Redução para grande impacto: produção simplificada de vírus adeno-associados recombinantes de alto rendimento

Resumo

Apesar de serem amplamente utilizados na entrega de genes, os vetores virais adeno-associados recombinantes (rAAV) enfrentam desafios de produção notáveis. Este protocolo descreve os métodos de produção em microescala e miniescala usando células aderentes e em suspensão. Os métodos simplificam a geração, purificação e otimização de vetores, acelerando assim a pesquisa pré-clínica e facilitando o progresso dentro do pipeline de terapia genética.

Resumo

Nos últimos anos, os vetores virais adeno-associados recombinantes (rAAV) surgiram como uma plataforma líder para aplicações de terapia gênica. No entanto, os complicados processos de produção e purificação continuam sendo gargalos significativos no desenvolvimento de medicamentos. A produção de rAAV de alto rendimento e em pequena escala, sem procedimentos de purificação demorados e trabalhosos, oferece uma estratégia alternativa valiosa para acelerar a pesquisa pré-clínica e a triagem terapêutica em estágio inicial. Essa abordagem permite a rápida geração de diversas variantes de rAAV ou construções terapêuticas com qualidade suficiente para avaliação inicial in vitro e in vivo . Este protocolo introduz dois métodos diferenciados por tipo de célula e escala de produção: produção de rAAV em microescala e miniescala. A produção em microescala é realizada em um formato de 6 poços usando células 293T de rim embrionário humano (HEK) aderente (micro-6 poços), enquanto a produção em miniescala utiliza células em suspensão em placas de 24 poços (mini-HT24). Os vetores gerados por meio desses métodos passam por análises a jusante para otimizar as condições de cultura celular e/ou são usados para avaliar a atividade biológica dos transgenes. As principais leituras analíticas incluem titulação do genoma do vetor (vg/mL), determinação do título do capsídeo (vp/mL), análise de western blot e ensaios de transdução celular. Além disso, os vetores produzidos em miniescala e semipurificados usando resinas de afinidade são comparados com preparações em escala média purificadas por meio de gradientes de densidade de cloreto de césio. Os métodos simplificados descritos aqui demonstram um potencial significativo para refinar os parâmetros de cultura de células, identificar os principais candidatos durante as triagens (ou seja, transgênicos otimizados ou capsídeos AAV superiores) e aumentar a expressão transgênica. Coletivamente, os fluxos de trabalho apresentados apoiam o estabelecimento de uma plataforma robusta e eficiente para desenvolvimento iterativo no pipeline de terapia gênica que pode ser prontamente implementada em qualquer laboratório de pesquisa.

Introdução

O desenvolvimento de medicamentos é um processo complexo e intensivo em recursos que requer a integração de dados de alta qualidade de vários estágios, incluindo identificação de alvos, validação pré-clínica e ensaios clínicos¹. Em resposta às crescentes demandas por cronogramas mais rápidos e custos reduzidos², a indústria farmacêutica tem adotado cada vez mais ensaios de pequena escala de alto rendimento (HT) em combinação com inteligência artificial (IA) avançada como pedra angular das estratégias de desenvolvimento modernas ^3,4,5. Os ensaios de HT permitem a triagem e avaliação rápidas de um grande número de candidatos a medicamentos ou variáveis de ensaio em uma fração do tempo e do custo em comparação com os métodos tradicionais ^5,6.

Em aplicações de terapia genética, particularmente aquelas que utilizam vetores virais adeno-associados (AAV), o alto custo dos produtos e os longos prazos de fabricação representam desafios significativos⁷. O processo de desenvolvimento começa com a produção do material plasmidial necessário para a transfecção, seguido pelo crescimento celular em altas densidades suficientes para a produção de vetores virais. Após a transfecção, é necessário um período de incubação de dois a cinco dias antes da colheita, e o processo termina com a purificação e caracterização do lote ^8,9. Coletivamente, esse fluxo de trabalho pode levar até um mês e normalmente é restrito a um número limitado de preparações que podem ser executadas em paralelo ao usar colunas de afinidade ou ultracentrifugação gradiente 9,10,11,12.

Reconhecendo a necessidade de protocolos de produção de AAV em pequena, mini ou microescala, o campo adaptou várias abordagens para produzir AAV recombinante (rAAV) em pequenas configurações de escala de laboratório. Essas abordagens geralmente envolvem o uso de vários pratos de 15 cm para células aderentes^13,14 ou 50-2000 mL¹⁵ frascos de agitação para culturas em suspensão. No passado, métodos de purificação de AAV, como ultracentrifugação de gradiente (por exemplo, iodixanol¹⁶, cloreto de césio (CsCl) ¹⁷ ou gradientes de sacarose¹⁸), eram empregados. Este método barato e independente do sorotipo era altamente adequado para a produção de rAAV em escala de laboratório, mas sua natureza trabalhosa e capacidade limitada de ultracentrífuga o tornam menos propício para aplicações de alto rendimento^19,20.

A demanda contínua por maior rendimento levou à exploração de abordagens alternativas para reduzir a produção de rAAV. Usando células aderentes, formatos como placas de 6 poços^13,21,22, 96 poços²³ e até placas de 384 poços²⁴ foram investigados. Mais recentemente, as células em suspensão foram adotadas, dada a sua melhor escalabilidade e a potência comparável, ou mesmo superior, das preparações vetoriais⁸.

No entanto, a produção de alto rendimento de rAAV em células em suspensão com volumes de cultura inferiores a 15 mL continua sendo uma área especializada, com protocolos publicados limitados ^7,25,26. A maioria dos estudos se concentra em volumes maiores para obter rendimentos suficientes para aplicações a jusante ^8,9,27, mas, como acontece com as células aderentes, os formatos em miniescala oferecem reduções significativas no consumo de recursos e no tempo de processamento, atendendo assim a uma necessidade crítica no campo. É importante ressaltar que os protocolos em mini e microescala geralmente utilizam "lisados brutos", ou colheitas de cultura de células não purificadas contendo partículas vetoriais, para caracterização e análises a jusante.

Este estudo descreve dois protocolos utilizando células produtoras aderentes e em suspensão (Figura 1). Os lisados brutos de rAAV produzidos a partir de células HEK293T aderentes são usados diretamente para aplicações subsequentes, como transdução de células-alvo. Em contraste, os rAAVs gerados em células em suspensão passam por processamento adicional por meio de purificação de resina de afinidade de alto rendimento. Esses métodos foram desenvolvidos especificamente para melhorar o rendimento, avaliar a qualidade do vetor e monitorar a expressão do transgene, minimizando o consumo de reagentes e materiais caros. Os resultados apresentados aqui mostram que tanto os lisados brutos (de células aderentes) quanto o material purificado por afinidade (de células em suspensão) são adequados, dependendo do escopo da aplicação. Além disso, o rAAV obtido usando resinas de afinidade foi diretamente comparado com contrapartes purificadas usando ultracentrifugação tradicional de cloreto de césio em termos de rendimento, pureza e eficiência de transdução em co-culturas neuronais derivadas de humanos.

