Geração de mutantes maternos usando zpc:cas9 knock-in zebrafish

O desenvolvimento embrionário inicial dos vertebrados depende muito do RNA e das proteínas armazenadas no ovo, coletivamente chamados de fatores maternos. Esses produtos maternos são predominantemente sintetizados durante o estágio diploteno da meiose I ^1,2,3. Para investigar seus papéis funcionais, é essencial gerar indivíduos fêmeas mutantes homozigotos, pois apenas a mutação homozigótica nos oócitos pode esgotar totalmente esses fatores maternos. No entanto, a obtenção de tais fêmeas mutantes homozigóticas torna-se um desafio quando mutações homozigóticas zigóticas resultam em letalidade ou esterilidade ^4,5. Isso representa uma barreira significativa para elucidar as funções dos produtos maternos codificados por genes zigóticos, letais ou estéreis. Para superar essa limitação técnica, várias abordagens inovadoras foram desenvolvidas ^6,7,8. No entanto, essas técnicas geralmente sofrem de cronogramas experimentais prolongados ou desafios técnicos substanciais.

Em nosso trabalho anterior, também desenvolvemos uma estratégia de nocaute condicional que permite a geração de mutantes maternos dentro de uma única geração ^9,10. O sistema compreende dois componentes principais: peixe-zebra transgênico Tg (zpczcas9) e um sistema de plasmídeo transgênico I-SceI com 3-4 de expressão de sgRNA. Aproveitando esse sistema, alcançamos com sucesso o nocaute condicional de fatores maternos em oócitos ^9,10, mas ainda há espaço para melhorias. Primeiro, a eficiência de edição do genoma da linha transgênica Tg (zpczcas9) relatada anteriormente não foi estável na manutenção da expressão transgênica de Cas9. Além disso, uma vez que esta linha transgênica foi gerada usando o sistema de transposon Tol2, a transposição de Tol2 não pode mais ser usada para a integração do de expressão de sgRNA; em vez disso, é necessária uma transgênese mediada por I-SceI. No entanto, essa abordagem é menos eficiente do que Tol2 e também é mais suscetível ao silenciamento transgeracional.

Para superar essas limitações, procuramos estabelecer uma linha knock-in que permitisse a expressão robusta e estável de Cas9 específica para oócitos. Esta linha permite o uso do sistema de transposon Tol2 para a entrega altamente eficiente de plasmídeos de expressão de sgRNA em peixe-zebra. Utilizando uma estratégia de edição de genoma baseada em íntron¹¹, geramos com sucesso uma linha knock-in zpccas9 com o local integrado no último íntron do gene rbm24a (Figura 1A, B). Escolhemos este locus como um porto seguro genômico candidato para a expressão de transgenes maternos com base em duas observações independentes. 1) Integração inofensiva: em nosso estudo recente¹², peixes homozigotos portadores de DNA exógeno neste local permaneceram totalmente viáveis e férteis. 2) Expressão robusta: quando um zpccas9 foi inserido no mesmo locus, Cas9 foi expresso em níveis elevados, produzindo eficiências de edição de genoma consistentemente fortes ao longo das gerações (Figura 1C). Como um componente central do plasma germinativo, a proteína de ligação ao RNA Rbm24a faz parceria com a Buc para incorporar RNAs do plasma germinativo aos grânulos germinativos. Consequentemente, a deficiência materna de Rbm24a leva a uma completa ausência de células germinativas primordiais (PGCs)¹². Aqui, ao direcionar o rbm24a como exemplo em nosso trabalho recente, fornecemos um protocolo de vídeo aprimorado para gerar e caracterizar mutantes maternos para genes letais zigóticos.

Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do ARRIVE e foram eticamente aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais da Universidade de Shandong (Aprovação nº. SYDWLL-2021-15). A visão geral desse protocolo é mostrada na Figura 2.

1. Geração da linha knock-in rbm24a-RFP ^zpc:cas9

1. Tela de sgRNA para knock-in
   1. Selecione e sintetize candidatos a sgRNA knock-in
      1. Envie a sequência do último íntron de rbm24a para CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) para identificar candidatos a sgRNA ideais exibindo pontuações altas de CRISPRscan (indicativas de eficiência no alvo) e baixas pontuações de CFD (refletindo efeitos fora do alvo). Sintetize o oligo longo para cada sgRNA (sgRNA oligo).
         NOTA: O CRISPRscan gera oligos de sgRNA contendo elementos funcionais essenciais, incluindo a sequência promotora T7, a sequência alvo de sgRNA de 20 nucleotídeos e uma sequência de andaime de sgRNA de 16 nucleotídeos. Aqui, selecionamos um sgRNA com a seguinte sequência: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
         GTgttttagagctagaa-3′ (promotor T7 em minúsculas, guia de 20 nt em maiúsculas, andaime parcial em minúsculas).
