorpos.

4. Dia 1: Transdução retroviral de células T de camundongo

  1. Revestir uma placa de 6 poços não tratada com cultura de tecidos com 1,5 mL de PBS por poço contendo 2 μg/mL anti-CD3 (clone 145-2C11), 2 μg/mL anti-CD28 (clone 37,51) e 20 μg/mL de RetroNectina.
    NOTA: As placas que não são de cultura de tecidos são usadas durante o revestimento de RetroNectin de acordo com as recomendações do fabricante.
  2. Incubar durante 2 h a 37 °C. Descarte a solução de revestimento ou guarde para reutilização (pode reutilizar uma vez). Obstrua a placa com 1 mL de PBS com 2% de BSA por alvéolo, incube por 10 min a 37 °C e descarte a solução de bloqueio.
  3. Enquanto isso, descongele o sobrenadante viral precipitado por PEG em banho-maria a 37 °C.
    NOTA: 500 μL de cada retrovírus concentrado em PEG cotransduzido gerado a partir de um frasco T175 devem ser suficientes para transduzir duas vezes até 2 x 106 células T ativadas por poço com > eficiência de transdução dupla de 20%.
  4. Adicione sobrenadantes virais de co-transdução ao poço da placa de 6 poços de acordo com as condições desejadas, aumente o volume final para pelo menos 2 mL com RPMI completo e 50 UI / mL rhIL-2 e gire por 1 h a 2.100 x g e 32 ° C.
  5. Adicione 0,5-2 x 106 células T ativadas por poço e gire a placa a 340 x g por 10 min a 32 °C. Se as células não estiverem aderentes, repita o centrifugação a 340 x g por mais 10-20 min a 32 °C. Incubar a 37 °C durante a noite.

5. Dia 2: Avaliação da expressão vetorial e retransdução opcional

  1. Interrompa 100-200 μL de células aderentes por condição da placa de transdução para citometria de fluxo. O usuário deve identificar um marcador detectável por citometria de fluxo para cada vetor individual e tag de afinidade e usá-los para avaliar a eficiência de transdução de vetor único, eficiência de transdução de vetor duplo e apresentação de tag de afinidade usando citometria de fluxo.
  2. Realizar citometria de fluxo em células cotransduzidas conforme descrito abaixo.
    1. Configure os eixos de parâmetro de aquisição para exibir repórteres vetoriais para o Vetor 1 e o Vetor 2 (Figura 1C).
    2. Plote histogramas para coloração de zíper de tag de afinidade (por exemplo, FLAG ou CD34) para cada um dos quatro quadrantes de expressão de Vetor 1 e Vetor 2 para garantir que a coloração de tag de afinidade seja limitada a células que co-expressam repórteres de transdução de Vetor 1 e Vetor 2.
  3. Se as células forem suficientemente transduzidas para garantir células suficientes para experimentos a jusante (geralmente 20% ou mais de transdução dupla), execute as etapas a seguir.
    1. Revestir o dobro do número de poços iniciais usados para transduzir cada linhagem de células T com PBS contendo 2 μg/mL de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 para manter a estimulação das células T. Incubar durante 2 h a 37 °C.
    2. Transfira as células para novos poços com RPMI completo com 50 UI / mL rhIL-2 (mantém a estimulação das células T).
  4. Se as células não forem suficientemente transduzidas para garantir células suficientes para experimentos a jusante (geralmente < 20% de transdução dupla), execute as etapas a seguir.
    1. Transduza novamente usando o mesmo protocolo do Dia 1, mas aumentando para dobrar o número de poços inicialmente usados para contabilizar a expansão das células T.
    2. Incubar a 37 °C durante a noite. Repetir a citometria de fluxo 24 h mais tarde.
      NOTA: As construções codificadas por vetor, incluindo o zíper da tag de afinidade, mostram a expressão máxima 2 dias após a transdução inicial.

