Artigo de método

Destacando a transição do citocromo C mitocondrial por microscopia eletrônica de imunotransmissão

DOI:

10.3791/68633

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15 de agosto de 2025

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1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O protocolo descreve métodos para estudar alterações micromorfológicas em neurônios e a transição do citocromo c mitocondrial por microscopia eletrônica de imunotransmissão.

Resumo

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As mudanças na localização das proteínas na microestrutura geralmente apresentam um mecanismo de regulação preciso no nível das organelas patológicas. Como capturar com precisão a localização dessa transferência de proteína de organela tem significado e valor positivos para o diagnóstico e tratamento de doenças. As mitocôndrias desempenham um papel central na necrose e na via intrínseca da apoptose. Em condições normais, o citocromo c (Cyt c) só existe entre as membranas interna e externa das mitocôndrias e no núcleo. Quando as células sofrem apoptose, a permeabilidade da membrana interna mitocondrial é alterada e Cyt c é liberado das mitocôndrias para o citoplasma. Neste estudo, foi estabelecido um modelo de lesão de isquemia-reperfusão cerebral em ratos, e as alterações micromorfológicas dos neurônios submetidos à apoptose foram demonstradas por microscopia eletrônica de imunotransmissão. Além disso, mostra a visão da marcação de imunoouro Cyt c transferindo da matriz mitocondrial para o citoplasma após lesão de isquemia-reperfusão cerebral com mais precisão. A técnica de microscopia eletrônica de imunotransmissão apresentada neste protocolo é adequada para a demonstração de quaisquer transições de posição de proteínas no nível microscópico.

Introdução

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De acordo com o estudo de carga global de doenças de 2021, o AVC foi a3ª principal causa de morte e a4ª principal causa de anos de vida ajustados por incapacidade. Houve 11,9 milhões de novos eventos de AVC, nos quais o AVC isquêmico constituiu 65,3% (7,8 milhões)1. A morte neuronal ocorre após isquemia cerebral, incluindo necrose e apoptose. O tecido cerebral mais gravemente afetado sofre subsequentemente a morte celular necrótica. Os neurônios na penumbra isquêmica ou na zona periinfarto podem sofrer apoptose após várias horas ou dias2. Além das funções bioenergéticas e metabólicas, as mitocôndrias também desempenham um papel central na via intrínseca da apoptose 3,4,5,6.

Cyt C é uma proteína codificada por genes nucleares. Em condições normais, o Cyt C existe apenas entre as membranas interna e externa das mitocôndrias e no núcleo. A via apoptótica mediada por sua liberação está associada ao controle regulatório dos membros da família Bcl-2. Após serem estimulados por apoptose, os oligômeros de Bax/Bak são formados e inseridos no poro da membrana externa mitocondrial, resultando em alterações na pressão osmótica mitocondrial e perda do potencial transmembrana. Cyt C é liberado da mitocôndria para o citoplasma, onde se liga ao ativador da apoptose 1 para formar o complexo apoptótico e ativar a pró-caspase-9. Por sua vez, a caspase-3 e a caspase-7 são ativadas, o que inicia a cascata da caspase e induz a apoptose celular7.

A microscopia eletrônica de transmissão (MET) pode observar claramente as mudanças na estrutura celular em diferentes estágios da apoptose. A observação morfológica da microscopia eletrônica é um método confiável para determinar a apoptose8. No entanto, não pode observar alterações no Cyt C na ultraestrutura. Existem várias técnicas para detectar proteínas específicas na ultraestrutura: citometria de fluxo, ensaio de imunoabsorção enzimática, ensaio de imunoabsorção enzimática, espectrofotometria e Western blotting. No entanto, eles não podem capturar com precisão as mudanças de localização da proteína na microestrutura. O ouro coloidal tem partículas de tamanhos diferentes e a densidade eletrônica do ouro coloidal é alta. A tecnologia Immunogold é particularmente adequada para estudos de localização de rótulo único ou múltiplo de microscopia imunoeletrônica. Devido à sua coloração inerente de vermelho claro a escuro, o ouro coloidal também é passível de observação sob microscopia de luz. Quando proteínas específicas são marcadas com Immunogold, as mudanças de localização podem ser visualizadas por meio de um MET em uma resolução subcelular9.

Este protocolo descreve o destaque da transição do Cyt C mitocondrial por microscopia eletrônica de imunotransmissão (IEM). O objetivo geral deste método é visualizar a translocação subcelular de Cyt C durante a apoptose induzida por isquemia usando IEM. A justificativa para o IEM é marcar Cyt C com ouro coloidal e visualizar suas mudanças de localização na resolução subcelular usando TEM9. O IEM pode observar as mudanças dinâmicas das proteínas no nível espacial, fornecendo um meio poderoso para explicar as atividades fisiológicas e patológicas10.