      2. Para obter o molde de DNA para síntese de sgRNA, prepare 50 μL de reação de PCR de preenchimento: 2x Taq Master mix 25 μL; primer de sgRNA (10 μM) 2 μL; Primer universal (10 μM) 2 μL; H₂O 21 μL deionizado.
         NOTA: As sequências de todos os primers são mostradas na Tabela de Materiais.
      3. Misture bem e transfira a mistura de reação para um termociclador pré-programado e inicie o protocolo de amplificação usando os parâmetros de ciclagem da seguinte forma: 1 ciclo a 94 ° C por 3 min, 35 ciclos (94 ° C por 15 s, 50 ° C por 15 s, 72 ° C por 30 s) e 1 ciclo a 72 ° C por 5 min.
      4. Preparar a mistura de reação para síntese de sgRNA em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL; combinar todos os componentes à temperatura ambiente na seguinte ordem: 11 μL de água destilada, 2 μL de ATP/GTP/CTP/UTP (10 mM cada), 10 μL de produto de PCR, 4 μL de tampão de reação de RNA polimerase 10x, 2 μL de RNA polimerase T7 e 1 μL de inibidor de RNase. O volume total da reação é de 40 μL. Misture bem agitando e faça uma breve centrifugação.
      5. Incubar a 37 °C durante 1,5 h. Adicione 1 μL de DNase I, misture agitando e centrifugue brevemente. Incubar a 37 °C durante 15 min para garantir a remoção completa do molde de ADN.
      6. Adicione 5 μL de esferas magnéticas de sílica, seguido por 120 μL (4x volume) de tampão de ligação de RNA (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05%, etanol 100 mL). Misture bem pipetando. Incube em um termomixer a 1.500 rpm por 10 min em temperatura ambiente.
      7. Coloque o tubo em um suporte magnético e remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta ou sistema de vácuo.
      8. Adicione 400 μL de etanol a 90% e vórtice para ressuspender os grânulos. Coloque o tubo no suporte magnético e descarte o sobrenadante.
      9. Repita as etapas de lavagem com etanol para completar um total de dois ciclos de lavagem.
      10. Remova o sobrenadante residual e seque ao ar o tubo aberto em um bloco de aquecimento a 50 °C por 10 min.
      11. Adicione 15 μL de água livre de nuclease e incube em um termomisturador a 1.500 rpm por 5 min em temperatura ambiente.
      12. Coloque o tubo no suporte magnético e transfira o eluato para um novo tubo de microcentrífuga.
      13. Confirme a banda de sgRNA de 98 pb por eletroforese de agarose. Quantifique a concentração de RNA por microespectrofotômetro e eletroforese de agarose, rotule claramente e armazene a -20 °C.
   2. Testar a eficiência do sgRNA
      1. Para determinar a eficiência real dos sgRNAs, prepare o complexo de ribonucleoproteína (RNP) para microinjeção. Misture 1 μL de cada sgRNA (concentração final de 50 ng/μL) com 1 μL de proteína Cas9 (concentração final de 100 ng/μL) no gelo por pipetagem. Entregue 2 nL do complexo RNP em cada embrião no estágio de uma célula por microinjeção.
      2. Às 24 h após a fertilização (hpf), colete 10 embriões para cada Cas9 RNP injetado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e remova cuidadosamente o excesso de meio. Adicione 100 μL de NaOH 50 mM (10 μL por embrião) e incube a 95 ° C por 15 min usando um bloco de aquecimento ou termociclador. Neutralizar o lisado adicionando 10 μL de Tris-HCl 1 M (pH 7,0).
      3. Use o lisado de embrião neutralizado diretamente como modelo para amplificação por PCR. Projete primers para amplificar um fragmento contendo o local alvo com sequências de flanqueamento de ≥100 pb em ambos os lados. Verifique os produtos de PCR por eletroforese em gel de agarose e purifique usando extração de gel quando necessário. Realize o sequenciamento Sanger dos produtos amplificados.
      4. Quantificação da eficiência de edição CRISPR: analise cromatogramas de sequenciamento usando a ferramenta de análise ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Normalize a eficiência de edição em relação a amostras de controle não injetadas seguindo os protocolos recomendados pelo site.
