Artigo de método

Limpeza óptica transitória usando moléculas absorventes para imagens ex vivo e in vivo

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DOI:

10.3791/68629

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11 de julho de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

Neste artigo

Resumo

Técnicas de limpeza óptica, como soluções de moléculas absorventes, reduzem temporariamente o espalhamento de luz para aprimorar a imagem biológica e oferecem estratégias de imagem in vivo biocompatíveis e reversíveis para órgãos profundamente incorporados. Este protocolo apresenta procedimentos experimentais detalhados, bem como processamento avançado de imagens para obter imagens dinâmicas de alta qualidade para dinâmica em tempo real em animais vivos.

Resumo

A imagem dinâmica é uma ferramenta fundamental na biologia e na medicina, mas é limitada pelo espalhamento de luz em tecidos vivos causado por incompatibilidades de índice de refração, o que reduz a profundidade de penetração e a resolução em tecidos biológicos. Trabalhos anteriores introduziram uma nova abordagem para alcançar a transparência óptica em animais vivos, utilizando moléculas fortemente absorventes. Quando essas moléculas absorventes, como a tartrazina, um corante aprovado pela FDA comumente usado em alimentos, se dissolvem em água, elas modificam o índice de refração do meio aquoso por meio das relações Kramers-Kronig. Essa modulação permite a redução da incompatibilidade do índice de refração entre componentes separados no tecido com índices de refração distintos, mitigando assim o espalhamento. Este artigo relata a metodologia detalhada da técnica de limpeza tecidual usando uma solução aquosa à base de Tartrazina, aplicada a amostras ex vivo e in vivo . Essa abordagem torna reversivelmente os corpos de camundongos vivos transparentes no espectro visível, permitindo imagens mais claras e profundas de processos e estruturas internas. Um algoritmo avançado de processamento de imagem foi então usado para melhorar o contraste e a segmentação dos órgãos de interesse. Além disso, é demonstrada alta transparência em amostras ex vivo , como peito de frango, tratado com solução à base de tartrazina. Este método oferece uma abordagem versátil e acessível para aprimorar os recursos de imagem em várias modalidades e abre caminho para o avanço na compreensão de sistemas biológicos complexos.

Introdução

A imagem biológica há muito é desafiada pela dispersão da luz, que obscurece as estruturas de interesse1. As técnicas de limpeza óptica visam reduzir a dispersão da luz e aumentar a clareza visual, permitindo a visualização de estruturas anteriormente ocultas2. O desenvolvimento dessas técnicas levou a uma gama diversificada de métodos projetados para melhorar a imagem óptica de tecidos biológicos ex vivo, mesmo de animais inteiros, sem dissecção física das amostras3. No entanto, o desenvolvimento de técnicas semelhantes para aplicações in vivo tem sido desafiador. Técnicas como CLARITY Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel), oferecem imagens de alta resolução, mas carecem de reversibilidade, tornando-as inadequadas para estudos com animais vivos4. Constantini et al. mostraram um progresso mais lento na imagem in vivo em comparação com a clareza da imagem ex vivo, o que se deve à complexidade de manter a viabilidade do tecido, evitando níveis tóxicos de agentes necessários para a transparência do tecido5. Genina enfatiza o futuro da limpeza óptica do tecido como dependente de métodos não invasivos e reversíveis6. Estudos recentes demonstraram a eficácia de corantes absorventes solúveis em água para limpeza óptica in vivo. Por exemplo, Miller et al. mostraram que a aplicação tópica de tartrazina aumentou significativamente a profundidade da imagem em OCT e microscopia fotoacústica (PAM) de pele de camundongo viva, reduzindo o espalhamento e aumentando o índice de refração dos componentes do tecido intersticial7. Jia et al. usaram uma solução de tartrazina a 15% p / p para melhorar a imagem PAM in vivo da orelha de camundongo e do tecido abdominal, revelando estruturas microvasculares finas com resolução subcelular que estavam obscurecidas8. Zuo et al. demonstraram ainda imagens cerebrais através do couro cabeludo e crânio intactos em camundongos vivos usando 0,6 M Tartrazina, alcançando intensidade de sinal quatro vezes maior e resolução 3,5 vezes melhor em comparação com o tecido não tratado9. Em outra aplicação, Narawane et al. permitiram imagens transesclerais profundas de OCT em olhos suínos aplicando Tartrazina, obtendo uma visualização clara do espaço supracoroidal, que antes era inacessível devido ao forte espalhamento escleral10. Embora os métodos de limpeza de tecidos ex vivo, como CLARITY e iDISCO (imagem tridimensional habilitada para imunomarcação de órgãos eliminados com solvente), alcancem alta transparência óptica e resolução subcelular por meio da remoção de lipídios ou limpeza à base de solvente, eles geralmente são inadequados para imagens in vivo com animais vivos 4,11,12. Essa limitação afeta a imagem dinâmica, que é crucial para imagens biomédicas de processos dinâmicos dentro de animais vivos, como desenvolvimento de doenças e terapêutica.

