Um modelo camundongo da administração contínua contínua de pressão positiva nas vias aéreas neonatal e o método de corte pulmonar preciso para medir a contratilidade das vias aéreas

Resumo

Demonstramos um método não invasivo para administrar níveis variados de CPAP a camundongos neonatais não anestesiados. A técnica tem como objetivo imitar parcialmente a administração de CPAP em muitos bebês prematuros, a fim de avaliar seus efeitos no desenvolvimento pulmonar. Também demonstramos os efeitos do CPAP na contratilidade das vias aéreas usando o método de corte pulmão de precisão.

Resumo

Forças mecânicas associadas ao suporte respiratório de pressão positiva usado na terapia intensiva de bebês prematuros podem ter consequências tanto positivas quanto inadvertidas para o desenvolvimento pulmonar. O suporte positivo de pressão melhora a troca gasosa pulmonar, limita a atelectasia e melhora a oxigenação sistêmica, mas os efeitos prejudiciais de modalidades invasivas, como a ventilação mecânica, no desenvolvimento pulmonar também são bem conhecidos. No entanto, existem grandes lacunas em nossa compreensão sobre os efeitos adversos de formas menos invasivas de ventilação. Aqui, a pressão positiva contínua nas vias aéreas (CPAP) é uma das modalidades mais comuns de suporte respiratório, representando a menos invasiva do espectro de pressão positiva. Uma grande limitação no estudo do desenvolvimento das vias aéreas humanas é a falta de modelos adequados à idade e a capacidade de administrar CPAP a pequenos animais neonatais. Resolvemos esse problema desenvolvendo um modelo de camundongo neonatal de CPAP administrado diariamente a camundongos recém-nascidos acordados e não anestesiados — um modelo que utiliza níveis clinicamente relevantes de CPAP em um estágio do desenvolvimento pulmonar de camundongo, correspondente a bebês prematuros, quando eles provavelmente receberão CPAP na UTI. Aqui, demonstramos nosso modelo de CPAP, que inclui um sistema conveniente e personalizado que pode administrar CPAP de forma não invasiva para o recém-nascido não anestesiado, com níveis facilmente ajustáveis. Também fornecemos uma demonstração do método de corte pulmão de precisão para a medição da hiperreatividade das vias aéreas ex vivo. O PCLS é descrito aqui porque oferece uma leitura funcional conveniente do sistema pulmonar, o que pode ser tecnicamente desafiador em modelos animais pequenos (neonatais), e também tem ampla aplicabilidade a outros modelos não relacionados ao CPAP. Apresentamos dados que demonstram que o CPAP provoca hiperreatividade nas vias aéreas, o que pode ter importantes implicações clínicas para a escolha da modalidade de suporte respiratório na terapia intensiva de bebês prematuros.

Introdução

Preocupações relacionadas à respiração, como apneia e dificuldade respiratória, para muitos bebês prematuros requerem modos de suporte respiratório que salvam vidas, o que, infelizmente, contribui para a morbidade infantil e para internações hospitalares prolongadas. O suporte respiratório suplementar de pressão positiva e_O2, incluindo ventilação mecânica (MV) e CPAP menos invasivo, são modalidades comuns de suporte respiratório. No entanto, o principal problema de curto e longo prazo para sobreviventes do período crítico da prematuridade permanece a doença crônica das vias^{aéreas brônquicas} 1,2,3,4, manifestada como sibilos/asma ao longo da vida, função pulmonar deficiente e diminuição da capacidade de exercício. Embora os efeitos nocivos do_O2 e MV suplementares tenham sido amplamente implicados na patogênese da displasia broncopulmonar (BPD) e nas morbidades respiratórias de longo prazo^{há décadas} 5,6,7,8, algumas evidências sugerem que formas não invasivas de suporte respiratório, como o CPAP, também podem ter efeitos não intencionais no pulmão ^{em desenvolvimento 6,9,10,11,12}. No entanto, muito pouco se sabe sobre os efeitos adversos do CPAP, principalmente devido aos desafios técnicos associados à administração não invasiva em animais neonatais.