2. Construção de um plasmídeo doador para knock-in
   1. Utilizar a metodologia TEDA (T5 exonuclease DNA assembly) estabelecida para realizar a reação de ligação¹³.
   2. Empregue uma estratégia de montagem Gibson de três fragmentos para a construção do plasmídeo doador knock-in rbm24a-RFP ^{KI zpc:cas9} . O primeiro fragmento inclui um braço de homologia de 1.704 pb 5 'abrangendo a região genômica imediatamente a montante do códon de parada rbm24a . A segunda é a sequência de codificação GFP. O terceiro contém um braço de homologia de 2.274 pb 3' a jusante do códon de parada rbm24a , seguido pelo de expressão zpccas9 posicionado na direção 3' distal ao rbm24a 3'-UTR.
   3. Monte os três fragmentos no local ApaI do vetor pBluescript SK- usando a montagem Gibson.
   4. Verificar o plasmídeo final através da digestão por restrição e da sequenciação de Sanger.
3. Microinjeção e seleção de embriões com integração precoce
   1. Prepare a mistura de injeção contendo 12 pg de plasmídeo doador knock-in rbm24a-RFP ^{KI zpc:cas9} , 200 pg de sgRNA e 600 ng de proteína Cas9 recombinante em água livre de nuclease. Entregue 1-2 nL da mistura no blastodisco de embriões em estágio de uma célula usando técnicas padrão de microinjeção. Aos 30 hpf, rastreie os embriões em busca de padrões de expressão de RFP que imitam a expressão endógena de rbm24a, o que indica a integração do plasmídeo doador já no estágio de clivagem. Selecione esses embriões com integração precoce para reprodução, que mostraram sinal de RFP no cristalino, coração, músculo esquelético e células ciliadas da orelha interna (Figura 3A, B).
      NOTA: Purifique o plasmídeo por extração de fenol-clorofórmio antes da injeção para eliminar quaisquer RNases residuais introduzidas durante a preparação do plasmídeo.
   2. Analisar os padrões de expressão de Rbm24a-RFP materno em embriões da geração F1 derivados de rbm24a-RFP KI^zpc:cas9
4. Avaliação da expressão da proteína Cas9 e eficiência de edição
   1. Para avaliar a eficiência de edição de Cas9, microinjete 200 pg bmp2b sgRNA em embriões rbm24a-RFP KI^zpc:cas9 de 1 célula (Figura 1C,D).
   2. Para avaliar a estabilidade da edição de Cas9, quantifique o número de embriões exibindo fenótipos de dorsalização e realize a análise de sequenciamento de Sanger para avaliar a eficiência da edição (Figura 5A-D).
      NOTA: Embora não tenhamos detectado nenhuma redução na expressão de Cas9 ao longo de três gerações, ainda recomendamos verificar a eficiência de edição em cada geração desta linha knock-in.

2. transgênese de sgRNA na linha rbm24a-RFP ^{KI zpc cas9}

1. Selecione e sintetize sgRNAs para nocaute rbm24a .
   1. Selecione e sintetize candidatos a sgRNA conforme descrito na etapa 1.1.1.
      NOTA: É crucial selecionar sgRNAs que tenham como alvo a metade anterior da região codificante para garantir uma perda de função altamente eficiente. Além disso, se domínios críticos de proteínas forem identificados na região C-terminal, sgRNAs direcionados à extremidade 3 'da sequência codificante também são aceitáveis. O CRISPRscan gera oligos de sgRNA contendo elementos funcionais essenciais, incluindo a sequência promotora T7, a sequência alvo de sgRNA de 20 nucleotídeos e uma sequência de andaime de sgRNA de 16 nucleotídeos. Para obter um nocaute genético materno eficaz, é aconselhável projetar 6-8 candidatos para identificar de forma confiável 3-4 sgRNAs altamente eficientes. Um protocolo detalhado pode ser encontrado em um artigo anterior⁹.
   2. Teste a eficiência do sgRNA no embrião inicial do peixe-zebra, conforme descrito na etapa 1.1.2.
      NOTA: sgRNAs com eficiência de edição superior a 50% são preferidos.
2. Construção de plasmídeo transgênico que expressa sgRNA
   NOTA: Para maximizar a eficiência da edição, recomendamos o uso de quatro sgRNAs distintos e não sobrepostos, cada um separado por pelo menos 36 pb. Esses sgRNAs são ligados individualmente em vetores pU6x:sgRNA (pU6x:sgRNA #1, #2, #3, #4), cada um abrigando um promotor U6 único junto com o andaime 3'¹⁴. Posteriormente, esses quatro vetores U6, cada um contendo um de expressão de sgRNA, são montados no vetor de destino pGGDestISceIEB-4sgRNA via ligação Golden Gate.
   Os vetores pU6x:sgRNA devem ser selecionados sequencialmente. Por exemplo, se estiver clonando três sgRNAs, use os vetores #1 a #3; se clonar quatro sgRNAs, use os vetores # 1 a # 4.