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Protocolo

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O programa animal foi aprovado pelo Comitê de Ética do SLAS (IACUC Issue No: SYST-2024-018). Aqui, 6 ratos SD machos livres de patógenos (200-220 g) foram criados em gaiolas de ventilação independentes, mantendo o ambiente de laboratório a 22-25 °C e 45%-65% de umidade relativa. Todos os ratos foram submetidos à alimentação adaptativa por 1 semana com água livre e dieta durante o período.

1. Estabelecimento do modelo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO)

  1. Divida aleatoriamente os ratos no grupo MCAO e no grupo de operação simulada, com três ratos em cada grupo. Veja a Figura 1 para o fluxograma experimental.
  2. Verifique o equipamento envolvido neste protocolo de acordo com a lista na Figura 2.
  3. Para estabelecer um modelo de OCM de lesão de isquemia-reperfusão em ratos, utilizar o procedimento de sutura intraluminal.
  4. Jejue os ratos por 12 h antes da cirurgia com água acessível.
  5. Anestesiar ratos SD com isoflurano a 2% (ver Tabela de Materiais) em uma mistura ar-oxigênio a 0,6 L / min. Confirme a anestesia adequada cortando a pele dos membros com fórceps; Os ratos não devem ter retração ou reflexo nas pernas. Prenda os ratos completamente inconscientes na mesa de operação e mantenha a temperatura corporal a 37 °C usando um mantenedor de temperatura animal. Feche os olhos com fita adesiva durante a cirurgia para evitar o ressecamento.
  6. Remova o pelo ao redor do pescoço com um barbeador elétrico e desinfete a pele com betadine. Faça uma incisão no pescoço na linha média de 1.5 cm com tesoura cirúrgica (consulte a Tabela de Materiais), faça dissecção romba no músculo e na fáscia perivascular e exponha a traqueia para localizar a artéria carótida comum direita (ACC), artéria carótida externa (ECA) e artéria carótida interna (ACI). As ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas para prevenir infecções.
  7. Ligue a extremidade distal da ACE com uma sutura cirúrgica 6-0 e coloque outra sutura cirúrgica frouxamente ao redor da extremidade proximal da ACE até o ponto de bifurcação. Tome cuidado para não prejudicar o nervo vago.
  8. Clipe o CCA e o ICA com clipes vasculares e faça uma pequena incisão no ECA entre duas suturas cirúrgicas.
  9. Introduza a sutura de monofilamento no lúmen do ECA em direção ao CCA, aperte a sutura cirúrgica ao redor do coto do ECA para prender a sutura intraluminal e evitar sangramento. Certifique-se de que a sutura de monofilamento corresponda ao peso do animal para minimizar os danos e atingir um volume de infarto alvo de 40% no hemisfério ipsilateral.
  10. Corte a parte restante do ECA para liberar o toco e posicione o coto do ECA abaixo do ponto de bifurcação de forma que fique aproximadamente alinhado com o ICA.
  11. Retirar o clipe microvascular da ACI, continuar avançando a sutura até sentir uma leve resistência, indicando a oclusão da artéria cerebral média; Este comprimento é normalmente em torno de 2 cm. Amarre bem a sutura ao redor do monofilamento. Remova o outro clipe microvascular do CCA.
  12. Feche a incisão com sutura cirúrgica e coloque o rato em uma gaiola de recuperação, cuide do animal por até 2 h pós-isquemia.

2. Restauração do fluxo sanguíneo da artéria cerebral média

  1. Antes da reanestesia, verifique o neuroscore com a Escala de Pontuação Longa para avaliar o sucesso da cirurgia, conforme descrito na etapa 3.
  2. Anestesie o rato como acima e reabra a incisão. Coloque um clipe microvascular no CCA, retire a sutura de oclusão parcialmente da ACI até que a extremidade da sutura seja visível através da ACI.
  3. Coloque outro microclipe na ACI acima do local da sutura intraluminal, remova completamente a sutura de oclusão e amarre o coto da ECA. Reperfusão por 24h.
  4. Remova os clipes do CCA e do ICA. Feche a incisão com uma sutura cirúrgica. Administre buprenorfina (0,05 mg / kg; consulte a Tabela de Materiais) por via subcutânea.
  5. Coloque o rato de volta na gaiola, forneça água e comida amassada e tome cuidado até que ele recupere a consciência. Manter a temperatura corporal dos ratos a 37± 0,5 °C durante todo o procedimento experimental.