Moléculas absorventes com alta solubilidade aquosa e formas distintas de banda de absorção, como a tartrazina, um corante de grau alimentício, oferecem vantagens promissoras para alcançar transparência óptica em animais vivos13. Ao introduzir especificamente a tartrazina, o tecido absorve seletivamente os comprimentos de onda ultravioleta e azul devido às características espectrais exclusivas do corante, resultando em um perfil de índice de refração modificado que reduz o espalhamento em comprimentos de onda mais longos. Essa técnica de limpeza óptica de tecido contra-intuitiva é otimizada para imagens in vivo, e as relações Kramers-Kronig fornecem uma base científica para a transparência observada ao usar moléculas fortemente absorventes como a tartrazina14,15. Para imagens in vivo, a tartrazina é combinada com partículas de agarose aquecidas e água para criar uma solução coesa que adere melhor à pele. A natureza solúvel em água da tartrazina também facilita a fácil remoção da solução à base de corante de animais vivos, reduzindo os efeitos potenciais da exposição prolongada a soluções de corantes. Além disso, o método foi adaptado para várias aplicações biomédicas para melhorar a profundidade, a resolução e a sensibilidade da imagem, incluindo tomografia de coerência óptica 7,16 e imagem fotoacústica 7,9, demonstrando seu potencial para a comunidade de imagens biomédicas mais ampla.

Com o crescente interesse na aplicação de moléculas absorventes em imagens biomédicas17,18, o protocolo apresenta um procedimento detalhado de utilização de corante alimentar para aplicações ex vivo e in vivo, juntamente com processamento de imagem e imagem in vivo reversível. Este protocolo é aplicado ao tecido peitoral de frango para demonstrar transparência ex vivo e é então modificado para imagens in vivo da cabeça e do abdômen de camundongos, mostrando reversibilidade. Uma solução aplicada à pele de camundongo in vivo cria transparência temporária e reversível sem prejudicar a integridade da pele ou do tecido. Essa técnica pode ser integrada a um pipeline de processamento de imagem, incluindo redução de ruído, para criar um protocolo de imagem otimizado para imagens ópticas in vivo de órgãos internos. Quando combinadas, essas técnicas permitem melhores imagens longitudinais não invasivas para observações em tempo real de processos biológicos. O uso de agentes mais seguros que demonstram reversibilidade supera as limitações anteriores e fornece um método mais adequado para imagens biológicas dinâmicas.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais conduzidos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Texas em Dallas, de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais. O código de processamento de imagem está disponível no Github: https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1. Preparação da solução de tartrazina