   1. Subclonagem da sequência alvo de sgRNA em vetores pU6x:sgRNA
      1. De acordo com a sequência de sgRNA selecionado, sintetizar os primers de recozimento: Primer direto: TTCGN(19); Primer reverso: AAAC[N(19)]*. Onde GN(19) é a sequência alvo de 20 nt do sgRNA. [N(19)]* representa a sequência do complemento reverso do 19 nt do alvo do sgRNA na direção 3'.
      2. Para recozer os primers, prepare a mistura da seguinte forma: 1 μL de primer direto (100 μM), 1 μL de primer reverso (100 μM), 2 μL de tampão 10x e 16 μL de H₂O deionizado para atingir um volume total de 20 μL. Misture bem.
         NOTA: As sequências de todos os primers foram mostradas na Tabela de Materiais.
      3. Coloque a mistura em um termociclador e execute o programa da seguinte forma: 1 ciclo a 95 ° C por 15 min, depois resfrie gradualmente a 50 ° C a uma taxa de rampa controlada de 0.1 ° C / s e mantenha essa temperatura por 10 min; mantenha a 4 °C durante 10 min.
      4. Preparar a mistura de reacção para clonar a sequência alvo de sgRNA recozido em vectores pU6x-sgRNA conforme descrito: 1 μL de tampão enzimático de restrição 10x, 1 μL de tampão ligase 10x T4, 0,3 μL de ligase T4, 0,3 μL de BsmBI, 0,2 μL de PstI, 0,2 μL de SalI, 1 μL de primário de sgRNA recozido, 5 μL de pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) e 1 μL de H₂O deionizado, ajustando o volume final da reação para 10 μL.
      5. Misture bem os componentes da reação e execute o seguinte programa de termociclador: 6 ciclos (37 °C por 20 min, 16 °C por 15 min), 1 ciclo a 37 °C por 10 min, 1 ciclo a 55 °C por 15 min, 1 ciclo a 80 °C por 15 min.
      6. Para transformação, descongele as células competentes com DH5α no gelo, misture suavemente 50 μL das células com a mistura de ligação sacudindo o tubo e incube a mistura no gelo por 30 min. Execute um choque térmico a 42 °C por 60 s e, em seguida, transfira imediatamente o tubo de volta para o gelo por 2 min. Espalhar as células transformadas para uma placa LB contendo 100 μg/ml de spectinomicina e incubar a placa de cabeça para baixo a 37 °C durante pelo menos 16 h para permitir a formação de colónias.
      7. Para PCR de colônias, escolha cada colônia bacteriana com uma ponta de pipeta e transfira para 10 μL de H₂O. Ressuspenda a colônia completamente pipetando para cima e para baixo para garantir a dispersão completa para análise de PCR a jusante. Prepare a mistura de reação de PCR combinando 5 μL de 2x Taq Mix, 2 μL de líquido de colônia, 0,4 μL de primer direto M13 (10 μM) e primer reverso (10 μM) e 2,2 μL de H₂O deionizado, resultando em um volume total de reação de 10 μL.
      8. Execute o programa conforme mostrado abaixo: 1 ciclo a 94 ° C por 3 min, 23 ciclos (94 ° C por 15 s, 55 ° C por 15 s, 72 ° C por 30 s) e 1 ciclo a 72 ° C por 5 min.
      9. Submeter os produtos da PCR a eletroforese. Selecione a colônia positiva com o tamanho esperado de 482 pb (Figura 6).
      10. Inocular o líquido restante da colônia em 3 mL de meio LB suplementado com 100 μg / mL de espectinomicina. Incubar a 37 °C com agitação a 200 rpm durante 14 h.
      11. Extraia plasmídeos da cultura bacteriana usando o Kit Plasmid Miniprep de acordo com as instruções do fabricante. Medir a concentração plasmídica utilizando um microespectrofotómetro.
      12. Submeta os plasmídeos extraídos ao sequenciamento de Sanger usando o primer direto M13. Alinhe os resultados do sequenciamento com o mapa vetorial U6 esperado para verificar a inserção correta do alvo sgRNA.
   2. Montagem do vetor pGGDestEB-4sgRNA
      NOTA: Conforme ilustrado na Figura 7, quatro de expressão de sgRNA acionados por U6 podem ser ligados de forma eficiente ao vetor de backbone pGGDestEB-4sgRNA usando a montagem Golden Gate. O número de sgRNAs a serem ligados determina o uso de vetores. Por exemplo, ao montar quatro de sgRNA, use pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 e pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Prepare os 20 μL de mistura de reação Golden Gate contendo: 2 μL de tampão enzimático de restrição 10×, 2 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 100 ng de cada construção pU6x:sgRNA#x, 50 ng de vetor de destino pGGDestIEB-4sgRNA, 1 μL de BsaI, 1 μL de T4 DNA ligase e água deionizada para ajustar o volume final para 20 μL.