A adoção de ensaios de alto rendimento e pequena escala no desenvolvimento de medicamentos de terapia gênica representa um avanço indispensável, acelerando a inovação e preenchendo a lacuna entre a descoberta científica e a realidade terapêutica. Esses métodos não apenas reduzem custos e prazos, mas também permitem o teste paralelo de várias condições, contribuindo para o desenvolvimento eficiente de terapias transformadoras.

Protocolo

1. Produção de micro-6 poços de vetores rAAV em células aderentes

NOTA: A produção de micro-6 poços de rAAV é uma versão adaptada de um protocolo publicado anteriormente por Fakhiri et ^al.21.

1. Semeadura e transfecção de células HEK293T
   1. Descongelar um frasco para injetáveis de células HEK293T²⁸ em banho-maria a 37 °C.
   2. Transfira as células para 30 mL de meios de cultura de células aderentes em frascos T175 e mantenha em meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal de bezerro (FCS), a 37 ° C e 5% de CO₂.
   3. Divida HEK293T a cada 2-3 dias: Aspire o meio de cultura celular e adicione cuidadosamente 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para lavar as células.
      NOTA: Apenas passagens celulares abaixo do número de passagem 15 foram usadas neste protocolo para garantir a integridade e a saúde das células, o que afeta diretamente a produção de rAAV.
   4. Adicione 2 mL de tripsina a 0,025% / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) às células e incube por 2 min a 37 ° C (ou até que as células se desprendam).
   5. Pare a reação adicionando 20 mL de meio fresco e suspendendo as células no meio usando uma pipeta de 25 mL. Dependendo da confluência, as células podem ser diluídas 1:10 ou 1:20 em 24 mL de meio DMEM com alto teor de glicose. Para obter uma densidade celular suficiente para a transfecção, semeie 7 × 10⁶ HEK293T células em um frasco T175.
   6. Após 72 h a 37 °C, colher as células por tripsinização (conforme descrito na etapa 1.1.3-1.1.5), ressuspender em 20 mL de meio e contar as células.
      NOTA: As células podem ser contadas usando vários métodos, dependendo da precisão desejada, do rendimento e do equipamento disponível. Principalmente, duas abordagens são usadas: contagem manual (câmara de Neubauer) e contadores de células automatizados. Este protocolo emprega um analisador de células baseado em imagem totalmente automatizado para medir parâmetros celulares críticos, como viabilidade, densidade celular e taxa de agregação.
   7. Células-semente com densidade de 0,5 × 10⁶ células/poço em uma placa de 6 poços. Para distribuir as células uniformemente, agite suavemente a placa e coloque-a na incubadora de CO₂ .
   8. Após 24 h, as células atingem uma confluência de 60-70% e podem ser transfectadas triplamente.
   9. Para cada poço, misture 90 μL de meio livre de soro com um total de 2,6 μg de DNA plasmidial, incluindo pTransgene, pRep/Cap e pHelper em uma proporção molar de 1:1:1.
   10. Em um segundo tubo, adicione 5 μL de polietilenonimina (PEI) a 90 μL de meio sem soro imediatamente antes da transfecção.
   11. Depois de combinar as duas soluções, vórtice a mistura e incubar à temperatura ambiente (RT) por 10 min.
   12. Adicione a mistura de transfecção gota a gota a cada poço. Agite suavemente as placas antes de colocá-las de volta na incubadora.
       NOTA: Uma mudança de meio após a transfecção pode ser realizada, mas não foi aplicada como prática padrão, pois as células mantiveram boa viabilidade durante todo o experimento.
2. Colheita e lise de células
   1. 72 h após a transfecção, aspirar cuidadosamente o meio celular da(s) placa(s).
   2. Separe as células adicionando 500 μL de PBS em cada poço e pipete cuidadosamente para cima e para baixo.
   3. Transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   4. Meça a viabilidade e a densidade celular manual ou automaticamente seguindo as instruções do fabricante.
   5. Transfira 50 μL da suspensão para uma placa inferior em U 96 para determinar a eficiência da transfecção quantificando as populações repórter-positivas por citometria de fluxo.
      NOTA: É sempre recomendável realizar um controle de transfecção em paralelo, ou seja, uma transfecção de 1-2 poços com um transgene carregando uma proteína fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), mCherry, etc.) para monitorar a eficiência da transfecção na placa. Poços com células não transduzidas servem como controle negativo.
   6. Centrifugar a suspensão celular restante a 800 × g durante 10 min em RT para granular as células que contêm a parte principal dos vectores produzidos.
   7. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 μL de PBS. A suspensão celular pode ser armazenada a -80 °C.
      NOTA: Para obter um lisado bruto das células colhidas, use uma das duas abordagens descritas abaixo.
   8. Na primeira abordagem, as células podem ser submetidas a cinco ciclos de congelamento e descongelamento, cada 5 min, usando um banho-maria pré-aquecido a 37 °C e nitrogênio líquido. Vortex brevemente as amostras entre os ciclos por 2-3 s.
   9. A segunda e principal opção utilizada neste protocolo é a sonicação. Aqui, transferir a suspensão celular para placas ou tubos de reação em cadeia da polimerase (PCR) de paredes finas e colocar a 4 °C em um sonicador em banho-maria.
      1. Sonicar amostras por um total de 3 min com incrementos on-off de 30 s a 25% de amplitude (intensidade).
   10. Após a sonicação, pulverizar as células usando uma centrífuga de mesa (16.100 × g por 10 min a 4 ° C) para remover os detritos celulares e obter uma suspensão vetorial livre de células.
   11. Transfira os sobrenadantes para tubos de 1,5 mL e pipete 10 μL de cada amostra para uma placa de 96 poços de baixa ligação para análise de gotículas digitais (dd)PCR ou (d)PCR digital.
   12. Armazene os tubos e as placas de 96 poços a -80 °C até uso posterior.
3. Transdução de células HEK293A usando lisados brutos
   NOTA: HEK293A células podem não ser adequadas para todos os sorotipos de AAV. Para identificar uma linhagem celular apropriada, consulte bancos de dados como o SPIRIT²⁹ (consulte a Tabela de Materiais para obter um link para o banco de dados SPIRIT) ou artigos de pesquisa originais relevantes^30,31.
   1. A semente HEK293A células em três placas de 96 poços um dia antes da transdução em densidades de 1,5 × 10⁶ células por placa.
   2. No dia seguinte, misture 10 μL dos vetores produzidos com diferentes volumes de PBS para gerar diluições 1:2, 1:10 e 1:100.
   3. Usando uma pipeta multicanal, transduza as células em placas de 96 poços em triplicados técnicos.
   4. Incubar células com os rAAVs sem troca de meio por 72 h. Depois disso, realize os experimentos a jusante dependendo do transgene expresso, como medições de nível de proteína, análise de citometria de fluxo para expressão de proteína fluorescente, análises de knockdown/knockout, etc.
   5. Para citometria de fluxo padrão, conforme realizado neste protocolo, aspire o meio e desprenda as células adicionando 25 μL de tripsina / EDTA a 0,025%.
   6. Incubar a 37 °C durante 3 min.
   7. Pare a reação adicionando 175 μL de albumina de soro bovino a 1% (BSA) em PBS em cada poço.
   8. Utilizar 100 μL da suspensão celular para a análise por citometria de fluxo.