3. Avaliação do neuroscore

  1. Pontuação de déficits neurológicos no pós-operatório e 24 h pós-reperfusão usando a Escala de Pontuação Longa11: (0) sem déficit; (1) falha em estender totalmente a pata dianteira esquerda (lado paralisado); (2) circulando para a esquerda (lado paralisado); (3) queda para a esquerda (lado paralisado); (4) sem deambulação espontânea e diminuição da consciência; (5) morto.
    NOTA: Três operadores foram avaliados de acordo com os padrões acima.

4. Coleta de tecido cerebral

  1. Colete tecidos cerebrais 24 h após a reperfusão após a pontuação e avaliação dos déficits neurológicos.
  2. Anestesiar o rato conforme descrito acima. Corte a pele para expor a cabeça e o pescoço e corte o cordão cervical da coluna cervical com uma tesoura cirúrgica (ver Tabela de Materiais).
  3. Separe e remova os músculos posteriores do pescoço. Remova cuidadosamente o crânio com uma pinça curva (consulte a Tabela de Materiais). Preste atenção à dura-máter ao separar o crânio para evitar coçar os tecidos cerebrais. Remova completamente os tecidos cerebrais.
  4. Colocar os tecidos cerebrais em fixadores TEM e IEM pré-arrefecidos a 4 °C e conservar no frigorífico a 4 °C.

5. Operação simulada

  1. Para operações simuladas, execute todos os procedimentos como acima, exceto que a oclusão não é feita.

6. Preparação e imagem ultrafina da seção

  1. Preparação para corte ultrafino TEM
    1. Fixação: Determine o local de amostragem do tecido fresco para minimizar danos mecânicos, como tração, contusão e extrusão, e certifique-se de que a espessura do tecido não exceda 2 mm. Certifique-se de que o volume do tecido não exceda 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Fixar com fixador MET a 4 °C durante 24 h. Lave 3x por 15 min cada em tampão fosfato 0,1 M PB (pH 7,4; consulte a Tabela de Materiais).
    3. Pós-fixação: Adicionar 1% de ácido ósmico · 0,1 M PB (ver Tabela de Materiais) durante 2 h à temperatura ambiente (25 °C).
    4. Desidratação: Desidrate o tecido sucessivamente em etanol a 30% por 10 min, etanol a 50% por 10 min, etanol a 70% por 15 min, etanol a 90% por 15 min, etanol absoluto por 15 min e acetona a 100% por 15 min.
    5. Imersão em goma: Mergulhe os tecidos sucessivamente em solução de resina epóxi SPI-Pon 812: acetona = 1:3 por 30 min, solução SPI-Pon 812: acetona = 1:1 por 30 min e solução SPI-Pon 812: acetona = 3:1 por 1 h (consulte a Tabela de Materiais).
    6. Polimerização e incorporação: Mergulhe a amostra em SPI-Pon 812 puro durante a noite a 37 ° C, mude para SPI-Pon 812 fresco por 8 h e polimerize a 60 ° C por 48 h (consulte a Tabela de Materiais).
    7. Seccionamento: Corte o bloco embutido semi-finamente a 0,8 μm de espessura com uma faca de diamante, core com azul de aminotolueno a 25 °C por 5 min. Localize e selecione áreas com neurônios densamente compactados com um microscópio de luz para observação de alta ampliação. Faça cortes ultrafinos com micrótomo de 90 nm de espessura. Coloque as amostras em grades de cobre revestidas com formvar de 200 malhas (consulte a Tabela de Materiais).
    8. Pós-coloração: Grelhas de coloração em acetato de uranilo a 25 °C durante 15 min, depois grelhas de coloração em citrato de chumbo a 25 °C durante 5 min.
  2. Preparação de seção ultrafina IEM
    1. Execute as etapas 6.1.1-6.1.4.
    2. Imersão em goma: Mergulhe os tecidos sucessivamente em solução L. R. Resina Branca: Etanol = 1: 3 por 2 h, solução L. R. Resina Branca: Etanol = 1: 1 por 2 h e solução L. R. Resina Branca: Etanol = 3: 1 por 2 h.
    3. Polimerização e incorporação: Mergulhe a amostra em resina branca L. R. pura durante a noite a 4 °C, mude para resina branca L. R. fresca por 4h a 25 °C e polimerize a 55 °C por 78 h.
    4. Corte (como feito na etapa 6.1.7): Corte os blocos embutidos semifinamente a 0,8 μm de espessura, core com azul de aminotolueno a 25 ° C por 5 min. localize e selecione áreas com neurônios densamente compactados com um microscópio óptico. Faça seções ultrafinas com 90 nm de espessura. Coloque as amostras em grades de cobre.