      2. Execute a reação de montagem Golden Gate através de 3 ciclos de 20 min a 37 ° C, seguidos por 15 min a 16 ° C e, em seguida, complete com uma incubação final de 15 min a 80 ° C para inativação enzimática.
      3. Para transformar, transfira 5 μL da mistura de reação para células competentes e placa para meio LB suplementado com ampicilina.
      4. Realize a PCR da colônia rastreando as colônias usando primers Dest direto e reverso (consulte a Tabela de Materiais) para confirmar a presença de inserção (Figura 8).
         NOTA: A banda principal de 2.415 pb e um padrão de escada devem estar presentes para um clone positivo.
      5. Extraia plasmídeos de colônias positivas e sequenciar usando primers diretos e reversos Dest para cada alvo de sgRNA.
      6. Alinhe os resultados do sequenciamento de Sanger com a sequência vetorial prevista para verificação.
3. Microinjeção e pré-triagem de fundadores transgênicos
   1. Colete embriões gerados por peixes homozigotos rbm24a-RFP KI^zpc:cas9 .
   2. Prepare a mistura de injeção combinando 1 μL de pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μL) com 1 μL de mRNA de Tol2 transposase (50 ng/μL).
      NOTA: Purifique o plasmídeo usando extração de fenol-clorofórmio antes da injeção para remover qualquer RNase residual que possa ter sido introduzida durante o processo de extração do plasmídeo. O plasmídeo e o mRNA de Tol2 foram diluídos diretamente em água pura.
   3. Coloque uma lamínula de vidro em um prato de 15 cm. Alinhe os embriões ao longo da borda da lamínula e remova cuidadosamente o excesso de água usando uma pipeta. Injete 2 nL da mistura no blastodisco de cada embrião em estágio de 1 célula. Após a injeção, enxágue suavemente os embriões com água azul e transfira-os para um prato fresco. Por fim, coloque o prato em uma incubadora a 28 °C para cultivo.
      NOTA: Prepare a solução de trabalho de azul de metileno (água azul) da seguinte forma: Dissolva 180 g de sal marinho em 2,7 L de água destilada e esterilize para fazer 100x caldo de água do mar. Dilua este estoque 200 vezes com água destilada estéril para obter 1/100x de água do mar. Adicione 10 μL de solução estoque de azul de metileno a 5% (m/v) a 1 L desta água do mar 1/100x para preparar a solução de trabalho final.
   4. Aos 24 hpf, selecione embriões exibindo expressão robusta e onipresente de BFP. A 4 dpf, eleve apenas aqueles que mantêm fortes sinais fluorescentes transgênicos (Figura 9).

3. Caracterização de embriões transgênicos duplos

1. Fenotipagem de embriões transgênicos duplos
   1. Colete embriões de fêmeas fundadoras transgênicas em mosaico acasalando com machos do tipo selvagem.
   2. Pegue os embriões positivos para BFP (BFP⁺) no estágio de uma célula sob um esteromicroscópio de fluorescência.
   3. Identifique defeitos de desenvolvimento emergentes em embriões BFP⁺ , mas não em embriões BFP^- .
   4. Fixe os embriões em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 ° C durante a noite. Realize hibridização in situ de montagem inteira, coloração por imunofluorescência ou outras análises histológicas quando necessário.
      NOTA: Apenas fenótipos defeituosos que surgem exclusivamente em embriões que expressam sgRNA positivos para GFP ou BFP são confiáveis. As conclusões devem ser tiradas com cautela e os fenótipos mutantes maternos devem ser comprovados por mais de 10 casos.
2. Genotipagem de embriões maternos mutantes
   NOTA: Para identificação de Mrbm24a embriões, eles podem ser facilmente captados pela ausência de Rbm24a-RFP sob um microscópio de fluorescência. Em contraste, a identificação de mutantes maternos de outros genes depende principalmente de uma estratégia de aspiração celular antes da ativação do genoma zigótico, seguida pela análise de RT-PCR de mRNAs maternos nas células coletadas (Figura 10).
   1. Aspiração celular
      1. Prepare uma solução de agarose a 1,5% dissolvendo-a em tampão de Ringer 1/3x e fervendo até derreter. Despeje a solução em uma placa de Petri de 90 mm e insira um molde (WPI, moldes z) na agarose derretida. Depois de solidificado, remova suavemente o molde, resultando em uma placa pronta para uso.