2. Produção de mini-HT24 de vetores rAAV em células em suspensão

NOTA: Na configuração mini-HT24, em contraste com a produção de micro-6 poços descrita anteriormente, preparações purificadas de vetores rAAV são geradas usando células em suspensão. As culturas em suspensão produzem maiores quantidades de rAAV devido ao aumento das densidades celulares que podem ser alcançadas dentro do mesmo volume de cultura. Neste protocolo, foi empregado um formato de poço de 24 profundidades. Os lisados de células brutas são purificados em alto rendimento usando resinas de afinidade AAVX com o objetivo de gerar produtos mais limpos necessários para certas aplicações onde os lisados brutos não são adequados (consulte a seção Discussão).

1. Cultivo e tripla transfecção de células em suspensão em placas de poços de 24 profundidades
   1. Descongelar um frasco para injetáveis de suspensão de células de produção viral (VPC) em banho-maria a 37 °C. Células de passagem menos de 30 vezes para garantir a qualidade consistente dos vetores produzidos.
   2. Transferir as células para 30 ml de meios de cultura em suspensão num balão agitado e cultivá-las durante 2-3 dias em condições de cultura de manutenção: 37 °C, 8% CO₂, 95% de humidade e 140 rpm (raio da plataforma agitada 25 mm).
   3. Determine a densidade celular viável após 2-3 dias (consulte a NOTA na etapa 1.1.6). Continue com a subcultura e expansão até que o número desejado de células viáveis necessárias para a produção de AAV seja alcançado.
      NOTA: Subcultura de células com uma densidade viável de > 4 × 10⁶ células/ml e < 6 × 10⁶ células/ml ou de acordo com as instruções do fabricante com base na linhagem celular individual utilizada. Semear em uma densidade viável de 6 × 10⁵ células/mL por 3 dias, parcelado ou 3 × 10⁵ células/mL por 4 dias. Dividir de acordo com as instruções do fabricante.
   4. Semeie 3 × 10⁶ células/mL em 2,5 mL de cada poço da placa de 24 poços de profundidade e cubra a placa com uma tampa de membrana estéril.
   5. Prepare a mistura de transfecção tripla para cada construção de rAAV da seguinte forma:
      1. Preparar a mistura de ADN dos plasmídeos de produção (pHelper, pRep/Capsídeo, pTransgene) numa proporção molar de 1:1:1 com uma massa final de 600 ng de ADN por 1 × 10⁶ células viáveis.
      2. Preparar a mistura em Meio de Cultura em Suspensão com um volume final de 2,5% do volume de cultura a ser transfectado.
      3. Preparar o PEI-Mix em Meio de Cultura em Suspensão com um volume final de 2,5% do volume de cultura a ser transfectado. Use uma massa final de 1 ng PEI por 1 ng de DNA.
      4. Combine DNA-Mix e PEI-Mix transferindo todo o volume do PEI-Mix individual para o DNA-Mix correspondente, resultando em um volume de mistura de transfecção de 5% do volume da cultura.
      5. Misture pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
         NOTA: Não vórtice a mistura de transfecção após o tempo de incubação para evitar a interrupção dos complexos PEI-DNA que foram formados durante a incubação³².
      6. Incubar em RT por 10 min.
   6. Adicione as misturas de transfecção gota a gota aos poços correspondentes enquanto agita a placa de poço profundo com cuidado.
   7. Sele a placa usando um filme de rayon respirável estéril e cubra-o adicionalmente com a tampa da membrana correspondente para minimizar a evaporação.
   8. Certifique-se de que a placa seja colocada em uma bandeja agitadora de poço profundo adequada e fixe-a firmemente.
   9. Incubar as células a 37 °C, 8% de CO₂, 95% de humidade e 225 rpm durante 72 h.
      NOTA: Diferentes formatos de placas de poços profundos requerem avaliação individual da velocidade de agitação para permitir a troca gasosa eficiente e a cultura de células em uma suspensão homogênea sem que as células se depositem no fundo ao longo do tempo. Isso requer testes iniciais dependendo do equipamento e configuração individuais do laboratório, bem como das linhagens celulares usadas para a produção. Considere especialmente o raio de agitação, o formato da placa e o formato do fundo do poço para manter a suspensão celular homogênea e evitar que as células se estabeleçam no fundo.
2. Colheita e lise
   1. Colha as células transferindo o volume total de cultura de cada poço para tubos de 5 mL rotulados individualmente e centrifugue a 800 × g por 20 min a 4 ° C.
   2. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 550 μL de (D)PBS de Dulbecco e transfira a suspensão para um tubo com tampa de rosca de 1,8-2,0 mL para evitar aerossóis e quedas ao abrir os tubos.
      NOTA: Os pellets também podem ser armazenados neste ponto para prosseguir com o processo de purificação posteriormente. Armazene os pellets ressuspensos com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco a -80 °C e certifique-se de considerar isso durante as etapas do ciclo de congelamento e descongelamento.
   3. Preparar os lisados colocando os tubos em azoto líquido durante cerca de 2 minutos e, em seguida, descongelá-los num banho-maria a 37 °C. Repita este ciclo 3-5x.
   4. Centrifugar lisados durante 5 min a 1000 × g a 4 °C. Cubra os baldes da centrífuga com tampas estanques a aerossóis.
   5. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga.
      NOTA: Os lisados precisam estar limpos e livres de detritos visíveis ou turbidez para evitar o entupimento da resina usada no processo de purificação. Evite agitar ou perturbar os pellets. Repita a etapa de centrifugação caso os sobrenadantes não estejam claros. Considere uma velocidade de centrifugação mais alta ou maior duração no caso de amostras altamente concentradas ou amostras com grandes quantidades de detritos.
3. Purificação rAAV de alto rendimento à base de resina Affinity
   1. Em um béquer, prepare o tampão de eluição adicionando 720 mg de ácido cítrico a 50 mL de água ultrapura para atingir uma concentração final de 75 mM de ácido cítrico.
   2. Mexa o tampão até que o pó esteja totalmente dissolvido.
      NOTA: Certifique-se de que o volume do poço seja suficiente para acomodar os volumes tampão e as pontas da pipeta sem derramar ou arriscar a contaminação cruzada dos poços vizinhos.
   3. Ajuste o pH para 3,0 adicionando ácido clorídrico (HCl) 1 M gota a gota enquanto agita continuamente o tampão e mede com um eletrodo de pH.
   4. Execute a filtração estéril no tampão usando um tamanho de poro de 0,22 μm.