Dado o aumento geral da taxa de asma^{pediátrica 13} e o aumento das taxas de sobrevivência de bebês prematuros após a estadia na UTI neonatal, compreender os mecanismos que iniciam mudanças estruturais e funcionais adversas nas vias aéreas traqueobrônquicas imaturas e como elas contribuem para doenças pulmonares duradouras independentemente do suplemento_O2 é uma necessidade clínica e de pesquisa importante e não atendida. Evidências emergentes sugerem que o CPAP neonatal pode ter efeitos adversos a longo prazo na função das vias aéreas e contribuir para distúrbios de sibilado, o que é significativo, já que o CPAP se tornou a modalidade preferida de suporte respiratório nos esforços para evitar a toxicidade por_O2 devido ao suplemento_O2. Os desafios técnicos associados à administração do CPAP a animais neonatais pequenos e adequados para a idade dificultaram o progresso na compreensão dos efeitos do CPAP (sejam benéficos ou prejudiciais) no desenvolvimento pulmonar. Resolvemos esse problema desenvolvendo o primeiro modelo neonatal de camundongos^{de CPAP} 10,11,12,14,15 entregue diariamente (com níveis variados de CPAP por 3 horas ao dia) a camundongos acordados e não anestesiados desde o nascimento, permitindo assim o estudo de níveis clinicamente relevantes de CPAP em estágio de desenvolvimento pulmonar comparável a bebês muito prematuros (~24-28 semanas de feto) que provavelmente receberão ^{CPAP 16, 17}. Realizamos ressonâncias magnéticas no modelo neonatal de camundongos e confirmamos que o CPAP resulta em inflação pulmonar¹¹ e que o CPAP na primeira semana pós-natal causa um aumento prolongado (3 semanas de idade) na reatividade das vias aéreas (ou seja, 2 semanas após o CPAP^)10,11,12,14, o que está alinhado com chiado em crianças pequenas (3-4 anos de idade). Aqui, fornecemos uma demonstração detalhada do nosso sistema CPAP personalizado para camundongos recém-nascidos e descrevemos um método conveniente para avaliar a contratilidade das vias aéreas usando o método ex vivo de corte pulmão de precisão (PCLS).

O PCLS oferece uma excelente e conveniente oportunidade para investigar os mecanismos de hiperrreatividade das vias aéreas e suas respectivas vias. Usando o método PCLS, as vias aéreas individuais são imagens em tempo real para medir o estreitamento das vias aéreas em resposta a um broncoconstritor, como a metacolina, após o pré-tratamento das vias aéreas com inibidores específicos de receptores/canais. Esses estudos são importantes para entender as consequências fisiopatológicas do CPAP na prematuridade, fornecendo intervenções direcionadas e acionáveis que permitam otimizar o cuidado clínico necessário, ao mesmo tempo em que mitigam possíveis consequências ao longo da vida.

Protocolo

Experimentos são realizados em camundongos grávidas em tempos prolongados, monitorados diariamente para determinar o dia do nascimento. Os camundongos são tratados com ou sem CPAP em 21% de_O2 durante a primeira semana de vida pós-natal. Normalmente, os pulmões são removidos em preparação para a medição da reatividade AW usando o método de corte pulmonar de precisão (PCLS) 2 semanas após o CPAP, embora tais medições sejam possíveis a partir de P8 dias (imediatamente após o CPAP) ou até a vida adulta. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do Instituto Nacional de Saúde (NIH) para cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Case Western Reserve University.

1. Montagem da máscara CPAP

1. Construa uma máscara individual a partir da extremidade cortada de uma seringa de 5 mL contendo a seção de bloqueio Luer para conexão dos tubos que permitam a entrega de fluxo de ar e pressão positiva às vias aéreas do camundongo (Figura 1A).
2. Pré-fure o componente da seringa da máscara para acomodar um Luer-Lock roscado conectado a um cotovelo, Luer para a conexão da mangueira e tubo padrão de aquário (3/8" de diâmetro).
3. Use o tubo da porta lateral para permitir que o fluxo de ar excorrente passe por um vazamento ajustável a jusante para ajustar a contrapressão nos pulmões do mouse e um manômetro personalizado para monitorar o nível do CPAP em tempo real.

2. Design da gola

1. Construa a gola com seções cortadas nas pontas dos dedos de luvas de laboratório padrão de tamanho pequeno. Use para conectar o mouse à unidade de máscara.
2. Use um furador (1/4 de polegada) para criar um furo no ápice da ponta do dedo cortado, que forma uma abertura uniforme e consistente para acomodar a face e a cabeça do mouse.
   NOTA: O furador garante um tamanho consistente da máscara, mas furadores maiores são necessários por volta do P4 para acomodar o crescimento do mouse.