      2. Utilize capilares de vidro e um extrator para criar agulhas seladas por fusão. Para agulhas de aspiração celular ideais, defina dois pesos leves e a potência de aquecimento em Lv1: 60 e Lv2: 90 e selecione o procedimento Step2. Apare as pontas capilares com pinças pontiagudas (consulte a Tabela de Materiais) para obter um diâmetro de abertura de 30-40 μm. Posteriormente, crie um espigão na ponta da agulha usando uma microforja, que auxilia na penetração e minimiza os danos ao embrião.
      3. Acasalar supostas fundadoras com peixe-zebra do tipo selvagem e coletar os embriões. Isole os embriões positivos para BFP no estágio unicelular.
      4. A 3 hpf, descorione os embriões por incubação em 1 mg / mL de Pronase em 1/3x tampão de Ringer por 10 min e pipetagem suave, e coloque cuidadosamente os embriões na placa de agarose inundada com 1/3x tampão de Ringer suplementado com 1x penicilina-estreptomicina. Reoriente os embriões para que o blastômero seja direcionado para a ponta capilar.
         NOTA: É crucial transferir os embriões com cuidado, pois eles são extremamente frágeis sem a proteção do córion. Não os deixe tocar a superfície do meio!
      5. Empregue um microinjetor para aspirar 20-40 células de cada embrião, reduzindo cuidadosamente a pressão de equilíbrio que compensa a força de aspiração da ação capilar¹⁵. Libere essas células em 2 μL de H₂O deionizado na borda de abertura dos tubos de PCR, aumentando a pressão de equilíbrio.
         NOTA: Para evitar contaminação cruzada, a agulha de vidro deve ser limpa aspirando e ejetando H₂O 3x deionizado antes de cada aspiração.
      6. Adicione 200 μL de reagente de extração de RNA para lavar as células e armazene temporariamente os tubos no gelo. Posteriormente, analise os genótipos de células de embriões com ou sem defeitos de desenvolvimento.
         NOTA: As células preservadas no reagente de extração podem ser armazenadas a -20 °C até que os embriões correspondentes exibam fenótipos aberrantes.
      7. Deixe os embriões após a aspiração celular na placa de agarose ou coloque-os individualmente em placas de 24 poços inundadas com 1/3x solução de Ringer contendo 1x penicilina-estreptomicina.
         NOTA: Deve-se ter cuidado com a transferência dos embriões descorionados! Normalmente, examinamos de 20 a 40 embriões em um experimento, o que leva aproximadamente 1 h.
   2. Análise de mRNA materno de interesse em células aspiradas
      1. Adicione 40 μL de clorofórmio às células do reagente de extração e misture suavemente. Centrifugue a mistura a 12.000 × g por 1 min a 4 °C.
      2. Colete cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 1 μL de solução de glicogênio (20 mg / mL) e um volume igual de isopropanol (se o volume do sobrenadante for de 100 μL, adicione 100 μL de isopropanol) e misture bem. Incubar a mistura a -20 °C durante 30 min para facilitar a precipitação.
         NOTA: Devido à pequena quantidade de RNA total nas células aspiradas, o glicogênio deve ser adicionado para aumentar a eficiência da precipitação e facilitar a visualização do precipitado.
      3. Centrifugar a amostra a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante.
      4. Lave o pellet 2x com adição de 500 mL de etanol a 70% e centrifugação a 12.000 × g por 1 min.
      5. Descarte o líquido e abra a tampa para permitir que o pellet seque em temperatura ambiente por 5 min.
      6. Adicione 7 μL de água para dissolver o pellet. Realize a transcrição reversa usando o kit de síntese de cDNA de primeira fita, seguindo o protocolo detalhado fornecido no manual de instruções.
      7. Amplificar toda a região de codificação com primers apropriados (ver Tabela de Materiais) e executar eletroforese de agarose.
      8. Clone os produtos de PCR e sequencie pelo menos 30 clones para cada embrião para analisar a mutação emergida nos mRNAs.
         NOTA: Para confirmar que a presença de um fenótipo defeituoso é causada por mutação direcionada do fator materno interessado, todos os embriões (n > 5) com fenótipos defeituosos devem mostrar a ausência de transcritos maternos do tipo selvagem. Por outro lado, os mRNAs maternos do tipo selvagem devem estar presentes em todos os embriões que expressam sgRNA em desenvolvimento normal (n > 5). Ao mesmo tempo, em embriões negativos para sgRNA, apenas mRNAs de tipo selvagem são detectáveis (n > 5).