   5. Prepare colunas de uma placa de 96 poços profundos com um volume de poço de 2-2,2 mL para purificação de acordo com o esquema descrito na Tabela 1.
      NOTA: As amostras aqui foram purificadas usando uma configuração de pipeta eletrônica multicanal. O processo é compatível com sistemas automatizados de manuseio de líquidos e pode ser ampliado para maior rendimento de amostras.
   6. Execute a purificação em um gabinete de biossegurança em RT usando os parâmetros mostrados no esquema de purificação (consulte a Tabela 1) ou otimize os parâmetros de acordo com os requisitos individuais, dependendo da resina ou volume da amostra, título esperado, etc.
   7. Após a eluição, adicione 1/4 do volume de eluição do tampão de neutralização a cada amostra.
   8. Misture pipetando 80% do volume 10x para cima e para baixo.
   9. Prepare as placas de diálise removendo os de membrana e adicionando 1600 μL de tampão de diálise a cada poço.
      NOTA: Certifique-se de não colocar as membranas em contato com o líquido antes de realizar a diálise, pois a nova secagem pode prejudicar a integridade e a função da membrana.
   10. Transfira o volume total da amostra (máximo de 300 μL) para um de diálise com um formato de volume e tamanho de poro de membrana adequados (≥ limite de peso molecular de 20.000 (MWCO)). Certifique-se de que as membranas estejam carregadas de forma homogênea e que não haja bolhas de ar.
   11. Coloque os nos poços carregados da placa de diálise e sele a placa com uma folha de vedação.
   12. Transferir a placa de diálise para uma plataforma vibratória e incubar a 300 rpm, 4 °C durante 30 min.
   13. Substitua o tampão de diálise e repita a incubação a 300 rpm, 4 °C por 30 min.
   14. Repita a troca de tampão e incubação 3x no total.
   15. Transferir todo o volume das amostras dialisadas para tubos de armazenamento rotulados e armazená-los a 4 °C se forem posteriormente utilizados para caracterização ou outras experiências.
   16. Armazene a -80 °C para armazenamento de longo prazo. Evite ciclos de congelamento e descongelamento, pois isso pode afetar a potência dos AAVs e prepare alíquotas de pequeno volume, se necessário.
4. Titulação do título genômico de rAAV a partir de lisados brutos e purificação à base de resina usando PCR digital (dPCR)
   1. Para determinar o título genômico dos lisados brutos, ou seja, genomas virais por mL (vg / mL), descongele as amostras de vetores colhidas em RT e, em seguida, pipete 10 μL em um tubo.
      NOTA: Vários métodos estão disponíveis para determinar o título do genoma viral (vg/mL) de uma preparação de vetor, com quantificação absoluta normalmente contando com duas abordagens principais: o método baseado em gotículas ou emulsão (ddPCR) e o método baseado em microplacas, representado por PCR digital (dPCR)^33,34. Além desses métodos digitais, a quantificação absoluta também pode ser obtida usando PCR quantitativo (qPCR). Embora o qPCR seja tradicionalmente um método de quantificação relativa, ele pode ser adaptado para quantificação absoluta usando uma curva padrão de plasmídeo. Trata-se de um plasmídeo contendo a sequência alvo em uma concentração conhecida, que serve de referência para extrapolar o título do genoma viral^21,33. Embora a qPCR seja mais rápida e menos dispendiosa do que a ddPCR ou a dPCR, ela é menos precisa e depende muito da precisão do padrão de plasmídeo¹⁶. Independentemente do método de quantificação, as amostras devem ser pré-tratadas para liberar os genomas virais das partículas. Este protocolo segue um método descrito anteriormente por Dobnik, D. et al³⁵.
   2. Trate as amostras de rAAV com uma nuclease a 37 °C durante 30 minutos para degradar o ADN do plasmídeo livre do processo de transfecção.
      NOTA: Opcional, dependendo da enzima usada: aqueça as amostras a 95 ° C por 15 min para inativar a enzima e lisar o capsídeo do vetor.
   3. Após o resfriamento à RT, adicione Proteinase K por 15 min para digerir os fragmentos do capsídeo.
   4. Para inativação da proteinase K, aqueça as amostras novamente a 95 ° C por 15 min.
   5. Prepare as misturas principais de ddPCR ou dPCR seguindo as instruções do fabricante.
   6. Use sondas de DNA marcadas, pois elas fornecem um sinal mais específico do que os corantes intercalantes. Projete sondas para se ligar "centralmente" no genoma viral, ou seja, no transgene (ver NOTA), em vez do promotor ou cauda poliA, e selecione um fluoróforo como hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX) ou 6-carboxifluoresceína (FAM) que seja compatível com o respectivo sistema de PCR.
      NOTA: Recentemente, ddPCR ou dPCR multiplex, empregando conjuntos de primer / sonda direcionados a diferentes regiões do genoma viral, tem sido utilizado para aumentar a precisão da determinação do título ^36,37. Essa abordagem permite a quantificação de genomas intactos aplicando fórmulas descritas nos estudos referenciados ou usando soluções de software integradas.
   7. Realize uma diluição serial de 10 vezes das amostras pós-processadas em ddH₂O usando placas de 96 poços de baixa ligação ao DNA. Finalmente, transfira 5,5 μL (para ddPCR) ou 2 μL (para dPCR) do molde (diluições 10⁴- e 10⁵) para a placa de 96 poços de ddPCR, que já contém o ddPCR / dPCR Master Mix incluindo primer / sondas. Ajustar o intervalo de diluição com base na eficiência de produção de construções individuais para garantir que as medições se situam dentro do intervalo de detecção linear.
      NOTA: Como a quantificação de dPCR / ddPCR é um método altamente sensível, são necessárias 10 diluições^{de 4} e 10⁵ das amostras.
   8. Siga as etapas descritas abaixo para ddPCR.
      1. Para amplificação por PCR, siga as instruções do fabricante para otimizar as condições do ensaio, incluindo ajustes nos tempos de recozimento e amplificação com base no(s) conjunto(s) de primer/sonda usado(s). O protocolo padrão de ciclagem utilizado neste estudo foi o seguinte: desnaturação inicial a 9 °C por 10 min (rampa °C/s); 35 ciclos de desnaturação a 9 °C durante 30 s e amplificação a 6 °C durante 60 s; seguido por uma etapa final de alongamento a 9 °C por 10 min (rampa °C/s).
      2. Após a amplificação por PCR dos alvos do genoma viral rAAV, transfira a placa para o leitor de gotículas e siga as instruções do fabricante para medir a intensidade da fluorescência em cada poço. O leitor de gotículas permite a quantificação absoluta dos números de cópias do genoma viral pe μL reação.
