Method Article

Microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um guia passo a passo para a técnica microscópica multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (SLAM), incluindo detalhes sobre como gerar a fonte de luz laser, preparar uma amostra de tecido, realizar imagens e analisar os dados. O SLAM avança a microscopia não linear medindo quatro contrastes complementares sem marcação para investigar o microambiente do tecido.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia óptica não linear faz imagens de amostras biológicas detectando sinais da interação não linear de pulsos de laser ultracurtos com moléculas endógenas. Este método permite a rápida identificação química e estrutural em resolução subcelular de maneira livre de rótulos ou etiquetas e não destrutiva, permitindo assim uma abordagem poderosa para investigar células e tecidos. Esses contrastes não lineares distintos incluem autofluorescência excitada por multifótons e geração de harmônicos. Como cada um desses contrastes oferece vantagens e limitações únicas, sua combinação e seu co-registro espaço-temporal fornecem uma paleta de contraste complementar que aprimora as capacidades analíticas da microscopia óptica não linear. Portanto, nosso grupo desenvolveu a microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (SLAM), uma técnica de imagem que mede quatro ou mais sinais ópticos não lineares gerados simultaneamente, com o objetivo de identificar características morfológicas, metabólicas e funcionais distintas em espécimes biológicos. Aqui, apresentamos um protocolo para imagens SLAM de tecidos, com foco em componentes essenciais da técnica, incluindo a fonte de laser, compressão de pulso e microscópio. Além disso, discutimos a preparação de amostras e descrevemos o pipeline de processamento de dados para dados SLAM. O fluxo de trabalho apresentado é adequado para investigar o estado metabólico, arranjo, respostas celulares e composição de tecidos humanos e animais sem depender de rótulos exógenos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microscopia óptica não linear aproveita a resposta de um espécime à radiação óptica intensa (luz com campos elétricos maiores que 3 × 103 V / cm) para derivar o contraste da imagem, onde a polarização induzida (e, portanto, o sinal gerado) depende não linearmente da intensidade incidente 1,2,3. Como esses múltiplos contrastes são mediados por diferentes interações luz-matéria, a microscopia não linear fornece acesso simultâneo a informações exclusivas sobre a morfologia e a paisagem química de um espécime 1,2,3. Enquanto as técnicas tradicionais de microscopia envolvendo uma interação linear com a luz de iluminação também permitem imagens quantitativas, a microscopia não linear permite uma abordagem mais multimodal, muitas vezes com melhor profundidade de imagem e seccionamento óptico, além de causar menos fotodano à amostra4. No contexto de aplicações biomédicas, como avaliação intraoperatória semelhante à histologia de tecido 5,6, essa técnica permite a sondagem direta de biomoléculas nativas, facilitando investigações contínuas de células vivas sem a necessidade de marcadores ou modificações externas. Essa abordagem evita o uso de tags, rótulos7, moléculas exógenas, proteínas fluorescentes geneticamente expressas ou nanopartículas, que não apenas requerem trabalho extensivo, mas também têm o potencial de interromper a bioquímica nativa do espécime e impactar negativamente as células-alvo ou tecidos 8,9,10. Assim, o microscópio não linear serve como uma ferramenta analítica poderosa e genuína que fornece imagens contínuas de estruturas microscópicas sem alterar a integridade química e estrutural da amostra. Esse recurso abre uma ampla gama de aplicações, desde diagnóstico e descoberta de medicamentos até sinalização celular e biologia de sistemas.

Contrastes multifótons, como autofluorescência de dois fótons (2PAF), autofluorescência de três fótons (3PAF), geração de segundo harmônico (SHG) e geração de terceiro harmônico (THG), conferem vantagens analíticas na caracterização de amostras. A 2PAF é gerada por flavinas endógenas, sendo a flavina adenosina dinucleotídeo (FAD) a mais abundante em sistemas biológicos11. O 3PAF aproveita a excitação do infravermelho próximo para visualizar cromóforos intrínsecos, como NAD(P)H, e permite imagens metabólicas enquanto contorna problemas de fototoxicidade e atenuação relacionados aos raios UV12. O SHG revela especificamente estruturas moleculares não centrossimétricas, como colágeno fibrilar (tipos I, II e III) e matrizes de proteínas 13,14,15,16,17, fornecendo insights estruturais 1. Por fim, o THG, sensível a interfaces e pequenas características estruturais, se destaca na imagem de distribuições lipídicas e vesículas extracelulares 18,19,20,21,22.