Geração rápida de mutantes maternos rbm24a
Construímos um vetor transgênico que permite a expressão de um marcador materno de BFP e quatro sgRNAs altamente eficientes direcionados à sequência codificadora rbm24a. Após a introdução deste vetor em embriões homozigotos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 via transposição de Tol2, Mrbm24a foi fácil e rapidamente identificado entre embriões F1 positivos para BFP devido à ausência da proteína Rbm24a-RFP (Figurae 11A-D). Aproximadamente 30% a 70% dos embriões positivos para BFP não tinham sinal de RFP. Esses embriões Mrbm24a exibiram ausência de recrutamento de mRNAs de plasma germinativo para os grânulos germinativos e falta de PGCs a 24 hpf, conforme mostrado por hibridização in situ usando sonda nanos3 (Figura 11E-H). Esses embriões de Mrbm24a sobreviveram até a idade adulta, mas exibiram fenótipo totalmente masculino e estéril. Todos os peixes machos Mrbm24a não conseguiram fertilizar os ovos desovados por fêmeas do tipo selvagem (Figura 11I, J). Anatomicamente, em contraste com os machos do tipo selvagem, que possuem testículos ao longo de ambos os lados da bexiga natatória, os peixes Mrbm24a exibiram deposição de tecido adiposo nos locais correspondentes (Figura 11K, L). As análises histológicas por seccionamento e coloração H & E revelaram uma completa ausência de células germinativas masculinas e espermatozóides em peixes Mrbm24a (Figura 11M, N). Esses achados demonstram coletivamente uma completa ausência de PGCs após a perda da função materna de Rbm24a, ressaltando o papel crítico de Rbm24a na formação de PGC.

Para validar ainda mais que os embriões BFP+RFP- são de fato Mrbm24a, examinamos a expressão da proteína Rbm24a e RNA em embriões BFP+RFP- no estágio de quatro células usando Western blot (WB) e RT-qPCR, respectivamente. Nossos resultados demonstraram que ambas as proteínas Rbm24a eram quase indetectáveis em embriões BFP+RFP- (Figura 12A,B), confirmando que esses embriões são Mrbm24a. Para determinar o tipo de mutação de rbm24a, extraímos RNA total de embriões BFP+RFP- no estágio de 4 células, realizamos transcrição reversa e amplificação por PCR da sequência codificadora de rbm24a. Os produtos de PCR foram posteriormente clonados e submetidos ao sequenciamento de Sanger. Nossos dados de sequenciamento revelaram que a edição de genes ocorreu em embriões BFP+RFP- e BFP+RFP+, resultando em grandes deleções de fragmentos, bem como pequenos indels. Enquanto os transcritos rbm24a do tipo selvagem permanecem detectáveis em embriões BFP + RFP +, eles estão completamente ausentes dos embriões BFP + RFP- ( Figura 12C-E ), embora alguns embriões BFP + RFP - retenham transcritos mais longos contendo pequenos indels que não são distinguíveis por eletroforese de agarose ( Figura 12D ). Esses achados demonstram coletivamente que obtivemos com sucesso Mrbm24a.

Geração de mutante materno para nanog
Para avaliar ainda mais a eficácia dessa estratégia de nocaute condicional específica para oócitos, usamos três RNAs de guia único (sgRNAs) altamente eficientes direcionados à sequência codificadora de nanog 9. Construímos um vetor transgênico capaz de expressar um marcador GFP materno ao lado desses três sgRNAs. Este vetor foi introduzido em embriões homozigotos rbm24a-RFP KIzpc:cas9 via transposição de Tol2 (Figura 13A). As fêmeas transgênicas foram cruzadas com os machos selvagens. A análise da progênie F1 revelou que 12%-32% dos embriões exibiram fluorescência verde. Entre esses embriões positivos para GFP, aproximadamente 22% -60% exibiram um fenótipo dorsalizado consistente com mutantes nanog maternos (Figura 13B-D).