   9. Siga as etapas descritas abaixo para dPCR.
      1. Conforme descrito para a quantificação baseada em ddPCR, siga as instruções do fabricante para otimizar as condições do ensaio.
      2. Como ponto de partida, siga o perfil térmico predefinido no dispositivo dPCR, que inclui uma etapa inicial de desnaturação a 9 °C por 2 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 9 °C por 15 s e recozimento/extensão a 5 °C por 30 s.
         NOTA: Este protocolo foi realizado usando as taxas de rampa recomendadas e os volumes de reação especificados pelo fabricante.
   10. Analise dados de ddPCR e dPCR usando várias soluções de software, normalmente fornecidas pelo fabricante do instrumento (por exemplo, QX manager e QIAcuity Software Suite 1.2, respectivamente). Para ambos os métodos, seleccionar apenas as diluições das amostras com uma proporção adequada de partições/gotículas positivas para negativas para quantificação.
       NOTA: Para determinação de títulos de partículas de rAAV (vp/mL; vp = partículas virais) de lisados brutos e material purificado com resina AAVX, um ensaio imunoenzimático (ELISA) pode ser usado., Vários kits ELISA sanduíche padrão disponíveis comercialmente para quantificação de AAV estão disponíveis (os kits usados neste trabalho estão listados na Tabela de Materiais). Efectuar o ensaio de acordo com o(s) manual(is) do fabricante. Certifique-se de que o kit ELISA usado seja compatível com o sorotipo AAV que está sendo produzido.
5. Análise da razão VP de rAAVs purificados
   NOTA: Para determinar a proporção de proteína do capsídeo viral (VP) de cada amostra dos poços individuais da configuração de 24 poços profundos, podem ser realizados protocolos padrão de western blot ou baseados em capilares automatizados.
   1. Para detectar as proteínas do capsídeo AAV2 VP1, VP2 e VP3, use um anticorpo monoclonal primário anti-AAV VP1/VP2/VP3. Certifique-se de que o anticorpo primário funcione com o respectivo sorotipo ou variante do capsídeo.
   2. Use controles positivos adequados, como VP1, VP2 e VP3 recombinantes ou um padrão de referência AAV.
   3. Preparar o controlo positivo numa proporção molecular de 1:1:10 (VP1:VP2:VP3) para imitar o rácio VP esperado. Isso também serve como referência para a quantificação da razão VP usando a integração da área do sinal.
   4. Selecione um kit capilar com uma faixa adequada que englobe as proteínas do capsídeo a serem detectadas, incluindo a menor (VP3 com ~ 60 kDa) e a maior (VP1 com ~ 82 kDa). Isso pode variar dependendo do sorotipo e da variante do capsídeo usada.
   5. Prepare os reagentes e a escada biotinilada fornecidos no kit de acordo com as instruções do fabricante.
   6. Preparar uma série de diluições das amostras (com base no título genómico a partir de 1 × 10¹² vg/ml a 1 × 10¹⁰ vg/ml ou diluições de 1:2 a partir da amostra não diluída até 1:64) no tampão de diluição fornecido do kit para garantir uma boa gama de detecção para cada amostra.
   7. Diluir o anticorpo primário no tampão de diluição de anticorpos fornecido de acordo com as instruções do fabricante ou dependendo de testes anteriores. Comece com 1:100.
   8. Use um kit de detecção correspondente, dependendo da fonte do anticorpo primário.
   9. Carregue a placa de acordo com o esquema fornecido com o kit.
   10. Certifique-se de encher as colunas vazias com água ou tampão de diluição de amostras, bem como para não danificar os capilares do instrumento ao secar a seco.
   11. Cobrir a placa com uma folha de fecho e centrifugar a 1200 × g, 5 min, a 4 °C.
   12. Transfira a placa e os capilares para o instrumento e use condições padrão predefinidas para a corrida.
   13. Analise a corrida usando um software de análise de dados, como o Compass (versão 6.3.0)³⁸.
       NOTA: Para analisar a integridade das partículas, recomenda-se a microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa de monodispersidade e pureza (ns-TEM). A análise MET pode ser realizada conforme descrito por Steininger et. al²⁵. No entanto, outros métodos, como fotometria de massa³⁹, SEC-MALS⁴⁰ e coloração de fita⁴¹ , também podem fornecer leituras complementares para avaliar a qualidade das preparações de rAAV.
6. Transdução com partículas virais purificadas
   NOTA: Para transduzir células com vetores virais purificados, uma multiplicidade de infecção (MOI) deve ser determinada. MOI é definido como o número de genomas contendo partículas adicionados por célula. É importante notar que este é um valor teórico; o número real de genomas de rAAV entregues por célula depende da capacidade do capsídeo de transduzir com sucesso as células-alvo. Portanto, o MOI ideal deve sempre ser determinado experimentalmente. Nesta seção, o objetivo foi comparar dois estoques de vetores virais, que foram produzidos usando diferentes métodos de purificação (ultracentrifugação de cloreto de césio e resina de afinidade AAVX). Para este fim, co-culturas neuronais derivadas de humanos foram transduzidas com as duas preparações, e a eficiência da transdução foi avaliada usando microscopia de fluorescência.
   1. Cubra uma placa inferior óptica preta de 96 poços com 0,1% (Poli-L-Ornitina) PLO durante a noite a 4 ° C ou incube a 37 ° C por ≥ 1 h.
   2. No dia da semeadura, aspirar o reagente de revestimento PLO e revestir com Matriz de Membrana Basal de Fator de Crescimento Reduzido e incubar a 37 °C por ≥1 h.
   3. Cultura de neurônios motores com astrócitos na proporção de 1:6 ou por recomendação de fornecedores.
   4. Aos 2 dias in vitro (DIV), transduzir a co-cultura em um MOI de 50.000.
   5. Descongele as alíquotas virais a 4 °C.
   6. Preparar meios de transdução (vetores virais no MOI desejado com base em genomas virais por célula + meios de cultura celular em volumes apropriados para substituir 50% dos meios de cultura por poço).
   7. Realize 50% de troca de mídia com mídia de transdução.
   8. Às 5 DIV, realizar a troca completa de mídia com meios de cultura regulares.
   9. Mantenha as células com troca regular de meios de cultura a cada 2-3 dias ou por recomendação do fornecedor.
   10. Monitore os níveis de expressão com um microscópio de imagem ao vivo equipado com excitação correta para o transgene repórter. Para neurônios derivados de humanos, a expressão do platô é observada entre 10 e 14 dias após a transdução (ver Figura 4A).