6. Dia 3: Seleção imunomagnética de células T (Zip-sort)

  1. Poços de pool das células geradas usando as mesmas condições de co-transdução em um tubo cônico de 15 mL.
  2. Centrifugar as células a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e incubar as células em 500 μL de tampão MACS contendo 30 μL de microesferas (DYKDDDDK (FLAG) ou CD34 humano) por 1 x 107 células durante 30 min a 4 °C.
  3. Após a incubação, lave as células com 5 mL de tampão MACS frio. Centrifugar as células a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão MACS.
  4. Selecione positivamente as células T transduzidas usando uma coluna LS, conforme descrito abaixo.
    1. Umedeça a coluna com 2 mL de tampão MACS. Aplique a suspensão da célula na coluna LS no suporte magnético.
    2. Lave sequencialmente com tampão MACS (1 mL, 2 mL, 3 mL). Eluir as células retidas da coluna removendo a coluna do suporte magnético, adicionando 5 mL de RPMI completo à coluna e inserindo o êmbolo da célula.
    3. Capturar células em um tubo cônico de 15 mL ou diretamente em um frasco T25. Equilibre as células a 0,5 x 106 células/mL em RPMI completo com 50 UI/mL rhIL-2.
    4. Se começar a partir de < 20% de transdução dupla, opcionalmente, elui as células em uma segunda coluna LS para seleção positiva sequencial para aumentar a pureza pós-classificação.
  5. Cultura de células T CAR em frascos T25 ou T75 a aproximadamente 0,5 x 106 células/mL de RPMI completo e 50 UI/mL de rhIL-2.
  6. Opcional: Se as células T forem usadas para experimentos in vivo, considere a cultura em 1 μM de dasatinibe para atenuar a disfunção induzida pela sinalização tônica de células T CAR encontrada durante o período inicialde cultura 13,16.
  7. Realize a citometria de fluxo de acordo com as etapas 2.1 e 2.2 acima para células T pré-classificadas e pós-classificadas para avaliar o rendimento e a pureza pós-Zip-sort (% de transdução dupla).
    Rendimento = 100 x total de células duplamente transduzidas recuperadas / total de células duplamente transduzidas presentes na população pré-classificação)

7. Dia 4: Continuação da cultura de células T

  1. Adicione RPMI completo fresco e 50 UI / mL rhIL-2 para todo o volume de cultura para manter a concentração de células T em 0,5-1 x 106 células / mL.
  2. Opcional: Se as células T forem usadas para experimentos in vivo , adicione 1 μM de dasatinibe fresco.

8. Dia 5: Caracterização de células T classificadas por Zip

  1. Opcional: Prepare 100-200 μL de suspensão de células T por condição corada com anticorpos para detectar CARs ou outros produtos proteicos codificados pelos vetores Zip-sort usando citometria de fluxo.
  2. Realizar experimentos in vitro ou in vivo com células T CAR.
  3. Opcional: Se as células T forem usadas para experimentos in vivo , lave as células para remover o dasatinibe. Ressuspenda as células na concentração necessária para injeção retroorbital ou na veia da cauda de acordo com as diretrizes institucionais.

9. Dia 0: Purificação e estimulação de células T humanas

  1. Descongele rapidamente um frasco de células mononucleares do sangue periférico humano criopreservado (PBMCs) em banho-maria (ou use PBMCs recém-isolados). Adicione PBMCs descongelados a um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de tampão MACS, prepare uma alíquota para contagem e células de pellets centrifugando a 340 x g por 5 min a 4 ° C.
  2. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células no tampão MACS (use 40 μL de tampão por 1 x 107 células totais). Prossiga com o isolamento de células T usando o Kit de isolamento de células T Pan, humano, de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Resumidamente, adicione 10 μL de coquetel de biotina-anticorpo de célula T Pan por 1 x 107 células totais. Incubar durante 5 min a 4 °C.
    2. Adicione 30 μL de tampão MACS por 1 x 107 células totais. Adicione 20 μL de Pan T Cell MicroBead Cocktail por 1 x 107 células no total.
    3. Incubar durante 10 min a 4 °C. Encha o volume da suspensão celular usando tampão MACS até pelo menos 500 μL.
    4. Prossiga para a separação magnética da célula usando uma coluna LS e colete o fluxo através das células T enriquecidas (intocadas).
  3. Contar o rendimento das células T e as células dos sedimentos centrifugando a 340 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células T humanas em RPMI completo a 1 x 106 células/mL com rhIL-2 a 50 UI/mL.
  4. Para um tubo cônico de 15 mL contendo 2 mL de PBS, adicione o volume necessário de Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 para expansão e ativação de células T (25 μL de grânulos por 1 x 106 células, usando uma proporção de 1: 1 grânulo para células T) e gire para baixo a 340 x g por 5 min a 4 ° C para lavar os grânulos. Descarte o sobrenadante.
  5. Misture as células T ressuspensas com grânulos lavados e transfira para um frasco T25 para cultura.

10. Dia 3: Transdução retroviral de células T humanas

  1. Cubra uma placa de 6 poços sem cultura de tecidos com 1,5 mL de PBS por poço contendo 20 μg / mL de RetroNectina.
  2. Incubar durante 2 h a 37 °C. Descarte a solução de revestimento ou guarde para reutilização (pode reutilizar uma vez).
  3. Enquanto isso, descongele os sobrenadantes virais precipitados por PEG para co-transdução em banho-maria a 37 °C.
  4. Adicione sobrenadante viral de co-transdução a poços de placa de 6 poços revestida com RetroNectina de acordo com as condições de transdução desejadas, conte e adicione a quantidade desejada de células T (geralmente 0,5 - 2 x 106 células T / poço), aumente o volume para 3 mL com RPMI completo contendo rhIL-2 e gire por 45 min a 340 x g a 32 ° C.
  5. Após 24 h, mantenha as células T a 1 x 106 células/mL em RPMI completo com 50 UI/mL de rhIL-2.
  6. Transfira as células da placa de 6 poços para o frasco T25 se o volume necessário para manter a concentração desejada de células T exceder a capacidade de volume da placa de 6 poços.