Figura 1: linha rbm24a-RFP KIzpccas9 para edição do genoma. (A) Um knock-in marcado com RFP e um zpccas9 foram integrados ao íntron terminal do gene rbm24a . (B) A expressão de Rbm24a-RFP foi detectada em embriões da linhagem rbm24a-RFP KI zpccas9 . Barras de escala = 200 μm. (C,D) A injeção de bmp2b sgRNA em embriões rbm24a-RFP KI zpccas9 levou a um fenótipo dorsalizado significativo. Barra de escala = 200 μm. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Principais etapas da edição do genoma específico do oócito. Fluxo de trabalho do experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Seleção do fundador de rbm24a-RFP KIzpc:cas9. (A) Embriões com integração precoce. (B) Expressão espacial de transcritos rbm24a . Barras de escala = 250 μm. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Construção da linha zpc:cas9 knockin. (A) Localização de Rbm24a-RFP em embriões knock-in F1. Barras de escala, 200 μm. (B) Eficiência de transmissão da linha germinativa de três peixes fundadores independentes rbm24a-RFP KI zpc:cas9 com integração precoce. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A expressão materna de Cas9 na linha knock-in zpc:cas9 suporta eficiência de edição alta e estável. (A) Fenótipos de embriões da linha transgênica Tg(zpc:cas9) e da linha knock-in rbm24a-RFP KIzpc:zcas9 após injeção de bmp2b sgRNA. Barra de escala: 1 mm. (B) Análise estatística de fenótipos dorsalizados na linha transgênica Tg(zpccas9) e na linha knock-in rbm24a-RFP KI zpc:zcas9 após injeção de bmp2b sgRNA. Os fenótipos dorsalizados foram categorizados de acordo com os padrões relatados anteriormente, onde N indica embriões normais e C1 a C5 representam fenótipos dorsalizados progressivamente graves23. (C) Análise quantitativa da eficiência de edição do gene bmp2b. (D) Frequência de fenótipos dorsalizados em embriões de três gerações da linha knock-in rbm24a-RFP KI zpczcas9 após injeção de bmp2b sgRNA. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise em gel de agarose de clones de pU6x:sgRNA. Os clones 1 e 4 são clones positivos definitivos, enquanto o 2 é suspeito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Representação esquemática da montagem da Golden Gate. A montagem incorpora quatro que expressam sgRNA, acionados por promotores distintos de U6 de peixe-zebra. Os locais de reconhecimento Bsa I exclusivos e suas saliências distintas são denotados por triângulos codificados por cores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Análise de clones pGGDestEB-4sgRNA positivos. 1-4 são produtos de PCR para clones positivos. Observe o padrão de escada e que as bandas principais são ligeiramente maiores do que as das pistas 5 e 6, que são produtos de PCR dos vetores de backbone pGGDestEB-4sgRNA vazios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Fundadores transgênicos F0 representativos com fluorescência generalizada de BFP. Barras de escala = 250 μm. Abreviaturas: BFP = proteína fluorescente azul; hpf = horas após a fertilização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Estratégia de aspiração celular para examinar simultaneamente o genótipo e o fenótipo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: mutantes maternos rbm24a sem PGCs. (A-D) Identificação de embriões de Mrbm24a com base na ausência de fluorescência vermelha. Os asteriscos indicam os embriões mutantes. (E, F) nanos3 mRNA não consegue ser recrutado para os grânulos germinativos no estágio de quatro células. Barra de escala = 200 μm. (G,H) nanos3 mRNA estão ausentes em embriões Mrbm24a a 24 hpf. Barra de escala = 250 μm. (I,J) Embriões resultantes de cruzamentos entre fêmeas selvagens e machos Mrbm24a não sofreram clivagem. n = 100 para cruzamento com tipo selvagem; n = 96 para cruzamento com Mrbm24a. Barra de escala = 1 mm. (K,L) Mrbm24a adultos mutantes não possuem estruturas testiculares. Barra de escala = 2 mm. (M,N) Os túbulos testiculares em adultos com Mrbm24a são desprovidos de células germinativas e exibem uma morfologia vacuolar. Barra de escala =12,5 μm. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Genotipagem de embriões Mrbm24a . (A) Validação de Western blot da depleção de Rbm24a-RFP em mutantes RFP−/BFP+ . n = 40. (B) O nível de transcrito de rbm24a é significativamente reduzido em embriões RFP-&BFP+ , conforme analisado por qRT-PCR. (C) Esquema de primers abrangendo o ORF de transcritos rbm24a . As sequências-alvo de sgRNA estão listadas na Tabela de Materiais. (D) Análise eletroforética de amplicons rbm24a ORF de embriões RFP+&BFP+ e RFP-&BFP+ . (E) Mutações confirmadas por sequenciamento de Sanger. Essa figura é reproduzida de Zhang et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Geração de mutantes maternos nanog . (A) Diagrama esquemático ilustrando o procedimento para obter mutantes maternos nanog . (B) A progênie positiva para GFP exibe características fenotípicas de mutantes maternos nanog . Barra de escala, 1 mm. (C) Taxa de transmissão da linha germinativa de peixes transgênicos F0 que expressam nanog sgRNA. (D) Proporção de embriões positivos para GFP exibindo o fenótipo mutante materno nanog . Abreviaturas: M = mutante materno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este protocolo foi concedido como patente pela Administração Nacional de Propriedade Intelectual da China, o que aliviará o uso restrito do método após obter a permissão dos autores. Os autores declaram que não têm outros interesses concorrentes ou financeiros.