Cada um desses sinais de contraste foi explorado independentemente por grupos de pesquisa, estabelecendo o nicho para microscopia não linear multifotônica como uma ferramenta confiável e versátil para aplicações biológicas23 , 24 , 25 , 26 . Esses esforços foram liderados pelos inventores do microscópio 2PAF, que aproveitaram sua tecnologia inovadora para fazer novos insights sobre a morfologia do tecido, o metabolismo celular e até mesmo as características morfofuncionais de patologias como a doença de Alzheimer e o câncer23. Seu trabalho acabou gerando aplicações inovadoras na neurociência27,28. Nos anos seguintes, vários pesquisadores destacaram a sensibilidade do SHG a alterações na matriz extracelular, o andaime que fornece suporte estrutural às células e que sofre alterações substanciais durante a patogênese do câncer29. Notavelmente, Campagnola et al.14,24,30,31 demonstraram que a microscopia de SHG permite a visualização de montagens macromoleculares e supramoleculares, revelando detalhes como o arranjo, concentração e tipo de colágeno que não são detectáveis com técnicas convencionais baseadas em fluorescência. Esses resultados ressaltaram o potencial da microscopia SHG como uma ferramenta de diagnóstico viável em ambientes clínicos. Finalmente, a microscopia THG foi aplicada com sucesso para visualizar as camadas da retina em roedores com resolução subcelular25, mapear estruturas cerebrais32 e capturar a topografia multi-interfacial da invasão de células de melanoma33.

Essas implementações históricas da microscopia não linear geralmente envolviam um laser de femtossegundo (fs) com bloqueio de modo acoplado a uma objetiva de alta abertura numérica (NA) para gerar e coletar os sinais não lineares, que foram então direcionados com um espelho dicróico para um filtro passa-banda e coletados com um tubo fotomultiplicador (PMT) 34 . Apesar de implementações semelhantes, a maioria dos aplicativos se concentrou em adquirir apenas um ou, no máximo, dois contrastes, ignorando os outros. Para realizar plenamente o potencial do microscópio multifotônico, Boppart et al. primeiro implementaram a aquisição sequencial de múltiplos contrastes não lineares21 , 35 , 36 , 37 , seguido por sua detecção simultânea4 , 22 , 38 , 39 , 40 , 41. A técnica resultante, conhecida como microscopia multi-harmônica de autofluorescência sem marcação simultânea (SLAM), co-registra espacial e temporalmente os sinais não lineares 2PAF, 3PAF, SHG e THG por meio de excitação de disparo único e detecção multiplex, alcançando assim um poder analítico superior. A co-localização espaço-temporal desses quatro canais fornece dados altamente classificados e ricos em recursos42, oferecendo vantagens sobre os dados adquiridos sequencialmente, eliminando artefatos de movimento e garantindo um registro de imagem aprimorado. Consequentemente, o SLAM permite a geração de características compostas, como taxas ópticas de redução-oxidação, que caracterizam efetivamente as propriedades metabólicas43 , 44 , 45 . Além disso, a análise combinada de sinais entre modalidades facilita a engenharia de recursos adicionais com base na correlação e colocalização de canais. Por exemplo, Shi et al. demonstraram a importância das características de colocalização da microscopia SLAM na classificação precisa das células do ovário de hamster chinês (CHO) usadas na produção farmacêutica42. Desta forma, o SLAM estabelece as bases para o que hoje é considerado o estado da arte em microscopia multifotônica, abrindo caminho para futuros avanços no campo46.

Neste protocolo, descrevemos os principais componentes de um microscópio SLAM (Figura 1) e descrevemos uma metodologia passo a passo para sua implementação. Isso inclui a geração e modelagem dos pulsos de excitação, preparação de amostras de tecido representativas, procedimentos de imagem e processamento, bem como a exibição dos dados resultantes. Ao utilizar tecnologia pronta para uso e técnicas estabelecidas, esse protocolo é universal, transferível e pode ser facilmente reproduzido usando sistemas ópticos semelhantes em diferentes laboratórios.

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Figura 1: O design óptico de um microscópio multiharmônico de autofluorescência sem rótulo (SLAM) simultâneo. O laser de femtossegundo emite luz de 1040 nm em pulsos de 370 fs a uma taxa de repetição de 10 MHz. A intensidade e a polarização do laser são cuidadosamente controladas antes de bombear um cristal fotônico para gerar um supercontínuo. Os pulsos são então comprimidos por um modelador de pulso e direcionados para um microscópio de varredura a laser personalizado (caixa tracejada). Espelhos dicróicos e filtros passa-banda isolam os sinais não lineares gerados pela amostra antes de serem detectados por detectores de fótons de alta sensibilidade, como tubos fotomultiplicadores (PMTs) ou fotodetectores híbridos (HPDs). O design óptico é baseado em um sistema descrito anteriormente41. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com o protocolo UIUC # 23031 aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Illinois e seguiram rigorosamente todas as diretrizes e regulamentos relevantes.