3. Construção do manômetro

1. Construa um manômetro a partir de duas pipetas sorológicas descartáveis conectadas por tubos curvos de aquário (Figura 1A). Certifique-se de que o manômetro esteja meio cheio com água contendo uma gota de corante colorido para ajudar na visualização do nível do CPAP.
2. Conecte o manômetro em série com, e a jusante, de um controlador de fluxo (taxa de fluxo ~600-700 mL/min) e da máscara.

4. Ajustar a coleira e a máscara no rato

1. Para colocar a coleira no rato (com 1 dia), primeiro posicione-a na extremidade aberta da máscara, que, por meio de manobras cuidadosas, precisa ser esticada para acomodar o rosto e a cabeça do rato.
2. Insira a face do rato pela abertura da coleira, que está suavemente relaxada a partir da posição esticada sobre o rosto/cabeça. Com ~4 dias de idade, corte pequenas fendas na abertura da gola para acomodar o crescimento e a cabeça maior do rato, embora também seja recomendado um soco inteiro de tamanho maior.

5. Administração de CPAP a múltiplos camundongos simultaneamente

1. Crie um sistema capaz de administrar CPAP para múltiplos (até 10) camundongos neonatais usando uma série de controladores de fluxo e manômetros (Figura 1B). Forneça o fluxo de ar a montante por um tanque de ar comum com regulador padrão e passe por um controlador de fluxo que fornece o fluxo geral para todos os dispositivos CPAP e unidades de máscara/coleira.
2. Faça bolhas no ar em um reservatório de água para umidificação antes de passar diretamente para as unidades CPAP e administre CPAP a cada animal de forma independente.
   NOTA: Um mouse controle recebe uma máscara, o mesmo fluxo de ar, mas sem pressão de retorno ou CPAP.
3. Realize todos os experimentos em uma almofada térmica com água recirculada a ~38 ^°C para manter uma temperatura corporal estável.

6. Linha do tempo

1. Monitore os camundongos grávidos diariamente para determinar a data de nascimento e então realize a sessão inicial de CPAP no dia seguinte (P1 dia de idade) por 2 horas (Figura 2) para minimizar o tempo em que os filhotes ficam longe de uma mãe amamentadora.
2. Nos dias seguintes (P2-P7), realize cada sessão de CPAP por um período de 3 horas. Realize o CPAP por mais de 7 dias, se necessário, e em qualquer nível de CPAP, embora 7 dias de CPAP a 6 cmH₂O sejam usados rotineiramente.
3. Em seguida, avalie os animais quanto aos efeitos do CPAP na reatividade das vias aéreas, seja imediatamente após (P8) o fim do CPAP (P7) ou efeitos de longo prazo (por exemplo, P21 ou idade adulta) usando a preparação de corte pulmonar de precisão (seção 8).

7. Colheita de tecidos e contratilidade das vias aéreas

1. Colhe pulmões para técnicas moleculares ou fisiológicas (por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), western blots, imunohistoquímica, RNASeq, proteômica, metabolômica, etc.).
   NOTA: O foco principal é nos efeitos do CPAP na contratilidade das vias aéreas, que pode ser avaliada in vivo (anestesiada e ventilada mecanicamente, P21 dias ou mais) para mecânica do sistema respiratório ou ex vivo usando o PCLS (P8 dias ou mais). Este último tem grandes vantagens para investigar compostos ou agentes que visam vias específicas que podem não ser adequadas para uso em estudos in vivo .

8. Extração/preparação de pulmão inteiro para o método de corte pulmão de precisão (PCLS)

1. Eutanasie o camundongo por overdose anestésica (injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina/xilazina; 100 mg/kg/10 mg/kg, respectivamente) para preparar os pulmões para medições ex vivo da reatividade das vias aéreas à metacolina aplicada em banho.
2. Coloque o camundongo em deitado para a canulação da traqueia usando uma seringa preenchida com agarose. Insira a cânula por uma pequena incisão ventral no pescoço e avance ~3 mm antes de ser fixada com sutura.
3. Injete suavemente agarose liquefeita (40 °C) para inflar os pulmões (0,4 mL para camundongos P8; 0,8 mL para camundongos P21) e coloque o camundongo na geladeira por 30 minutos para permitir que a agarose esfrie e gelifique.