Passo	Tampão/Material	Volume do poço [μL]	Volume de trabalho [μL]	Ciclos	Vazão [μL/min]
1. Equilíbrio	Equilibration/ Tampão de lavagem I	1100	950	2	500
2. Carregando/ Captura	Sobrenadante de amostra	550	500	4
3. Lavagem I	Equilibration/ Tampão de lavagem I	1100	950	2
4. Lavagem II	Tampão de lavagem II	1100	950	2
5. Eluição	Tampão de eluição	70 μL (20 μL ponteiras de resina) 250 μL (80 μL ponteiras de resina)	60 μL (20 μL ponteiras de resina) 240 μL (80 μL ponteiras de resina)	4
6. Neutralização	Tampão de neutralização	Adicione 1/4 do volume de eluição diretamente a cada amostra 70 μL de amostra eluída → Adicionar 17,5 μL 250 μL de amostra eluída → Adicionar 62,5 μL		-	-

Tabela 1: Layout da placa e parâmetros de purificação para purificação de resina de afinidade de rAAVs.

Resultados

Nos últimos anos, a demanda pela produção de vetores AAV em escala laboratorial aumentou significativamente, levando ao estabelecimento de inúmeras organizações de pesquisa contratadas que oferecem isso como um serviço⁴². Dados os altos custos e os prazos atrasados frequentemente associados à terceirização, a produção interna de rAAV continua sendo uma opção atraente. Em particular, protocolos de alto rendimento que minimizam o consumo de material e as horas de trabalho, ao mesmo tempo em que integram as etapas de purificação, são altamente benéficos no pipeline de desenvolvimento de medicamentos.

Este protocolo descreve duas configurações de alto rendimento para a produção de rAAV: uma abordagem de micro-6 poços usando células aderentes e um protocolo mini-HT24 para células em suspensão (veja a visão geral na Figura 1). A configuração de micro-6 poços utiliza células HEK293T aderentes para produzir rAAV em um formato de 6 poços. Este material foi usado para avaliar os efeitos de dois reagentes de transfecção de PEI disponíveis comercialmente e cloreto de sódio (NaCl) na produção de rAAV2 (Figura 2A). Aqui, diferentes parâmetros foram monitorados ao mesmo tempo: (i) viabilidade da célula produtora e eficiência de transfecção usando um transgene GFP (Figura 2B e Figura Suplementar 1) e (iii) porcentagem de células GFP-positivas (GFP+) após transdução com lisados brutos (Figura 2C). O experimento de transdução serviu como uma leitura indireta rápida e barata dos títulos e funcionalidades do vetor. Curiosamente, proporções mais baixas de reagente de transfecção para DNA foram suficientes para promover a produção eficiente de vetores ( Figura 2B ), mantendo a boa viabilidade celular. Além disso, a adição de 150 mM de NaCl pareceu benéfica, principalmente quando se usa o reagente PEIpro. A realização deste experimento em microescala ofereceu várias vantagens: (i) um fluxo de trabalho rápido, com semeadura celular, transfecção e coleta de vetores concluída em uma semana; ii) compatibilidade com ensaios analíticos normalizados a jusante; e (iii) ampla aplicabilidade a todos os sorotipos de AAV.

Para aplicações que exigem maiores quantidades de vetores rAAV, como experimentos in vivo ou estudos cinéticos in vitro (onde uma gama maior ou mais ampla de MOIs é aplicada), é necessário aumentar a escala. Para estabelecer um protocolo mini-HT24 que forneça material suficiente para purificação de alto rendimento, foram utilizadas células em suspensão. Em comparação com as células aderentes, as culturas em suspensão oferecem melhor escalabilidade e são mais eficientes em termos de espaço, pois não são limitadas pela área de superfície. Como as células em suspensão crescem livremente no meio, elas podem ocupar todo o volume de cultura, tornando o aumento de escala em três dimensões mais simples. Isso permite alcançar densidades celulares mais altas em comparação com as culturas de camadas. Além disso, os sistemas de suspensão são mais fáceis de manter e processar, pois não são necessárias etapas de desprendimento durante a passagem ou a colheita. A uniformidade da produção de rAAV no formato de 24 poços foi avaliada pela análise de três parâmetros-chave na placa (Figura 3): (A) Título de partículas (vp/mL); (B) relação VP no capsídeo; (C) Título genômico (vg/mL) e (D) Razão vazio/cheio.

Embora alguma variabilidade tenha sido observada entre esses parâmetros, ela permaneceu em grande parte dentro de uma faixa dupla, que está dentro da margem de erro de medição. A expressão da proteína VP também foi avaliada usando análise automatizada de western blot (Figura 3E). Finalmente, uma comparação dos rendimentos totais obtidos da produção de micro-6 poços, mini-HT24 e média escala (frasco agitado) é apresentada para orientar a seleção da escala apropriada com base nos requisitos experimentais e nas necessidades analíticas a jusante (Figura 3F).

Um aspecto crítico de qualquer protocolo de purificação de AAV é a avaliação da pureza e potência do vetor. Aqui, os vetores purificados por resina foram comparados lado a lado com aqueles purificados usando um método de ultracentrifugação (UC) baseado em cloreto de césio (CsCl) em duas etapas (Figura 4). Potência comparável entre as duas preparações foi observada por microscopia de fluorescência, conforme demonstrado pela transdução bem-sucedida de neurônios motores e astrócitos (Figura 4A). A análise por microscopia eletrônica não revelou diferenças significativas na forma das partículas ou no estado de agregação. No entanto, houve uma ligeira tendência indicando que a purificação de CsCl produziu preparações mais limpas de forma mais consistente ( Figura 4B ).