1. Clivagem e alinhamento de fibra de cristal fotônico (PCF)

  1. Usando cortadores de fibra ou alicates, corte uma seção de fibra de cristal fotônico (PCF, Tabela de Materiais) em um comprimento de pouco mais de 15 cm.
    NOTA: Comprimentos de pelo menos 1.5 cm serão cortados de cada extremidade do PCF, pois esse comprimento é necessário para prender com segurança o PCF durante a clivagem. O comprimento final do PCF (12 cm) utilizado neste estudo foi determinado com base em uma simulação anterior usando a equação de Schrödinger não linear generalizada47 e testes empíricos. Em geral, o melhor comprimento de PCF pode variar dependendo do tipo de PCF, da entrada do laser da bomba e do supercontínuo desejado.
    CUIDADO: Ao cortar o PCF, use equipamento de proteção individual (EPI) para proteger os olhos e a pele do experimentador. Descarte imediatamente os restos de fibra no recipiente de descarte de objetos cortantes.
  2. Retire cerca de 3 cm do revestimento plástico de cada extremidade do PCF usando um removedor de fibra (Tabela de Materiais) ou lâmina de barbear e limpe qualquer plástico residual com papel de seda (Tabela de Materiais) e 100% de metanol.
  3. Coloque uma extremidade do PCF no suporte em um cutelo de fibra óptica de precisão (Tabela de Materiais) e alinhe a lâmina a 1.5 cm da extremidade do PCF. Feche cuidadosamente o clamps e pressione o botão de clivagem .
    NOTA: Siga cuidadosamente o manual do usuário do cutelo de fibra, incluindo diretrizes específicas para clivagem de PCFs. As configurações, como tensão da fibra, podem exigir ajuste fino para clivagens consistentes e de alta qualidade para cada tipo de PCF.
  4. Inspecione a face e a lateral clivada do PCF usando o microscópio integrado (ampliação de 10×) em uma estação de trabalho de processamento de fibra de vidro (Tabela de Materiais), garantindo que a clivagem seja de boa qualidade (Figuras 2A, C). Recliva se houver detritos (Figura 2D), arranhões (Figura 2E) ou se a superfície clivada não for plana e perpendicular ao comprimento do PCF (Figura 2B).
    NOTA: Deve-se tomar extremo cuidado nesta etapa e nas etapas subsequentes para evitar tocar as extremidades clivadas do PCF em qualquer superfície para evitar causar danos.
  5. Clive a segunda extremidade do PCF, garantindo o comprimento final desejado.
    NOTA: O PCF usado neste protocolo é cortado em 12 cm.
  6. Como nas etapas anteriores, inspecione a extremidade recém-clivada do PCF (consulte a etapa 1.4). Se a clivagem parecer defeituosa ou inconsistente, descarte o PCF atual e repita o processo com um novo.
  7. Prenda a extremidade de entrada do PCF em um estágio de 3 eixos (Tabela de Materiais) aproximadamente na distância focal da lente de acoplamento de fibra, medida com uma régua. Apoie com segurança a outra extremidade do PCF com um poste ou suporte temporário.
    NOTA: Não clamp a saída ainda para evitar quebrar o PCF durante o ajuste bruto.
    CUIDADO: É necessário apoiar a extremidade de saída e envolvê-la com blocos de feixe suficientes para reduzir o risco de exposição ao laser.
  8. Coloque um medidor de potência óptica (Tabela de Materiais) no caminho do feixe logo antes do PCF para medir a potência de entrada. Certifique-se de que o laser de femtossegundo (Tabela de Materiais) esteja bloqueado pelo obturador 1 antes de ligar o laser.
    NOTA: Sempre conclua todos os programas de treinamento de segurança a laser necessários para entender os riscos associados ao uso do laser.
    CUIDADO: Ao operar o laser, use óculos de segurança apropriados especificamente classificados para o comprimento de onda e a potência do laser em uso. Antes de operar o laser, remova todas as joias, relógios e outros itens reflexivos que possam causar reflexos perigosos.