  1. Para amostras ex vivo
    1. Para preparar soluções de corante, calcule a massa necessária de pó de corante (Tartrazina) para preparar o volume desejado da solução. Use a fórmula:
      Massa (g) = Molaridade (M) × Peso Molecular (g/mol) × Volume (L)
      NOTA: Para calibrar a molaridade real, meça a absorbância das soluções preparadas usando um espectrômetro UV-VIS e aplique a Lei de Beer-Lambert19.
      CUIDADO: Use uma balança analítica para pesar a quantidade exata do pó. Use EPI (equipamento de proteção individual) apropriado, incluindo jaleco, luvas e óculos de segurança, ao trabalhar com corantes em pó. Evite inalação ou contato com a pele.
    2. Transfira o pó de corante para um frasco de vidro limpo e adicione o volume necessário de água deionizada (DI) usando uma pipeta volumétrica para garantir a precisão volumétrica.
    3. Se o pó não se dissolver totalmente à temperatura ambiente, coloque o frasco para injetáveis de vidro num forno de laboratório ou forno pré-aquecido a 40 °C e aqueça durante 10 min ou até que o pó esteja completamente dissolvido (Figura 1A).
      NOTA: As soluções de baixa molaridade são completamente solúveis à temperatura ambiente e permanecem na forma líquida, enquanto as soluções de alta concentração (>0,37 M) requerem aquecimento.
      CUIDADO: O aquecimento excessivo evapora a água e altera a concentração real da solução.
    4. Mexa no misturador de vórtice por 30 s a 1 min para garantir a dissolução completa.
    5. Para preparar uma solução 0,65 M, dissolver 427,5 mg de pó de tartrazina em 1 mL de água DI19. Para outras concentrações, consulte a Tabela 1.
      NOTA: Descarte as soluções de corantes não utilizadas e os materiais contaminados de acordo com os procedimentos padrão de descarte de resíduos químicos.
  2. Para amostras in vivo
    1. Calcule a massa necessária de micropartículas de agarose de baixa temperatura de fusão e tartrazina para preparar uma concentração de 0,65 M com solução de hidrogel de agarose a 0,4% (4 mg / mL).
      NOTA: Siga as precauções de segurança padrão descritas na etapa 1.1.1 ao manusear todos os reagentes.
    2. Transfira os pós pesados para um frasco de vidro limpo. Adicione água DI usando uma pipeta volumétrica.
    3. Coloque o frasco para injetáveis num forno de laboratório ou forno pré-aquecido a 75 °C durante aproximadamente 10-15 min ou até que as partículas de agarose estejam completamente dissolvidas.
    4. Ocasionalmente, misture usando um misturador de vórtice durante o processo de aquecimento para uma dissolução uniforme.
    5. Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente antes de usar. Se solidificar na forma de gel, use o misturador de vórtice por 30 s para liquefazê-lo novamente.
    6. Para preparar uma solução de hidrogel 0,65 M, dissolva 427,5 mg de pó de tartrazina e 4 mg de agarose em 1 mL de água DI. Para preparar soluções de outras concentrações, mantenha a concentração de agarose em 0,4% (4 mg / mL) e consulte a Tabela 1 para a massa de Tartrazina correspondente17.