11. Dia 6: Classificação de células CAR T humanas

  1. Remova Dynabeads das células T antes da purificação imunomagnética baseada em tag de afinidade (Zip-sort) para evitar possível retenção associada a Dynabead na coluna magnética e antes da citometria de fluxo para evitar interferência potencial na análise de citometria de fluxo.
  2. Vórtice brevemente para dissociar Dynabeads e transferir células T para um tubo cônico de 15 mL e inserir no Dynabead Magnet. Inverta o tubo algumas vezes e aguarde 5 min até que os Dynabeads estejam presos ao ímã.
  3. Transfira cuidadosamente a suspensão celular sem Dynabeads para um novo tubo cônico de 15 mL por aspiração com uma pipeta. Conte a concentração de células recuperadas e use o volume para calcular o rendimento total da célula.
  4. Avalie a expressão de CAR usando citometria de fluxo de acordo com o protocolo de transdução de camundongo acima.
  5. Centrifugar as células a 340 x g durante 5 min a 4 °C e incubar em tampão MACS de 500 μL contendo 30 μL de microesferas (DYKDDDDK (FLAG) ou CD34 humano) por 1 x 107 células.
  6. Siga as etapas 6.3-6.5 para obter células T CAR humanas classificadas por Zip.
  7. Avalie a viabilidade pós-classificação por verificação de viabilidade do hemacitômetro usando exclusão de azul de tripano. Espera-se que a viabilidade da pré-classificação seja > 80%. Isso pode cair abaixo de 80% após a classificação por zíper, mas se recupera em 4-5 dias.
  8. Expanda as células T humanas em RPMI completo com 50 UI/mL rhIL-2 e mantenha a concentração de células T em aproximadamente 1 x 106 células/mL. A expansão e manutenção das células T pós-classificação podem ser adaptadas de acordo com os protocolos padrão de expansão e uso do usuário.
  9. Realize testes experimentais a jusante, como ensaios de morte, produção de citocinas, análise in vivo usando células T geralmente após o dia 8.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste protocolo, demonstramos a co-transdução e a seleção imunomagnética de uma única etapa de células T duplamente transduzidas com dois vetores retrovirais distintos (denominados Zip-sort, Figura 1)13. Cada vetor codifica uma parte de um par de zíperes de leucina heterodimerizantes que é exibido seletivamente na superfície das células T duplamente transduzidas (Figura 1A). Um zíper secretado por etiqueta de afinidade é expresso a partir...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar conjuntos de vetores Zip-sort, produzir retrovírus, co-transdução de células T de camundongos e humanos e purificação imunomagnética de células duplas transduzidas (Zip-sort). O protocolo acima foi otimizado para vetores retrovirais e para células T de camundongos e humanos. Embora a metodologia Zip-sort não tenha sido avaliada com outros sistemas vetoriais, em princípio, outros sistemas vetoriais provavelmente serão compatíveis, incluindo lentiv...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R., S.C., S.E.J. e M.v.d.B. são co-inventores em pedidos de patentes relacionados à tecnologia Zip-sort. A A.P.B. presta consultoria para a Abbvie e a Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. recebeu apoio de pesquisa da Seres Therapeutics e opções de ações da Seres Therapeutics e ThymoFox; ele recebeu royalties da Wolters Kluwer; ele consultou, recebeu honorários ou participou de conselhos consultivos da Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (cônjuge), Synthekine (cônjuge), Beigene (cônjuge), Kite (cônjuge), MustangBio (cônjuge) e Cellectar (cônjuge); ele tem licenciamento de PI com Seres Therapeutics e Juno Therapeutics; ele ocupa um papel fiduciário no Conselho da Fundação da DKMS (uma organização sem fins lucrativos); e ele é o presidente do conselho consultivo científico da Smart Immune.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.C. recebeu apoio da Fundação Alemã de Pesquisa (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. recebe apoio de um prêmio de desenvolvimento de carreira do NCI (prêmio número K08-CA252157). S.E.J. também recebeu apoio da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (prêmio Jovem Investigador), do Programa Nacional de Doadores de Medula (prêmio Amy Program) e do Instituto Parker de Imunoterapia contra o Câncer (prêmio Bridge Scholar). A pesquisa no laboratório van den Brink é apoiada pelos prêmios P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308 do Instituto Nacional do Câncer; Prêmio R01-HL164902 do Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue e prêmio P01-AG052359 do Instituto Nacional do Envelhecimento. Esta pesquisa é apoiada em parte pela doação Deana e Steve Campbell Chief Physician Executive Distinguished Chair.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Relacionado à linhagem celular tumoral
