Técnica de injeção sub-retiniana transescleral minimamente invasiva otimizada em camundongo

Resumo

As injeções sub-retinianas são uma técnica indispensável para o desenvolvimento pré-clínico de terapêuticas para doenças fotorreceptoras e EPR. Descrevemos uma técnica de injeção sub-retiniana transescleral otimizada em camundongos que melhora as taxas de sucesso intraoperatório e minimiza os danos à retina.

Resumo

O método convencional de entrega de material ao espaço sub-retiniano no camundongo envolve perfuração dupla da retina neural, o que causa danos cirúrgicos extensos. Isso leva à variabilidade nas medidas de resultados subsequentes da função visual, como registros de eletrorretinograma (ERG) ou ensaios de visão comportamental, que confundem as avaliações de eficácia da terapêutica experimental. Para superar essas barreiras, otimizamos uma técnica de injeção sub-retiniana minimamente invasiva transescleral em camundongos. Nesta técnica, o fórnice superior é acessado usando um espéculo palpebral de fio de tungstênio feito sob medida para realizar a peritomia conjuntival e a tenotomia. Uma esclerotomia pontual é feita usando uma faca de diamante sem penetrar na retina, através da qual uma agulha de vidro fino é cuidadosamente inserida em um ângulo raso. A carga útil é entregue ao espaço sub-retiniano usando uma bomba de microinjeção. A tomografia de coerência óptica (OCT) é usada para avaliar o tamanho e a posição da bolha sub-retiniana imediatamente após a injeção. Comparamos os resultados dessa técnica com o método transretiniano convencional realizado com seringa de mola com esclerotomia com agulha 33G. As gravações de ERG indicaram excelente preservação da função retiniana em camundongos injetados por via transescleral, comparável à de camundongos controle não injetados. Em contraste, uma redução apreciável do sinal ERG foi observada nas coortes injetadas convencionalmente. Em resumo, otimizamos uma técnica minimamente invasiva para injeção sub-retiniana em camundongos. Demonstramos que esta técnica é um método robusto e eficiente para administração de terapia gênica que minimiza o dano anatômico à retina e tem impacto mínimo na função retiniana. Este método reduz o limiar para o desenvolvimento de terapias direcionadas ao epitélio pigmentado da retina e aos fotorreceptores para tratar uma ampla gama de doenças retinianas e maculares.

Introdução

A injeção sub-retiniana é um procedimento cirúrgico ocular no qual o material é entregue ao espaço potencial entre a retina e o epitélio pigmentado da retina (EPR). Em comparação com outros métodos de administração de medicamentos no segmento posterior, como injeções intravítreas ou supracoroidais, as injeções sub-retinianas alcançam o acesso mais imediato aos fotorreceptores e ao EPR. Para a entrega de partículas de terapia gênica viral, a injeção sub-retiniana atinge taxas muito mais altas de transdução de fotorreceptores e RPE, o que permite títulos virais mais baixos e risco reduzido de toxicidade viral¹. Além disso, o espaço sub-retiniano é anatomicamente confinado, limitando a disseminação sistêmica de partículas virais e diminuindo o risco de respostas imunes². Em humanos, o perfil de segurança das injeções sub-retinianas é muito favorável, com a estrutura e a função da retina se recuperando aos níveis basais dentro de 1 mês após a injeção ^3,4. As injeções sub-retinianas são usadas em várias aplicações, como transplante de células-tronco e administração de medicamentos de moléculas pequenas², sendo seu uso mais comum a entrega de vetores virais para tratamentos de terapia gênica de doenças da retina. Os títulos virais relativamente baixos, a exposição sistêmica mínima e a alta taxa e especificidade de transdução associadas às injeções sub-retinianas as tornaram uma técnica indispensável no campo da retina. As injeções sub-retinianas são usadas com sucesso em pacientes para o tratamento de distúrbios hereditários da retina, incluindo retinite pigmentosa e amaurose congênita de Leber ^5,6.

Dada a sua importância para o campo, a capacidade de realizar injeções sub-retinianas em camundongos é crucial para estudos pré-clínicos que investigam terapias para doenças hereditárias da retina. No entanto, os métodos atuais para injeções sub-retinianas em camundongos têm altas taxas de falha e muitas vezes causam danos cirúrgicos à retina, o que pode limitar a confiabilidade e a consistência das medidas de resultados funcionais. Convencionalmente, as injeções sub-retinianas em roedores são realizadas por via trans-retinal, de modo que a agulha penetre na retina anterior, passe pelo cristalino e entre no espaço sub-retiniano como resultado de uma segunda penetração da retina ^7,8 (Figura 1A). Embora relativamente fácil de executar, esse procedimento introduz inconsistência acentuada nos resultados experimentais devido à extensão variável do dano cirúrgico. Isso é particularmente limitante para estudos que utilizam medidas de resultados de visão comportamental e funcional. Além disso, o cristalino é desproporcionalmente grande em camundongos em comparação com humanos; Isso aumenta significativamente o risco de danos ao cristalino durante a injeção transretiniana, tornando o animal inutilizável para avaliações funcionais^{da visão 4}.