2. Limpeza óptica de tecidos ex vivo

  1. Preparação da amostra
    1. Para preparar o tecido ex vivo , corte o tecido do peito de frango na espessura desejada paralelamente às fibras de colágeno.
    2. Limpe o tecido fatiado suavemente com água.
    3. Meça a espessura colocando o tecido entre duas lâminas de microscópio limpas. Pressione suavemente as lâminas e use um paquímetro para medir a distância entre as lâminas no centro do tecido.
    4. Mergulhe o tecido na solução de corante.
      CUIDADO: Certifique-se de que o volume da solução seja maior que o volume da amostra e que o tecido esteja completamente submerso.
    5. Coloque o recipiente em um agitador orbital e agite a 100 rotações por minuto por 10 min.
    6. Deixe o tecido permanecer na solução por 60 min em temperatura ambiente para baixas concentrações ≤0,4 M e a 40 ° C para concentrações mais altas >0,4 M.
  2. Imagiologia
    1. Remova o tecido da solução de corante usando uma pinça limpa.
    2. Coloque a amostra entre duas lâminas de vidro transparente e capture as imagens usando uma câmera digital ou científica com configurações apropriadas de resolução e ampliação.
    3. Conduza o processo de imagem em um ambiente de luz controlada para minimizar a interferência de luz externa.
    4. Repita o processo de imagem para amostras de tecido com diferentes espessuras e concentrações de solução corante (Figura 2B).
      NOTA: Use uma fonte de luz LED para iluminação traseira. No entanto, também funciona exatamente da mesma maneira para uma fonte de luz de iluminação superior.
  3. Medições de transmissão óptica
    1. Para medir a transmissão óptica, coloque o tecido de frango entre duas lâminas de vidro transparente e meça a transmissão usando um espectrômetro UV-Visible-NIR (Figura 2C).
    2. Certifique-se de que o sistema seja revestido adequadamente e que o feixe de luz passe pela mesma região do tecido antes e depois de tratá-lo com soluções de corante para manter a consistência.
      NOTA: Registre os espectros de transmissão em uma faixa de comprimento de onda de 400 nm a 2000 nm, usando uma velocidade de varredura média e um intervalo de dados de 1.0 nm. A varredura espectral completa leva aproximadamente 5 minutos por amostra.

3. Transparência óptica em animais vivos

  1. Preparação animal
    1. Antes do experimento, meça o peso do animal e anote o nível geral de atividade para estabelecer uma linha de base fisiológica.
    2. Use uma almofada de aquecimento com a temperatura ajustada para 37 °C para manter a temperatura corporal do animal durante o experimento.
      CUIDADO: Monitore continuamente o animal para evitar superaquecimento.
    3. Administrar anestesia (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) para imagens ópticas de animais vivos com base em locais de imagem. Para imagens abdominais, use anestésicos inalatórios para recuperação rápida e anestesia injetável para imagens cerebrais.
    4. Para anestesia inalatória, induza com isoflurano a 1,5%-3% e vazão de 0,8 L/min por aproximadamente 5 min antes do experimento de imagem e mantenha-o em 1%-2% durante todo o experimento.
      CUIDADO: Monitore continuamente o padrão e a profundidade da respiração do animal. Use uma área bem ventilada para minimizar a exposição anestésica ao pessoal.
    5. Para anestesia injetável, prepare um coquetel contendo cetamina HCL (16 mg / mL) e dexmedetomidina HCL 0,2 mg / mL. Dose de acordo com o peso do animal e protocolos institucionais aprovados.
    6. Apare o pelo usando tesouras de pequenos animais da área de imagem desejada.
    7. Aplique creme depilatório na área da pele aparada por menos de 60 s para remover os pelos residuais. Remova imediatamente o creme e limpe a pele com lenços umedecidos com álcool para evitar irritação da pele.
    8. Use Atipamezol como medicamento de reversão para anestesia injetável após o experimento. Monitore o animal durante a recuperação e certifique-se de que ele retorne à respiração e mobilidade normais antes de retornar à gaiola de origem.
  2. Procedimento para tornar o tecido transparente
    1. Prepare a configuração de imagem colocando uma almofada de aquecimento ajustada a 37 ° C abaixo do animal para evitar hipotermia. Alinhe a fonte de luz e a câmera para capturar as imagens.
    2. Use uma solução de hidrogel de tartrazina 0,65 M misturada com gel de agarose 0,3% a 0,4% para aplicação (etapa 1.2).
    3. Aplicar a solução na pele (barriga ou cabeça, consoante a natureza da experiência) com um conta-gotas e deixar repousar durante alguns segundos para iniciar a absorção (figura 3A).
    4. Esfregue suavemente a área usando um cotonete para uma distribuição uniforme da solução de corante e facilitar a absorção dérmica.
    5. Massageie a área suavemente com um cotonete limpo e aplique mais solução até que a pele comece a mostrar transparência e os órgãos internos fiquem visíveis. Durante a absorção, a pele mostrará primeiro a aparência de pontos vermelho-alaranjados, que gradualmente se fundem em uma cor uniforme. Essa mudança de cor é um indicador visual chave da penetração adequada do corante e do início da limpeza óptica.
      CUIDADO: Certifique-se de que a solução não cristalize sobre a área de aplicação - a cristalização pode bloquear as passagens da pele, dificultando a absorção das moléculas do corante na pele, o que é altamente crucial para obter transparência. A absorção suficiente de moléculas de corante transforma a cor da pele em vermelho-alaranjado.
    6. Continue massageando a área suavemente até que a pele comece a mostrar transparência e os órgãos internos se tornem visíveis. Esse processo normalmente leva aproximadamente 3-5 minutos de massagem para uma pequena área, mas a duração pode variar dependendo do tamanho do animal e da espessura da pele.
    7. Capture imagens usando a câmera alinhada. Ajuste o foco, a exposição e o balanço de branco para otimizar a qualidade da imagem.
    8. Coloque suavemente uma lâmina de vidro ou lamínula na pele para minimizar o brilho e reduzir o reflexo para obter imagens de melhor qualidade.
      CUIDADO: Manuseie todas as soluções químicas com equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, luvas e proteção para os olhos) e descarte os materiais usados de acordo com os protocolos de descarte de resíduos químicos da instituição.