  9. Ligue o laser e deixe-o aquecer durante o "tempo de aquecimento frio" especificado pelo laser. Abra o obturador 1 e ajuste a potência usando a placa de meia onda (HWP1) logo antes do divisor de feixe polarizador até que o medidor de potência leia 260 mW ou menos.
    NOTA: O uso de 260 mW para alinhamento foi determinado empiricamente como sendo baixo o suficiente para evitar danos ao PCF (mesmo quando desalinhado) enquanto ainda fornece um feixe brilhante para visualização em um visualizador IR ou alvo fluorescente.
  10. Bloqueie o laser usando o obturador 1 e mova o medidor de potência para a extremidade de saída do PCF.
  11. Desbloqueie o laser e ajuste o eixo óptico da face de entrada do PCF usando o estágio de 3 eixos até que o sinal apareça no medidor de potência, indicando que alguma luz está acoplada ao núcleo, revestimento ou revestimento plástico do PCF. Se o posicionamento da entrada PCF no foco do feixe estiver além do alcance do estágio de 3 eixos, bloqueie o laser e, em seguida, ajuste e prenda novamente o PCF.
    NOTA: Um infravermelho (IR) viewer ou alvo fluorescente pode ser usado para visualizar onde o feixe está focado.
  12. Usando o estágio de 3 eixos, ajuste uma dimensão do eixo óptico do PCF para encontrar a faixa sobre a qual a luz está acoplada, calcule o meio dessa faixa e mova o estágio para lá. Repita isso para a segunda dimensão para centralizar aproximadamente o feixe no núcleo do PCF.
    NOTA: As marcas de escala de μm no estágio de 3 eixos podem ajudar a medir distâncias e encontrar o centro do PCF.
  13. Ajuste iterativamente as três dimensões do estágio de 3 eixos em uma sequência repetida enquanto otimiza a eficiência do acoplamento para centralizar e focar com precisão o feixe no núcleo do PCF.
    NOTA: Se a eficiência máxima de acoplamento, medida pelo medidor de potência, for visivelmente inferior a 80% da potência de entrada feche o obturador 1, solte o PCF e inspecione-o quanto a danos. Se estiver danificado, reinicie a partir da etapa 1.1, caso contrário, bloqueie o laser, prenda novamente o PCF e reinicie o alinhamento a partir da etapa 1.11.
  14. Bloqueie o feixe com o obturador 1 e aumente a potência do laser para 1.6 W.
    NOTA: O uso de 1,6 W foi determinado por meio de simulação e testes empíricos para gerar um supercontínuo suficientemente amplo, mantendo-se abaixo do limite de dano do PCF.
  15. Abra o obturador 1 e mais uma vez ajuste iterativamente o estágio de 3 eixos para ajustar o local de entrada do PCF para otimizar a eficiência do acoplamento.
    NOTA: Empiricamente, a eficiência máxima é normalmente de cerca de 80%.
  16. Feche o obturador 1 e prenda a saída do PCF aproximadamente na distância focal do espelho parabólico. Coloque um bloco de feixe na saída do espelho parabólico.
  17. Reduza a potência do laser novamente para 260 mW ou menos.
  18. Abra o obturador 1 e use o stage de 3 eixos do espelho parabólico para alinhar o eixo óptico do espelho parabólico para minimizar a distorção do feixe. Em seguida, ajuste o foco e colima o feixe no campo distante.
    NOTA: Use um IR viewer ou alvo fluorescente para view o feixe de saída.
  19. Ajuste os espelhos após o espelho parabólico para garantir que o feixe esteja alinhado com o resto do sistema óptico.
    NOTA: Instale alvos de alinhamento de inversão permanente ou íris para tornar esta etapa reproduzível.
  20. Feche o obturador 1 e aumente a potência do laser para 1.6 W. Abra o obturador 1 e verifique se o caminho do feixe não mudou.
  21. Meça a potência de saída do modelador de pulso (Tabela de Materiais) usando um medidor de potência. Gire a placa de meia onda na frente do modelador de pulso (HWP3) para otimizar a eficiência de transmissão do modelador de pulso.