Figura 1: Visão geral das abordagens de produção e preparação de rAAV. Esta figura ilustra os métodos de produção de rAAV, variando de frascos de agitação em escala midi a culturas de suspensão mini-HT24 e culturas aderentes de micro-6 poços. Essas abordagens permitem a geração de rAAV em várias escalas, utilizando diferentes estratégias de lise celular e purificação de vetores. A caracterização final de rAAVs normalmente inclui qPCR / dPCR para quantificação do genoma viral (vg / mL), ELISA para determinação do título do capsídeo (vp / mL) e ensaios de transdução celular para avaliar a atividade biológica. Criado em BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Otimização do protocolo de transfecção para produção de rAAV de micro-6 poços. (A) Visão geral esquemática do experimento com parâmetros testados e leituras analíticas. (B) HEK293T células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 0,5 × 10⁶ células/poço 24 h antes da transfecção. Diferentes quantidades de DNA, tipos de PEI (Pro ou Max), proporções e concentrações de NaCl foram testadas. (C) Porcentagem de células HEK293A positivas para GFP (GFP+) 72 h após a transdução com volumes iguais de lisados do painel A (10 μL cada). Para simplificar, apenas a condição do DNA que resultou nos maiores rendimentos vetoriais (2650 ng) é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Caracterização analítica do rAAV produzido em uma configuração mini-HT24 e comparação de títulos em diferentes escalas. (A) Análise ELISA dos títulos de capsídeo rAAV purificado em cada poço. Os valores são representados como variações acima do título médio de partículas da placa após a purificação. Os títulos esperados dependem do capsídeo AAV usado e do transgene empacotado. Os títulos de partículas para diferentes vetores de AAV variaram entre 10¹¹ e 10¹² VP/mL altos. (B) Análise da razão VP por WES de rAAV purificado dos poços indicados. AAV2 recombinante VP1, VP2 e VP3 foram usados como controles positivos em uma razão molar de 1:1:10. (C) análise de dPCR de rAAV purificado de cada poço. Os valores são mostrados como variações acima do título genômico médio da placa após a purificação. Os títulos esperados dependem do capsídeo AAV usado e do transgene empacotado. Os títulos genômicos para diferentes vetores de AAV variaram entre 10¹⁰ (rAAV2) e 10¹¹ vg/mL (rAAV9, não mostrado aqui). (D) Razão vazio-cheio (E/F) dos poços indicados, com base nos resultados genômicos e de títulos de partículas dos painéis A e C. Os valores são normalizados para a média da placa. A média de E/F no formato mini-HT24 para rAAV2 mostrada é de 10,6% ± 3,0% após a purificação da resina de afinidade AAVX. (E) Análise de western blot capilar de proteínas VP em amostras rAAV2 purificadas de cada poço. (F) Comparação dos rendimentos totais do genoma viral considerando os volumes finais de amostra e concentração de cada método. Os dados são mostrados como diferença média de dobra no menor formato (micro-6 poços), com barras de erro indicando desvio padrão (DP) de réplicas biológicas. Para produção de alto rendimento em poços profundos de 24 poços profundos com purificação de resina de afinidade AAVX, SD = ±0,176 (n = 24); para sonicação de micro-6 poços; DP = ±0,349 (n = 6); e para produção padrão em média escala com purificação de gradiente de CsCl, DP = ±134,70 (n = 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Comparação de potência e pureza entre rAAV purificado com resina de alto rendimento (HT) e amostras purificadas com CsCl padrão. (A) Neurônios motores e astrócitos derivados de humanos foram transduzidos com a mesma construção rAAV expressando o repórter de fluorescência mRuby3 sob o promotor de sinapsina humana como repórter em um MOI de 50.000. As imagens de microscopia de fluorescência foram capturadas em um microscópio de imagem ao vivo sete dias após a transdução (DPT). Os rAAVs foram purificados usando o método padrão de gradiente de CsCl (superior) ou a abordagem baseada em ponta de resina de afinidade HT AAVX (inferior). As amostras purificadas com CsCl foram expostas a um ciclo adicional de congelamento e descongelamento antes da transdução e comparadas com rAAVs purificados com resina. (B) Análise de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de variantes baseadas no sorotipo rAAV2 purificadas via gradiente de CsCl (superior) e métodos de ponta de resina HT (inferior). Dois lotes de amostras purificadas com resina HT de rAAV2 podem ser comparados sem diálise (canto inferior esquerdo) e com diálise (canto inferior direito). As razões vazio para cheio (E/F) foram determinadas usando MET para > 90% cheio para amostras purificadas por ultracentrifugação com gradiente de CsCl e < 40% cheio para amostras purificadas com resina de afinidade AAX. Barra de escala = 100 nm. O painel B mostra imagens representativas de lotes purificados usando os métodos indicados. Observe que essas imagens não pertencem às mesmas preparações usadas para experimentos de transdução mostrados no painel A. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Transfecção de células HEK293T para produção de rAAV2-GFP usando a configuração de micro-6 poços. Várias quantidades de DNA, concentrações de NaCl (em mM), produtos de PEI e proporções de PEI para DNA foram usadas para transfecção (conforme descrito na Figura 2). As imagens foram tiradas 72 h após a transfecção usando o mesmo tempo de exposição (320 ms). Imagens representativas de microscopia de campo claro e fluorescência são mostradas nesta figura. Ampliação: 10X. Barra de escala não mostrada; A imagem é apenas para fins ilustrativos e avaliação qualitativa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este documento de protocolo descreve métodos eficientes para a produção de rAAV em ambientes de alto rendimento e pequena escala, utilizando células aderentes e em suspensão. Essas metodologias atendem à crescente demanda por processos de produção de rAAV escaláveis e flexíveis que suportam a pesquisa pré-clínica, minimizando o tempo, o custo e o consumo de recursos.

Os sistemas de células aderentes e em suspensão oferecem vantagens e desafios distintos para a produção de rAAV em pequena escala. Os sistemas celulares aderentes, como as células HEK293T²⁸ cultivadas em formatos de placas de vários poços, são particularmente adequados para o projeto de vetores em estágio inicial e estudos comparativos. Sua compatibilidade com protocolos de cultura e transfecção estabelecidos permite uma implementação direta na maioria dos laboratórios. Por exemplo, Grosse et al. utilizou a produção em pequena escala em placas de 6 poços para investigar a funcionalidade da AAP, uma proteína crucial para a montagem do capsídeo viral²². Drittanti et al. produziram vetores rAAV em placas de 96 poços para avaliar a cinética da replicação do rAAV e testar os efeitos de diferentes auxiliares de adenovírus na produção de rAAV²³. Notavelmente, no último estudo, foi descrito um ensaio de replicação usando células HeLa especializadas expressando AAV Rep e Cap para amplificar ainda mais o sinal. Mais recentemente, Quan et al. aplicaram um protocolo de produção de alto rendimento de 384 poços no contexto de uma tela de siRNA, relatando títulos relativos²⁴. No entanto, dada a quantidade limitada de material, ainda permanece incerto quantos ensaios e leituras podem ser realizados, ou se MOIs suficientes podem ser alcançados em experimentos de transdução celular além da medição de proteínas fluorescentes, potencialmente impactando a reprodutibilidade.

Neste trabalho, a produção baseada em micro-6 poços em células HEK293T aderentes foi usada para otimizar as condições de cultura para rAAV2 (Figura 1 e Figura 2). Em consonância com estudos anteriores e relatórios técnicos ^43,44, menores proporções de PEI para DNA e a adição de NaCl durante a transfecção impactaram positivamente a produção de rAAV. Isso se refletiu indiretamente nas eficiências de transdução dos vetores produzidos em HEK293A células. As diferenças marcantes observadas com as menores proporções de PEI:DNA foram atribuídas principalmente ao estresse celular, conforme indicado pela baixa viabilidade celular, particularmente com o PEIpro. Embora os efeitos tenham sido menos aparentes nas condições de PEImax, as imagens de microscopia revelaram áreas livres de células na camada celular, indicando estresse ou descolamento celular (Figura 1 suplementar).