4. Aumentando a visibilidade do órgão com processamento de imagem

  1. Etapas de processamento de imagem
    1. Python com OpenCV é usado para processamento de imagens. Importe OpenCV, numpy, matplotlib e PyWavelets.
    2. Carregue e normalize a imagem original. Carregue a imagem original de .tif de alta profundidade de bits. Se algum valor de pixel exceder 255, normalize todos os pixels para o intervalo [0, 255].
    3. Cortar a região de interesse (ROI). Invoque o seletor de ROI do OpenCV para desenhar uma caixa delimitadora ao redor da área do órgão. Prossiga usando apenas a versão cortada para todas as etapas subsequentes.
      NOTA: Certifique-se de que a caixa delimitadora envolva firmemente a área de destino sem cortar nenhuma estrutura relevante.
    4. Dividido em canais LAB. Converta a imagem colorida cortada em espaço de cores LAB e divida em L(luminosidade), A e B
      NOTA: As imagens estão sendo processadas em cores, portanto, o espaço de cores do laboratório foi usado com técnicas de processamento de imagem aplicadas apenas ao canal L, onde as intensidades de pixel estão localizadas.
    5. Analise a distribuição de intensidade de pixels. Plote um histograma do canal L para avaliar a dispersão do contraste e da intensidade.
      NOTA: Use o histograma para verificar se o aprimoramento de contraste é necessário e para orientar a seleção de parâmetros para aprimoramento de contraste. Você deseja que seu histograma seja espalhado por [0, 255].
    6. Aplique CLAHE (Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization) para aprimoramento de contraste local. Crie um objeto CLAHE com clipLimit = 5.0 e tileGridSize = (16,16). Execute CLAHE no canal L e mescle o canal L aprimorado por CLAHE com os canais A e B originais. Converta CLAHE de LAB para RGB para visualização, se necessário.
      NOTA: Se o histograma mostrar ruído superamplificado (picos), ajuste 'clipLimit' ou 'tileGridSize' e reaplique para obter um contraste local equilibrado.
    7. Reduza o ruído da imagem com contraste aprimorado. Execute uma decomposição wavelet discreta de 2 níveis no canal CLAHE L normalizado (dimensionado [0, 1]) com um limite suave de 0,1. Reconstrua o canal L com redução de ruído, reduza para [0, 255] e mescle o canal L com redução de ruído com os canais A e B originais. Exiba a imagem colorida recortada original versus o resultado sem ruído wavelet.
      NOTA: A redução de ruído de wavelet reduz pequenas flutuações que podem ser mal interpretadas como primeiro plano em regiões uniformes.
    8. Segmente órgãos de interesse por meio do Limiar Adaptativo de Otsu. Calcule o limite de Otsu no canal L sem ruído. Subtraia um desvio de 15 do limite para incluir regiões de órgãos de baixa intensidade.
      1. Aplique um limite binário com o valor de desvio para obter uma máscara dos pixels do órgão. Mescle a máscara com os canais A e B originais e converta para RGB para visualização.
        NOTA: O ajuste de polarização força a inclusão de regiões de órgãos abaixo dos vasos. Ajuste novamente o viés, se necessário, para um conjunto de dados diferente.
    9. Prossiga para a análise conforme desejado.