Uma opção alternativa é a via de injeção transescleral, que evita esses problemas acessando o espaço sub-retiniano por via posterior, onde a agulha penetra na esclera, coroide, membrana de Bruch e EPR ^4,9 (Figura 1B). Essa abordagem minimiza os danos à retina, evitando completamente a penetração na retina. Também está associado à redução do refluxo de material injetado do espaço sub-retiniano¹⁰, o que permite resultados mais consistentes e coortes experimentais menores. Embora a técnica de injeção sub-retiniana transescleral em camundongos tenha sido descrita anteriormente na literatura, sua ampla adoção permanece limitada por sua dificuldade técnica, o que pode impedir a taxa de sucesso⁴. Aqui, descrevemos várias melhorias no procedimento de injeção transescleral, que o tornam mais fácil e rápido de realizar, reduzem a variabilidade experimental e melhoram as taxas de sucesso da injeção. Essas melhorias incluem o desenvolvimento de um espéculo palpebral de camundongo, administração pré-operatória de atropina, criação de uma esclerotomia pontual usando uma faca de diamante e otimização do tamanho da agulha e da abordagem de injeção. Essa técnica alcança excelente cobertura de transdução viral dos fotorreceptores e do EPR, sem causar nenhum impacto cirúrgico detectável pelo ERG.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Duke University e a Declaração da Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e de Visão.

1. Preparação animal

1. Administre uma injeção intraperitoneal de 1 mg/kg de atropina (em um volume total de 50 μL) 30 minutos antes de realizar a injeção sub-retiniana. Essa etapa aumenta muito as taxas de sucesso, prevenindo reflexos oculocardíacos e oculorespiratórios potencialmente letais desencadeados pela elevação transitória da pressão intraocular durante a injeção^11,12.
   NOTA: Nossa dosagem de atropina é otimizada para camundongos C57BL/6 e pode precisar ser ajustada para outras cepas de camundongos. Não observamos diferenças apreciáveis de sexo ou idade na dosagem de atropina.
2. Durante todo o procedimento, mantenha o mouse em uma superfície quente para maximizar o conforto do animal e reduzir o desenvolvimento de catarata fria.
3. Anestesiar o camundongo com isoflurano inalado a 2% em oxigênio (2 L/min) até que a decúbito seja observada e o animal não responda mais ao beliscão do dedo do pé. Aplique uma gota de proparacaína a 0,5% no olho para anestesia tópica.
4. Aplicar uma gota da mistura de ciclopentolato a 0,2% e fenilefrina a 1% no olho para dilatar a pupila para imagens pós-operatórias da bolha sub-retiniana por OCT. A fenilefrina também serve para reduzir o sangramento intraoperatório por meio da constrição dos vasos sanguíneos superficiais¹³.

2. Esclerotomia

1. Antes de iniciar o procedimento, coloque uma microagulha de vidro com o volume desejado de solução a ser injetada. Encaixe a agulha no microinjetor, com pressão de compensação ajustada em 5 hectopascais (hPa) para neutralizar a ação capilar. Normalmente usamos volumes de 1 μL para injeções sub-retinianas.
2. Coloque o mouse sob um estereomicroscópio de dissecação. Use a ampliação de 20x para as etapas 2.3 a 2.6 e a ampliação de 50x para as etapas 2.7 a 3.5.
3. Para camundongos jovens, realizar cantotomia lateral antes do procedimento, a fim de fornecer amplo acesso e visualização do local cirúrgico.
4. Exponha o fórnice superior com a ajuda de um espéculo de arame em miniatura feito sob medida (Figura 1C). Imobilize o espéculo para permitir a retração da pálpebra superior com as mãos livres.
5. Usando uma tesoura Vannas angulada, faça uma incisão paralímbica (~ 1 mm posterior ao limbo) na conjuntiva superior e na cápsula de Tenon para expor as 3-4 horas superiores da esclera. Tome cuidado para evitar perfurar o seio venoso retro-orbital. Remova quaisquer restos da cápsula de Tenon que recobrem o local de injeção pretendido com cuidado mas completamente.
6. Segure a borda anterior da peritomia conjuntival e tenotomia com pinças dentadas bloqueadas e inferoduto o globo suavemente para expor a esclera superior. Imobilize a pinça travada para permitir a inferodução sem as mãos.
7. Aplique uma gota de solução salina tamponada balanceada (BSS) imediatamente no olho para evitar que a esclera nua seque. Também achamos útil a ampliação óptica produzida pela gota BSS.
8. Usando uma faca de diamante, faça uma esclerotomia precisa a ~ 12 horas e ~ 1-2 mm do limbo. Posicione a lâmina em um plano tangencial em relação à esclera para garantir que a esclerotomia seja o menor e rasa possível.
   NOTA: Isso é feito por dois motivos: (1) uma pequena esclerotomia permite um ajuste apertado da agulha de vidro, reduzindo assim o refluxo durante a etapa de injeção, e (2) uma esclerotomia superficial é fundamental para evitar penetrar na retina. Observe que uma pequena quantidade de sangue coroidal pode aparecer no local da esclerotomia, o que não conota nenhuma implicação negativa para o resultado do procedimento.