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Figura 2: Extremidades clivadas da fibra de cristal fotônico (PCF). (A, B) Imagens do lado da fenda. (C-F) Imagens da face da fenda. (A) Um PCF bem clivado tem uma face plana e perpendicular. (B) Um PCF mal clivado com uma face angulada e lascada. (C) Um PCF bem clivado com o rosto limpo. (D) Um PCF mal manuseado que tenha sujeira em sua superfície. (E) Um PCF mal clivado com arranhões em sua superfície. (F) Um PCF antigo que foi substituído. Há danos visíveis no núcleo do PCF, como visto pela mancha escura no centro do PCF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Caracterização e otimização de pulsos

  1. Usando um espectrômetro ou analisador de espectro óptico (OSA, Table of Materials), meça o laser após o espelho parabólico para verificar a geração supercontínua do PCF.
  2. Gire a placa de meia onda após o divisor de feixe polarizador (HWP2) para otimizar a largura do supercontínuo.
  3. Ligue o autocorrelator de microscopia (Tabela de Materiais). Usando o software, defina o detector para o detector interno e defina a faixa de varredura para 5 ps para garantir que toda a largura da autocorrelação de pulso seja capturada.
    NOTA: Para configurações com larguras de pulso mais longas (por exemplo, devido à dispersão em um PCF longo), a faixa de varredura deve ser aumentada adequadamente. Lembre-se de que a largura de pulso medida por um autocorrelator de intensidade não é a duração real do pulso, mas ainda pode servir como uma referência útil para compressão de pulso. Para uma caracterização precisa e completa da amplitude e da fase do pulso, técnicas espectralmente resolvidas, como Frequency-Resolved Optical Gating (FROG)48 , devem ser usadas.
  4. Desbloqueie o laser e alinhe o autocorrelacionador ao feixe que sai do modelador de pulso até que um sinal apareça.
    NOTA: A colocação de espelhos temporários (dois na entrada e dois na saída do autocorrelacionador) permitirá o alinhamento do feixe com o autocorrelacionador sem afetar o resto do sistema óptico.
  5. Certifique-se de que o obturador 2 esteja fechado e aplique o meio de imersão apropriado (como água ou óleo) na lente objetiva (Tabela de Materiais). Coloque o detector externo do autocorrelacionador na platina do microscópio (Tabela de Materiais) e ajuste a platina para posicionar o detector diretamente acima da objetiva.
    NOTA: Ao contrário das objetivas microscópicas típicas, as objetivas recomendadas usadas para microscopia SLAM são transmissivas ultravioleta para melhorar a detecção de THG38.
  6. Ligue os espelhos do galvanômetro de varredura (Tabela de Materiais) para definir seu voltage para zero. Abra o obturador e use um visualizador de infravermelho ou alvo fluorescente para verificar se o feixe está atingindo o detector externo.
  7. Defina o detector do autocorrelator para ser o detector externo. Ajuste a posição do palco até que o sinal apareça.
    NOTA: Se o detector saturar, diminua a potência usando o filtro de densidade neutra.
  8. Ajuste os coeficientes polinomiais (ordens de dispersão) do modelador de pulso para minimizar iterativamente a largura de pulso medida pelo autocorrelacionador. Reduza a faixa de varredura do autocorrelacionador adequadamente à medida que a largura do pulso diminui para melhorar a precisão e a visualização da função de autocorrelação.
    NOTA: A largura de pulso ideal medida com um ajuste gaussiano deve ser de algumas dezenas de femtossegundos (fs).

3. Preparação da amostra

NOTA: Para simplificar, este protocolo descreve imagens de tecido ex vivo . No entanto, devido à natureza livre de marcação da SLAM, os procedimentos de imagem in vivo são facilmente adaptados38.

  1. Eutanásia do animal por asfixia com CO2 ou outro método de eutanásia aprovado pela IACUC.
  2. Colha o(s) órgão(s) de interesse usando o procedimento de necropsia padrão49 dentro de 10 minutos post-mortem e enxágue com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado (PBS) para remover o sangue.
    NOTA: Neste estudo, o fígado e os pulmões foram colhidos.
  3. Dissecar o órgão vertical ou horizontalmente usando uma lâmina, dependendo da orientação necessária para análise. Certifique-se de que a dissecção seja realizada com precisão para manter a integridade da estrutura do tecido.
  4. Coloque o pedaço de tecido em uma placa de cultura de tecidos estéril cheia de meios de cultura de células completos sem vermelho de fenol. Refrigerar o tecido a 4 °C se não recolher imagens imediatamente.
    NOTA: O meio de cultura celular utilizado neste estudo foi HEPES tampolado - Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 4 mM de glutamina e suplementos de meio de crescimento de células endoteliais (Tabela de Materiais). Esse meio foi cuidadosamente escolhido para manter a viabilidade fisiológica das células epiteliais e endoteliais residentes na amostra de tecido renal durante a duração da imagem50.
  5. Para preparar padrões de calibração de fluorescência, zere uma balança de precisão para o peso de um barco de pesagem antiestático e meça aproximadamente 5 mg de sal dissódico de dinucleotídeo de flavina adenina (FAD, Tabela de Materiais) ou 5 mg de sal dissódico de dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido (NADH, Tabela de Materiais).
  6. Utilizar uma pipeta monocanal para dispensar um volume adequado de tampão HEPES 1 M nos recipientes de pesagem contendo pós FAD ou NADH pré-pesados para preparar soluções de reserva 5 mM. Pipete para cima e para baixo repetidamente para dissolver o pó.
  7. Preparar soluções de trabalho 1 mM a partir das soluções de reserva por diluição 1:5 no tampão HEPES.
    NOTA: A concentração de trabalho de 1 mM usada neste estudo foi determinada empiricamente para produzir alto sinal, evitando a saturação do detector.
  8. Armazenar as soluções de estoque de FAD e NADH em tubos de microcentrífuga a 4 °C.
    NOTA: Os padrões de solução podem ser armazenados refrigerados por vários dias, mas é recomendável preparar novas soluções para cada experimento.
  9. Pouco antes de coletar imagens de microscopia SLAM, coloque as amostras de tecido em placas de imagem com fundo de vidro de 35 mm (Tabela de Materiais). Como alternativa, use uma lamínula de vidro. Alicotar as soluções FAD e NADH em pratos ou lamínulas idênticos.
    NOTA: Vidro não revestido ou vidro revestido com poli-D-lisina é fortemente recomendado devido ao sinal de fundo reduzido. Certifique-se de que a espessura do vidro seja apropriada para a objetiva do microscópio que está sendo usada (este estudo usou #0).