C1498ATCCTIB-49
BM185-CD19Referência 13
BM185-CD20Referência 13
Unidade central do nucleofector 4DLonzaAAF-1003B
Unidade 4D-Nucleofector XLonzaAAF-1003X
Kit de buffer Lonza SF
Produção de vírus
Placa de cultura de células tratada com cultura de tecidos (TC) de 10 cmCorning353003
Tubo cônico de 50 mLThermo Científico339652
EffecteneQiagen301425
plasmídeo pENTR1aAddgene17398
LZRS-RfaAddgene31601
PB MMLV puro (vetor viral para células T de camundongo)Referência 13
PB SFG blastR (vetor viral para células T humanas)Referência 13
pCMV-hyPBaseInstituto Sanger
Fênix-EcoATCCCRL-3214
Phoenix-Eco alpha V beta 3Referência 13Phoenix-Eco modificado para aderir a frascos de cultura com maior avidez
PB-EF1a íntron WPRE mCD4 P2A MCS integrina beta 3Referência 13opcional para melhorar a adesão das células da linha de embalagem aos frascos de cultura
PB-EF1a íntron WPRE hCD8a 2A integrina alfa VReferência 13opcional para melhorar a adesão das células da linha de embalagem aos frascos de cultura
Biovec-RD113Biovec Pharma
Biovec-RD113 alfa V beta 3Biovec PharmaEste estudo, transfectado com vetores alfa V beta 3
Filtros de seringa Millex-HV (0,45 μ m)MilliporeSLHVR33RRS
Polietilenoglicol 8000 (PEG)Fisher CientíficoBP233-1
Cloreto de sódioFisher CientíficoS271-500
PuromicinaSanta Cruz Biotechsc-108071B
BlasticidinaSanta Cruz BiotechSC-204655
Frascos tratados com TC T175 Corning353112
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenolGibco25200056
Meio celular
2-mercaptoetanolGibco21985023
RPMI1640Gibco11-875-119
DMEMGibco11-965-118
FBSSigmaF2442
GlutamamaxGibco35050061
Aminoácidos não essenciais MEMGibco11140050
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-163
Piruvato de sódioGibco11360070
estimulação de células T
Tubo cônico de 15 mLThermo Científico339650
Placa não-TC de 6 poçosGibco351146
Placa TC de 6 poçosGibco353046
microesferas anti-CD19Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anti-mouse CD28 (Clone 37.51)BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anti-mouse CD3ε (Clone 145-2C11)BioXCellBE0001-1
Albumina de soro bovinoSigma AldrichA4737-1G
DasatinibeCayman Chemical11498
Dynabeads Ativador T Humano CD3/CD28Gibco11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, livre de RNaseInvitrogenAM9260G
Tampão de lise HybriMax RBCSigmaR7757-100ML
Coluna LDMiltenyi Biotec130-042-901
Kit de isolamento de células T Pan, humanoMiltenyi Biotec130-096-535
Ímã Dynamag-15Invitrogen12301D
Solução salina tamponada com fosfato (1X)Corning21040CV
RetronectinaTakaraT100B
rhIL-2Proleucina (aldesleucina)
Balão de cultura de células T25Corning353109
Zip-sort
µ Kit de isolamento MACS DYKDDDDKMiltenyi Biotec130-101-591
Kit CD34 MicroBead, humanoMiltenyi Biotec130-046-702
QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Coluna LSMiltenyi Biotec130-042-401
citometria de fluxo e monitoramento celular
Anti-CD90.1 Thy1.1 APC (Clone OX-7)BD BiociênciasGato# 561409; RRID:AB_10683163
Anticorpo anti-etiqueta V5, (Clone 4C12E11) iFluor 488GenScriptGato # A01803, RRID: AB_2925231
Myc PETecnologia de sinalização celularGato # 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Tecnologia de sinalização celularGato # 2233; RRID:AB_823474
APC anti-DYKDDDK Tag (Clone L5)BioLegendGato# 637307; RRID:AB_2561496
Anticorpo anti-CD34 de camundongo, Alexa Fluor 647, (clone QBEnd/10)Novus BiológicosGato # NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Streptag FITCGenScriptGato # A01736; RRID:AB_2622221
Incucyte SX5Sartorius
Citômetro de fluxo de PenteonAgilent

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

Artigos relacionados