3. Injeção sub-retiniana transescleral

1. Na preparação para a injeção, use uma esponja cirúrgica para remover suavemente toda a BSS da superfície do olho.
2. Segure o chanfro da agulha em um ângulo raso em relação à esclera e introduza a ponta lenta e cuidadosamente na esclerotomia para acessar o espaço sub-retiniano. Para evitar penetrar na retina, faça isso em um ângulo relativamente raso e profundo o suficiente para limpar a abertura da esclerotomia em 0,5-1 mm.
   NOTA: O bisel da agulha é posicionado para baixo para minimizar a possibilidade de entrega coroidal e reduzir a probabilidade de punção da retina com a ponta da agulha em avanço.
3. Enquanto segura a agulha em posição estável, inicie a injeção a 500 hPa usando um pedal e mantenha uma pressão ininterrupta por 15 s.
4. Para terminar a injeção, mantenha a pressão de injeção até que a agulha seja completamente removida da esclerotomia. Se a pressão for interrompida prematuramente enquanto a agulha ainda estiver no espaço sub-retiniano, uma grande parte da carga útil injetada pode sair rapidamente do olho de volta para a agulha por ação capilar.
5. Uma vez retirada a agulha, observe um refluxo parcial da solução injetada através do local da esclerotomia. Isso é esperado, uma vez que o volume de 1 μL excede a capacidade do espaço sub-retiniano mesmo em camundongos adultos. A ausência de refluxo pode indicar uma falha na injeção devido à administração coroidal ou intravítrea inadvertida.
6. Remova a pinça de travamento e o espéculo da pálpebra do olho. Tome cuidado para evitar aplicar pressão no globo, pois isso pode causar mais refluxo da solução injetada.
7. Imediatamente após a injeção, aplique uma pomada lubrificante suficiente no olho para permitir a visualização da bolha sub-retiniana até¹⁴ de outubro.
8. Aplique pomada tópica de eritromicina no olho e forneça cuidados gerais pós-operatórios ao animal.

Resultados

Uma injeção bem-sucedida usando esta técnica transescleral gera uma bolha sub-retiniana observável na OCT imediatamente após o procedimento de injeção (Figura 2A). Dado o desafio técnico desta técnica, a etapa de imagem é indispensável para identificar animais injetados com sucesso. Para pesquisadores que planejam usar essa técnica para experimentos de terapia genética, recomendamos a realização de injeções práticas com partículas de vírus adeno-associados (AAV) carregando um gene repórter f...

Discussão

A técnica descrita aqui introduz várias melhorias na abordagem de injeção transescleral^{descrita anteriormente 4}, o que aumenta a confiabilidade do procedimento e reduz ainda mais os danos cirúrgicos ao olho. Uma dessas melhorias é o uso de um espéculo para retrair a pálpebra superior, permitindo acesso estável, livre e sem as mãos ao olho. Os espéculos comerciais costumam ser mal otimizados, mesmo para camundongos adultos, e totalmente indisponíveis para os juveni...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%, USP	Hospira	PAA130066
Solução oftálmica de sulfato de atropina a 1%, USP	Akorn	NDC 17478-215-05
30° faca de diamante	Katena	K2-6560
Iluminador duplo de pescoço de ganso LED AmScope 6W	AmScope	LED-11CR
Tesoura Vannas angulada	Roboz	RS-5618
Solução de irrigação estéril BSS	Alcon	289010-0902
Colírio dilatador de ciclomidril	Alcon	0065-0359-02	0,2% ciclopentolato, 1% fenilefrina
Ponteiras de pipeta epT.I.P.S. MicroloaderTM	Eppendorf	5242 956.003
Microinjetor FemtoJet 4i	Eppendorf	E5252000021	Produto descontinuado
GenTeal Tears pomada lubrificante para os olhos	Alcon	16027802
Agulhas de microinjeção de vidro	Clunbury Científica	B100-58-50	30° bisel. Diâmetro: 50 µ m externo, 29 µ m interno
Solução de isoflurano	Covetrus	29405
Microscópio de imagem da retina MICRON IV com OCT guiada por imagem	Phoenix	N/A
estereomicroscópio SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Pinça dentada de travamento Stern-Castroviejo	Katena	K5-2552
Pinça dentada	Roboz	RS-5172
Fios de limpeza de tungstênio para agulhas de calibre 23s	Hamilton	18306
Lanças de Olho Ultracell PVA	BVI Médico	40400-8
Seringas de insulina Ultra-Fine2015	BD	328438	3/10 mL, 8 mm (5/16"), 31G