9. Cesariana pulmonar para o método PCLS

1. Depois que a agarose esfriar, insira um lobo pulmonar (da escolha) em agarose 2%, coloque-o sobre um vibratôme, corte em seções de 300 μm e imerga em solução de DMEM + Pen/Strep para incubação durante a noite (5% CO₂, 37°C).
2. No dia seguinte, enxágue as fatias pulmonares em HBSS e monte-as em uma câmara de gravação para imagens ao vivo das respostas das vias aéreas ao desafio da metacolina.
   NOTA: Os resultados apresentados representam apenas o tratamento ingênuo (controle, ou seja, sem CPAP) e apenas o tratamento com CPAP, e não são usados agonistas ou antagonistas/inibidores.
   1. Realize imagens das vias aéreas.
      1. Coloque as fatias pulmonares em uma câmara de perfusão feita sob medida e cubra-as com uma folha fina e leve de malha e uma capa de proteção, que são mantidas no lugar com graxa de silicone.
      2. Depois, monte a câmara de gravação contendo a fatia em um microscópio e perfunde (7 mL/min) continuamente com HBSS em temperatura ambiente usando uma bomba de perfusão.
      3. Use um microscópio montado com uma câmera para identificar vias aéreas individuais. Após um período inicial de 3 minutos de registro inicial, perfunde a câmara com concentrações crescentes de metacolina (2 min para cada concentração) e registre continuamente as mudanças na área do lúmen das vias aéreas.
   2. Quantifique o tamanho das vias aéreas.
      1. Identifique uma única imagem (software ImageJ) de uma via aérea para uma dada concentração de metacolina (e linha de base) e quantifique a área do lúmen selecionando o limiar de ajuste para garantir que a área do lúmen esteja totalmente capturada (Figura 3A).
      2. Depois, aplique essas configurações a imagens subsequentes da mesma via aérea em diferentes concentrações (ou seja, o mesmo limiar é usado para uma dada via aérea).
      3. Depois, selecione a área do lúmen para medição usando a ferramenta de traço da varinha (Figura 3B) e pressione Ctrl + M (Figura 3C) para quantificar automaticamente a área do lúmen em pixels. Repita isso para cada concentração de metacolina; os dados estão numericamente disponíveis para representação gráfica com reatividade das vias aéreas expressa como uma fração do tamanho do lúmen de referência (Figura 3).
   3. Tamanho da amostra
      1. Escolha as vias aéreas aleatoriamente e realize a resposta à metacolina em uma seção de ventilação pulmonar/a, embora normalmente múltiplas seções por animal possam ser avaliadas. Assim, os grupos de tratamento podem consistir em múltiplas vias aéreas/animais de várias ninhadas.
      2. Categorize as vias aéreas em grandes (>0,05 mm²) ou pequenas (<0,05 mm²), já que já foi determinado anteriormente que o CPAP afeta vias aéreas de diferentes tamanhos.

10. Entrega de drogas

1. Analise usando seções expostas (ou incubadas com) siRNAs que visem vias específicas por 48 horas após serem excisadas e seccionadas.
   NOTA: Agonistas e antagonistas específicos para vários receptores também podem ser convenientemente aplicados nas seções pulmonares de forma aguda, o que é uma vantagem caso tais compostos não sejam adequados ou seguros para administração in vivo .
2. Alternativamente, os pulmões podem ser fixados por inflação (formalina) em pressões padronizadas de inflação (25_{cmH 2}O), preservados e preparados para imunohistoquímica e coloração para análise posterior usando microscopia confocal.

Resultados

Análise por ressonância magnética do volume pulmonar durante o CPAP neonatal
A análise de ressonância magnética foi usada para visualizar mudanças no volume pulmonar em camundongos de 3 dias, não anestesiados, que respiravam espontaneamente (n = 4 camundongos). O volume pulmonar aumentou com o aumento das pressões de inflação (ou seja, CPAP) até 9_{cmH 2}O (Figura 4A). Imagens representativas de um camundongo de 3 dias de idade, c...