7. Marcação de Immunogold

  1. Enxágue 2x com PBS e 1x com tampão glicina a 25 °C por 5 min cada, em seguida, adicione 2% de tampão fosfato de albumina de soro bovino (PBS-BSA) e incube por 30 min.
  2. Incubar na solução de anticorpo primário (anticorpo policlonal de coelho contra o citocromo C) a 37 °C durante 2 h. O anticorpo primário é diluído com PBS-BSA na proporção de 1:50.
  3. Enxágüe com PBS a 25 °C por 5x por 5 min cada. Incubar na solução de anticorpo secundário marcado com ouro coloidal (IgG anti-coelho de cabra conjugada com ouro) a 25 °C durante 1 h. O anticorpo secundário é diluído com PBS-BSA na proporção de 1:20 (ver Tabela de Materiais).
  4. Enxágüe com PBS a 25 °C por 5x por 5 min cada. Enxágüe com água destilada a 25 °C por 5x por 5 min cada (consulte a Tabela de Materiais).
  5. Pós-coloração: Grelhas de coloração em acetato de uranilo a 25 °C durante 10 min, depois grelhas de coloração em citrato de chumbo a 25 °C durante 2 min (ver Tabela de Materiais).
  6. Visualize a seção ultrafina e tire fotos em um microscópio eletrônico de transmissão a 80 kV.

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Resultados

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A avaliação do neuroscore confirma o sucesso do MCAO, de acordo com a Escala de Pontuação Longa, os ratos do grupo MCAO apresentaram pelo menos circular para a esquerda (neuroscore 2). Os ratos do grupo de operação simulada não mostraram disfunção neurológica óbvia (neuroscore 0). Não foi observada mortalidade durante o dia da cirurgia. O neuroscore dos animais está listado na Tabela 1.

A análise IEM do grupo MCAO revelou neurônios com núcleos encolhidos e densidade eletrônica...

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Discussão

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O objetivo primário da terapia de reperfusão no AVC isquêmico agudo é restaurar a perfusão sanguínea para a região isquêmica. Agora podemos atingir esse objetivo por meio de trombólise intravenosa, tratamento endovascular e terapia antitrombótica. No entanto, a restauração da perfusão sanguínea leva à lesão de isquemia-reperfusão, agrava a necrose neuronal e a apoptose, levando ao comprometimento neurológico. Durante a isquemia-reperfusão, o vazamento anormal de elétrons da cadeia de tra...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Projeto Especial de Pesquisa Científica em Medicina Tradicional Chinesa da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (2021MS414).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina normal a 0,9%Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 grades de cobre revestidas formvar da malhaZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.Monofilamentos de BZ10262a
220-230g MCAOBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Etanol absolutoChengdu  Kelong  Química Co.,Ltd.
acetonaChengdu  Kelong  Química Co.,Ltd.
Sistema de anestesia para animaisRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Mantenedor de temperatura animalRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Mesa de cozimentoShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Bone shearFine Science Tools16102-11
moldes de incorporação capsularZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.Centrífuga GP130-B
SCILOGEXD3024R
Microscopia óptica convencional de campo claroZeiss (Alemanha)Primo Star
(10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Faca de diamanteDiatome (Suíça)DU4530
Pinça de dissecaçãoRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Pinça de dissecaçãoRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Forno elétrico de secagem por explosãoShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A
Barbeador elétricoYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Fluido de fixaçãoSichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.SC0001
lâmina de vidroNantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Cabra conjugada com ouro anti-coelho lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Pinça hemostática (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Pinça hemostática (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluranoRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Resina BrancaTianjin Tainuo Ciência e Tecnologia Co., Ltd.
Citrato de chumboSPI (US)GA10701
Porta-agulhas Fornecedor verificado - Jiachi Medical Technology Co., Ltd.
Tetróxido de ósmioTED PELLA (EUA)4008-220501
PBSServicebioG4202
Anticorpo policlonal de coelho para citocromo c   Afinidade Biociências, Ltda.AF0146
RatosPequim Huafukang Biotecnologia Co., Ltd.
SPI-Pon 812 kit de resina de embutirSPI(US)GS02660
EstereomicroscópioSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
tesoura de cabeça reta (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Pinça oftálmica reta (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Tesoura cirúrgicaRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Microscopia eletrônica de transmissãoHitachi (Japão), Ltd.HT7800
ultramicrótomoLeica (Alemanha)UC7
Acetato de urânioSPI (EUA)GS02624
H2008340020231012012023120501Pinça oftálmica curva 211001220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Referências

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