4. Configuração e operação do SLAM

  1. Verifique se a entrada do laser para o PCF está bloqueada pelo obturador 1 e ligue o laser. Deixe o laser aquecer durante o "tempo de aquecimento a frio" especificado do laser.
    NOTA: 30 minutos de tempo de aquecimento a frio são usados para o laser neste estudo.
  2. Verifique se o caminho do feixe está livre de obstruções e coloque um medidor de potência óptica no caminho do feixe logo antes do PCF. Abra o obturador 1 e meça a potência de entrada.
  3. Feche o obturador 1 e mova o medidor de potência para a saída do PCF após o espelho parabólico. Abra o obturador 1 e maximize a saída PCF usando o estágio de 3 eixos de entrada.
  4. Deixe o PCF aquecer por 10 min e, em seguida, maximize a potência de saída novamente. Registre a transmissão do PCF. Se a transmissão cair abaixo de 50%, substitua o PCF.
    NOTA: Durante a operação do microscópio SLAM (nas etapas a seguir), é recomendável medir a potência de saída do PCF a cada hora para garantir dados consistentes.
  5. Mova o medidor de potência após o filtro de densidade neutra (ND) e gire o filtro para controlar a potência do laser que atinge a amostra.
    NOTA: Multiplique a potência medida pela transmitância dos componentes ópticos restantes. A transmitância é medida colocando o medidor de potência após a lente objetiva. Para este estudo, foi utilizada uma potência média de laser de 20 mW na amostra. A potência do laser foi determinada empiricamente para a amostra fornecida, profundidade de imagem e sistema de microscópio para gerar imagens de alta qualidade, evitando danos à amostra ou não linearidade do detector. Embora não haja um padrão definitivo, a imagem multifotônica típica sem marcação é limitada a várias dezenas a centenas de miliwatts 7,32,33,51,52.
  6. Ligue os galvanômetros e o palco. Abra o software de aquisição e insira os parâmetros desejados para a imagem.
    NOTA: Este estudo usou 512 × 512 pixels e um tempo de permanência de pixel de 13,65 μs para criar uma imagem de um campo de visão de 360 × 360 μm2 . Cinco quadros tirados a 0,333 Hz foram calculados em um único quadro de alta qualidade.
  7. Coloque a amostra no stage usando o meio de imersão apropriado para a objetiva, como foi usado anteriormente na etapa 2.5.
  8. Apague as luzes da sala e feche as cortinas.
    NOTA: Para evitar danificar os detectores, nunca acenda as luzes da sala enquanto os detectores estiverem ligados ou as persianas do detector estiverem abertas.
  9. Ligue as fontes de alimentação e amplificadores do detector.
  10. Feche a caixa de luz ao redor do palco.
  11. Use os interruptores de controle eletrônico para abrir manualmente as persianas do detector (S3, S4, S5, S6).
  12. No software de aquisição de microscópio, clique em Clique para iniciar a aquisição para começar a coletar imagens SLAM. Ajuste o foco do microscópio girando o botão no controlador de estágio do microscópio (Tabela de Materiais) até que a amostra entre em foco.
    NOTA: A lamínula de vidro gera um forte sinal THG, que pode ser usado para determinar com precisão a profundidade da imagem usando a posição da platina exibida no controlador da platina do microscópio. Por exemplo, todas as imagens dos padrões de solução tiradas neste estudo foram tiradas em um plano focal 20 μm acima da lamínula.
  13. Use o joystick no controlador da platina do microscópio para localizar o campo de visão desejado na amostra e clique em Parar e redefinir.
    NOTA: Se a imagem saturar, volte para a etapa 4.5 e diminua a potência. Se a imagem tiver uma relação sinal-ruído inferior a 10, a potência pode ser cuidadosamente aumentada.
  14. Na guia Salvar , clique em Salvar dados para alternar para Sim e clique em Clique para iniciar a aquisição. Aguarde até que a aquisição termine antes de continuar.
  15. Para alterar ou manipular a amostra durante a geração de imagens, feche as persianas do detector e use uma lanterna ou farol para obter luz. Depois que o exemplo for modificado, retorne à etapa 4.10.
    NOTA: Para permitir a repetibilidade e a análise quantitativa, colete imagens SLAM dos padrões de solução FAD e NADH. Certifique-se de que o campo de visão, o tamanho da imagem e o poder de excitação sejam consistentes com o que foi usado para as amostras biológicas.
  16. Para encerrar a aquisição de imagens SLAM, feche as persianas do detector e desligue os detectores antes de acender as luzes da sala.
  17. Bloqueie o laser usando o obturador 1 e desligue o laser.
  18. Desligue os galvanômetros e stage. Feche o software de aquisição do microscópio.
  19. Descarte o lenço de papel de forma adequada e limpe o local de trabalho.