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Resultados

Demonstração da transparência óptica em tecido peitoral de frango ex vivo
Para investigar a propagação da luz através do tecido ex vivo , usamos pedaços fatiados de peito de frango desossado cru com espessuras de 1,5 mm, 2,5 mm e 3,5 mm (Figura 2B). Os tecidos foram cortados paralelamente às fibras colágenas, garantindo uma orientação consistente das fibras musculares. As imagens foram t...

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Discussão

Este trabalho apresenta um método de protocolo abrangente e reprodutível para obter transparência óptica em tecidos biológicos utilizando moléculas absorventes, especificamente o corante alimentar Tartrazina aprovado pela FDA (aprovado para uso em produtos alimentícios, não em aplicações médicas). Este método minimiza efetivamente o espalhamento intrínseco no tecido, alterando o índice de refração dentro do microambiente do tecido, o que aumenta a transparência óptica. Este estudo demons...

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Divulgações

Todos os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

ZO reconhece o apoio da Universidade do Texas em Dallas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Balança AnalíticaHZKFA220S
Máquina de anestesia animalRWD ciências da vida coTAIJI-IEAnestésicos inalatórios
Injeção de Atipamezol HCL 5 mg / mLCovertus82124Anestesia injetável
Câmera CMOSLaboratórios ThorCS165CU/M, Zelux
Injeção de dexmedetomidina HCL 5 mg / 10 mLCovertus72960Anestesia injetável
Iluminador de luz de fibraRWD ciências da vida co76301Fonte de luz para iluminação superior
Lâminas de vidroCravitySci0303-2122Lâminas de microscópio de super grau
Cobertor HomeotérmicoRWD ciências da vida co69027Controlador de temperatura para animais
Processamento de imagemOpenCVPitãoSoftware
Seringa de insulina 0,5 mL 29 gPonto de conforto26028Anestesia injetável
IsofluranoCovertus029405 de referênciaAnestésicos inalatórios
Injeção de Ketmine HCL 100 mg / mLDechra20042240Anestesia injetável
Fonte de luz LEDGGE CorpTLB-01Fonte de luz para iluminação superior
LenteLaboratórios ThorMVL4WADistância focal de 3,5 mm e abertura f/1.4
NevesIgreja e DwightL 1224Creme depilatório
PBS ph 7,4 (1x)Gibco2902869Anestesia injetável
Ponta QEmpresa puritana de produtos médicosHospital 806-WC
SeaPlaque AgaroseLonza50101Químico
TartrazinaMilliporeSigmaNúmero CAS: 1934-21-0Químico
Pipeta de transferênciaMarca de pescador13-711-9AMMD
Espectrofotômetro UV-VIS-NIRShimadzuEspecificações sólidas-3700iInstrumento
FrascosQorpak242633
Pipetas volumétricasEppendorf research plus3123000063100-1000 e micro; L
Sistema de purificação de águaCiência da avidezSOLO SInstrumento

Referências

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