Discussão

O CPAP é uma modalidade necessária de suporte respiratório para bebês prematuros com dificuldade respiratória. O CPAP é sobreposto à respiração espontânea e serve para melhorar a oxigenação sistêmica ao manter o volume pulmonar elevado e prevenir o colapso alveolar e a atelectasia. Assim, há grandes benefícios que salvam vidas no CPAP, e foi demonstrado que ele melhora o desenvolvimento alveolar, embora os benefícios possam depender da gravidade e duração do^CPAP

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 5 mL	Fisher Scientific	149556458
Seringa de 1 mL	Fisher Scientific	309659	Injetar agarose através da cânula
Perfurador de 1/4"	McMaster Carr	3427A57
Moldes de embedding 22 x 22 x 20	Fisher Scientific	22-19
Agulhas de 23 G	Fisher Scientific	305193	Para prender cânula à seringa, outros tamanhos seriam necessários para idades diferentes de P21 e nbsp;
Pipetas sorológicas de 2 mL	Fisher Scientific	13-678-12C	Para fabricar moanômetro
Válvulas de vazamento ajustáveis	Qualquer pet shop		https://www.petco.com/shop/ en/petcostore/product/imagi tarium-air-control-valve
Tubulação de aquário	Qualquer pet shop		https://www.petsmart.com/fish/ filtros-e-bombas/ar-e-água -bombas/top-fin-aquário-avião -tubing-5291863.html
Câmera	Amscope	MU300
Tubo de cânula	Fisher Scientific	427411	Para camundongos P21. Outros tamanhos serão necessários para outras idades.  O tubo deve encaixar perfeitamente na traqueia
Coberturas	Fisher Scientific	12-541-014	18 mm x 18 mm
DMEM:F12	Invitrogen	11039-021
Controladores de fluxo	Instrumentos-chave	GS10510AVB	Para fluxo de ar para camundongos individuais
Medidor de fluxo	Avantor	MFLX68560-04	Para fluxo de ar para todo o sistema
Bomba T Gaymar	Braintree Scientific	TP-700	Para manter a temperatura corporal durante o CPAP
Solução salina balanceada de Hanks	Fisher Scientific	MT-20023cv	Dilua para 1x para uso
ImageJ	NIH	Download gratuito	https://imagej.net/ij/download.html
Luvas de látex tamanho pequeno	Fisher Scientific	MF-300-S	Para fabricar máscaras CPAP
Ponto de encontro baixo agarose	Invitrogen	165200-100
Malha	Amazon		https://www.amazon.com/Top- Trimming-Polyester-Horsehair -selling/dp/B01AC93LJ0/ref=sr _1_fkmr2_1?keywords=dritz%2 Bpolyester%2Bhorsehair%2Bbr aid& qid=1562072725& s=gatew ay& sr=8-1-fkmr2&; th=1
Metacolina	Millipore	A2251
Microscópio	Leica	DMLFS
Pen/estreptococo	Invitrogen	15140-148
Bomba de perfusão	Aparato de Harvard	70-2027
Câmara de gravação	Instrumentos Warner	RC-27	Ou algo parecido
Bolsa térmica reutilizável	Braintree Scientific	TP-R	Para uso com bomba T da Gaymar
Graxa de silicone (Molykote111)	Amazon		https://www.amazon.com/Molykote -Componentes Lubrificantes-Resistentes- Volatilidade/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1 _1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P&; dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ- 7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelwG OH3hc60r033NJ-br/ 7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelw aBpsTElSrogzwQv27amBxERmXW P3eedvi9rAYS1oy_HNesZTAxjTbqku 6PxkC7t24srDUq8mHRpDFor4I0iiRM j6Ij2TWdlQf07ccTIMJ1l4n90nHxPop 9Nwh77ufMeWY2vu5B3to.0mfWIF 3_PrmciPZhO1EAE6RGiNj16v7l-v CH1cqec1Y& dib_tag=se& palavra-chave s=molykote+111& qid=1743607899 & sprefix=molykote+111%2Caps%2 C102& sr=8-1-spons&; sp_csd=d2lkZ 2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1
Placas estéreis de 6 poços	Fisher Scientific	3516	Para cultivar fatias
Fio de sutura 3-0	Fisher Scientific	SP117	Para ligar cânula à traqueia
Conexões de tubos	Aparato de Harvard	72-1406
Vibratome (cortador pelco-fácil)	Ted Pella	11000	Ou equivalente