5. Visualização de dados

NOTA: A seguinte análise de imagem pode ocorrer em um software de análise de imagem, como o ImageJ53 (Table of Materials) ou em uma linguagem de programação com recursos de análise de imagem, como Python ou MATLAB. As etapas a seguir descrevem como executar a visualização de dados usando o ImageJ.

  1. Certifique-se de que as imagens de cada canal estejam em um formato de imagem sem perdas (por exemplo, TIFF ou PNG).
    NOTA: O software de controle de microscópio personalizado usado neste estudo salvou automaticamente as imagens como TIFFs. Para salvar uma imagem como TIFF, abra-a no ImageJ e selecione Arquivo > Salvar como > Tiff.
  2. Para gerar imagens padrão de iluminação, abra as imagens de canal FAD e NAD(P)H das soluções FAD e NADH, respectivamente, no ImageJ. Para cada imagem, selecione Processar > Filtros > Desfoque gaussiano..., defina Sigma (Raio) como 41 e clique em OK.
    NOTA: Ajuste o Sigma (Raio) do filtro gaussiano conforme necessário para suavizar suficientemente a imagem.
  3. Para corrigir simultaneamente a iluminação irregular e normalizar a intensidade da fluorescência, abra as imagens dos canais FAD e NAD(P)H da amostra. Para cada imagem, selecione Processar > Calculadora de Imagem..., para a Imagem1 selecione a imagem de amostra, para Operação selecione Dividir e para a Imagem2 selecione a imagem padrão de iluminação que corresponde ao canal da imagem de amostra e clique em OK.
    NOTA: Esta etapa é crítica para corrigir a variabilidade do sistema e manter a consistência nas avaliações quantitativas de autofluorescência, como a razão redox óptica (ORR).
  4. Se várias imagens forem tiradas para formar um campo de visão maior ou pilha z, junte ou combine as imagens em uma única imagem ou pilha de imagens.
  5. Para gerar uma imagem ORR, primeiro some as imagens FAD e NAD(P)H. Selecione Processar > Calculadora de imagem..., para Imagem1 e Imagem2, selecione as imagens de canal FAD e NAD(P)H respectivamente, para Operação , selecione Adicionar e clique em OK. Para calcular a imagem ORR, selecione Processar > Calculadora de Imagem..., para a Imagem1 selecione a imagem do canal FAD, para Operação selecione Dividir e, para a Imagem2 , selecione o resultado da soma de FAD e NAD(P)H e clique em OK.
  6. Para aplicar um mapa de cores à imagem ORR, selecione Imagem > Cor > Editar LUT..., clique em Abrir, selecione o arquivo de tabela de pesquisa (.lut) desejado e clique em OK. Selecione Imagem > Ajustar > Brilho/Contraste e ajuste o contraste conforme desejado.
    NOTA: Recomenda-se o uso de um mapa de cores isoluminante, como o mapa de cores CET-I2 54,55 (invertido) usado neste estudo. Para inverter um mapa de cores no ImageJ depois de aplicá-lo a uma imagem, selecione Imagem > Cor > Inverter LUTs.
  7. Para melhorar a clareza dos recursos na imagem ORR, dimensione o brilho pela intensidade dos canais de fluorescência. Primeiro, selecione o resultado da soma de FAD e NAD(P)H e selecione Processar > Melhorar Contraste..., certifique-se de que a opção Normalizar esteja marcada e clique em OK. Selecione Editar > Copiar para copiar esse resultado para a área de transferência. Em seguida, selecione a imagem ORR e selecione Tipo de > de imagem > Cor RGB" e, em seguida, selecione Tipo de > de imagem > HSB (32 bits). Mova o controle deslizante na parte inferior da imagem totalmente para a direita para visualizar o canal Brilho , selecione Editar > Colar e, em seguida, selecione Tipo de > de imagem > Cor RGB.
  8. Para visualizar a imagem SLAM como uma composição, abra os quatro canais SLAM no ImageJ e selecione: Imagem > Cor > Mesclar canais... Para C2 (verde), selecione a imagem do canal SHG, para C5 (ciano) selecione a imagem do canal NAD(P)H, para C6 (magenta) selecione a imagem do canal THG e para C7 (amarelo) selecione a imagem do canal FAD. Certifique-se de que Criar composição esteja marcada e clique em OK.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A abordagem multicanal e multimodal complexa do microscópio SLAM (Figura 1) pode dificultar a solução de problemas e a compreensão dos resultados por novos usuários. Primeiro, um PCF bem clivado apresenta uma face limpa (Figura 2C) com uma superfície plana perpendicular ao comprimento do PCF (Figura 2A). Uma face de clivagem angulada e lascada (Figura 2B) e a presença de arranhões (...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gerar um supercontínuo adequado é crucial para o sucesso da imagem SLAM, mas pode ser desafiador devido à complexidade de configurar o PCF. Garantir a clivagem precisa e o manuseio cuidadoso do PCF é essencial para manter as superfícies limpas, livres de detritos, sujeira ou arranhões, os quais podem interferir no acoplamento eficaz, na geração de supercontínuos e até mesmo encurtar a vida útil do PCF. Como o PCF requer substituição regular, praticar a clivagem da fibra e ajustar as conf...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento para o equipamento usado neste estudo foi fornecido em parte pela GSK por meio do Centro de Imagem Molecular Óptica do Instituto Beckman de Ciência e Tecnologia Avançada. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo NIH / NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) e pelo NSF Science and Technology Center for Quantitative Cell Biology. K.K.D.T foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Pesquisa em Toxicologia e Saúde Ambiental do NIEHS (5T32ES007326-25), A.D.C. foi apoiado pelo programa de Pós-Doutorado do Instituto Beckman de Ciência e Tecnologia Avançada e A.H. foi apoiado pelo Programa de Treinamento em Microambiente de Tecidos NIBIB (T32EB019944). Os autores agradecem a Darold Spillman por seu gerenciamento de espaços, equipamentos e tecnologia de laboratório e agradecem aos Drs. Janet E. Sorrells e Rishyashring R. Iyer por suas contribuições anteriores ao sistema de microscópio SLAM usado neste estudo.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Platina de 3 eixosThorLabsMAX316Descontinuado.
Prato de imagem com fundo de vidro de 35 mmMatTekP35G-0-14-CTampa de vidro #0 não revestida.
DMEMGibco21063029Glicose alta, HEPES, sem vermelho de fenol.
Suplementos de meio de crescimento de células endoteliaisPromoCellC-39210Omitir o soro fetal de bezerro.
Laser de femtossegundo FemtoTrainEspectro-Física1040-5Potência Média: >5,0 W, Energia de Pulso: >500 nJ, Comprimento de Onda: 1040 nm ± 8 nm, Taxa de repetição: 10 MHz, Largura de pulso (FWHM): < 220 fs.
Soro fetal bovinoCytivaSH30071.03HyClone caracterizado.
Decapador de fibrasThorLabsT10S13
Flavina adenina dinucleotídeo dissódico sal hidratadoSigma-AldrichF6625
Espelhos galvanômetrosTecnologia Cambridge6215HDescontinuado.
Estação de trabalho para processamento de vidroVytranGPX3800
ImagemJLaboratório Eliceiri na Universidade de Wisconsin MadisonVersão 2.16.0Distribuição FIJI.
Papel de seda KimwipeProfissional da Kimberly-Clark34120
L-GlutaminaCytivaSH30034.01
Platina de microscópioInstrumentação Científica AplicadaFTP-2050
Controlador de platina para microscópioInstrumentação Científica AplicadaMS-2000-500-UDSW
Autocorrelator de microscopiaAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Lente objetivaOlimpoXLPLN25XWMP2Imersão em água, ampliação de 25X, 1,05 NA.
Medidor de potência ópticaNewport919P-003-10600 - 1700 nm.
Analisador de espectro ópticoThorLabsOSA202C
Fibra de cristal fotônicoFotônica NKTLMA-PM-15 NKTGrande área de modo, manutenção da polarização. Diâmetro do núcleo: 15 €
Cutelo de fibra óptica de precisãoFujikuraCT-101
Modelador de pulsoSoluções Biofotônicas Inc.FemtoJock-DDescontinuado.
β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo, hidrato de sal dissódico reduzidoSigma-Aldrich10128023001

References

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