É importante ressaltar que esses achados não foram diretamente aplicáveis à produção de vetores em culturas em suspensão, enfatizando que as condições experimentais que aumentam a produção de rAAV em células HEK293T aderentes nem sempre se traduzem em células em suspensão, mesmo quando o tipo de célula subjacente permanece o mesmo. Essa discrepância pode ser atribuída a diferenças nos níveis transcriptômico e proteômico entre esses dois sistemas⁴⁵. Consequentemente, um alinhamento mais próximo com os processos de produção clínica pode exigir o uso de culturas de suspensão nas fases iniciais de desenvolvimento. Com base nessas observações e na vantagem de alcançar densidades celulares mais altas em suspensão, um sistema de poço de 24 profundidades foi adotado para produzir rAAV em culturas de suspensão em miniescala (mini-HT24). Este sistema passou por extensa validação, demonstrando títulos consistentes de vg/mL e vp/mL em toda a placa, juntamente com expressão e proporções uniformes da proteína VP (Figura 3A-E). De fato, as densidades celulares mais altas alcançadas na configuração mini-HT24 (3 × 10⁶ células/mL) em comparação com o formato micro-6 poços (5 × 10⁵ células por poço) resultaram em títulos mais altos de rAAV, conforme mostrado na Figura 3F. Isso destaca uma vantagem importante dos sistemas baseados em suspensão, que não são limitados pela área de superfície do recipiente de cultura. No entanto, a implementação de tais sistemas requer equipamentos especializados que podem não estar disponíveis em todos os laboratórios. Finalmente, recomenda-se validar ainda mais as moléculas principais identificadas ou as condições de cultura superiores do sistema mini-HT24 usando sistemas de minibiorreatores como AMBR15 ou AMBR250, pois esses sistemas demonstraram imitar mais de perto as condições de produção em grandes biorreatores^46,47.

A escolha do nível de purificação desempenha um papel crucial na determinação da adequação das preparações de rAAV para aplicações específicas a jusante. Os lisados brutos, derivados de culturas aderentes (micro-6 poços) e em suspensão (mini-HT24), fornecem uma opção rápida e eficiente em termos de recursos para ensaios preliminares de triagem. Esses lisados contêm uma mistura de partículas virais, detritos celulares e componentes de mídia, o que é aceitável para aplicações como título genômico de vetor/partículas, triagem de eficiência de transdução e análise de western blot. Especialmente aplicável em estudos que abordam questões biológicas fundamentais (como exemplificado acima na investigação da funcionalidade da AAP), otimização da condição da cultura celular e triagem e seleção de candidatos pré-clínicos. No entanto, a presença de impurezas pode exigir diluições mais altas, resultando em sensibilidades de ensaio mais baixas. Além disso, as impurezas podem afetar negativamente a viabilidade de tipos de células sensíveis, como células primárias.

Em contraste com os lisados brutos, as preparações purificadas por resina de afinidade AAVX, usadas exclusivamente no protocolo baseado em suspensão, atingem um nível mais alto de pureza isolando seletivamente os capsídeos intactos. Isso supera as limitações dos lisados de células brutas, tornando essas preparações mais adequadas para aplicações como estudos in vivo , bem como análises in vitro detalhadas da cinética de expressão de transgenes e leituras funcionais precisas, que geralmente requerem maiores quantidades de material (ver comparação de rendimento na Figura 3F). Para aplicações in vitro , os rendimentos de vetores rAAV produzidos no cenário mini-HT24 foram geralmente suficientes para a maioria das leituras, dependendo do número de células e MOIs necessários. Em contraste, as aplicações in vivo normalmente requerem produção em escalas de frasco midi-shake ou maiores, dependendo da dose, via de administração e modelo animal. Apesar do aumento do custo e do tempo necessários para a purificação, a consistência e a confiabilidade do material resultante geralmente justificam o investimento para casos de uso críticos. Notavelmente, os resultados mostrados na Figura 4 demonstram que os vetores rAAV purificados usando métodos de resina de afinidade têm desempenho comparável aos purificados por meio da ultracentrifugação tradicional de cloreto de césio (CsCl). Isso está de acordo com observações anteriores de que os capsídeos vazios não têm efeito sobre a transdução ou podem até aumentá-la, dependendo das espécies de AAV presentes⁴⁸. É importante notar, no entanto, que apenas um MOI e um ponto de tempo foram usados neste experimento, e as condições ideais precisam ser determinadas individualmente para cada tipo de célula. Enquanto a purificação de CsCl geralmente produz um fundo mais limpo, os AAVs purificados com ponta de resina HT mostram maior variabilidade na pureza (veja as imagens TEM na Figura 4). Coletivamente, essas descobertas apoiam ainda mais a adoção de fluxos de trabalho de alto rendimento e pequena escala.

O uso de ponteiras preenchidas com resina de afinidade em pequena escala na purificação de alto rendimento fornece uma solução prática para triagem rápida de rAAV, mas vários aspectos técnicos requerem atenção para garantir resultados confiáveis. Devido ao volume limitado do leito de resina, essas pontas são particularmente propensas a entupimento, especialmente ao processar lisados brutos. Portanto, a clarificação de lisados por centrifugação de alta velocidade é essencial para remover os detritos celulares antes do carregamento, pois a clarificação insuficiente pode reduzir as taxas de fluxo e comprometer o rendimento. Para a configuração do mini-HT24, recomenda-se otimizar os protocolos de transfecção e manter um volume máximo de trabalho de 2,5-3 mL por poço. Ao trabalhar com vários sorotipos ou bibliotecas de capsídeos, é aconselhável testar diferentes tipos de resina de afinidade, pois a eficiência de ligação e a recuperação podem variar dependendo da estrutura do capsídeo⁴⁹. O sistema de pipetagem eletrônica multicanal portátil permite fácil integração desse fluxo de trabalho em pequenos laboratórios, oferecendo flexibilidade sem a necessidade de automação. No entanto, o manuseio manual pode introduzir variabilidade e diferenças de lote para lote. Para maior consistência, as plataformas automatizadas de manuseio de líquidos podem ser benéficas. Deve-se prestar muita atenção para evitar a contaminação cruzada durante a adição de amostras e tampões, e o uso de formatos de placa apropriados com volume de poço adequado é essencial para evitar transbordamento. Ao abordar essas considerações, incluindo esclarecimento de amostras, otimização de protocolo, seleção de resina e pipetagem cuidadosa, os pesquisadores podem minimizar problemas técnicos e aumentar a robustez e a reprodutibilidade de fluxos de trabalho de purificação de afinidade de alto rendimento e pequena escala.

Em conclusão, a combinação de métodos de produção de rAAV de alto rendimento e pequena escala com estratégias de purificação específicas para aplicações fornece uma plataforma versátil para o avanço da pesquisa em terapia gênica. Esses protocolos atendem à crescente demanda por fluxos de trabalho econômicos e eficientes, mantendo a flexibilidade para atender a diversos requisitos experimentais. Ao equilibrar as compensações entre pureza, escalabilidade e consumo de recursos, os pesquisadores podem acelerar o desenvolvimento pré-clínico e facilitar a transição para aplicações clínicas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução salina não tamponada a 0,9%	B. Braun, Melsungen, Alemanha	7647-14-5	Tampão Wash II
1 M Ácido de hidroclocirco	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, EUA	1099700050	Ajuste de pH dos tampões
10x DNase I Buffer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	AM8170G	ddPCR / dPCR
1M Tris-HCl, pH 9,0	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	J60707. AP	Tampão de neutralização
Microplacas de poços de 24 profundidades	Enzyscreen, Heemstede, Países Baixos	CR1424cl	Equipamento de cultura de suspensão
Frasco Erlenmeyer de policarbonato de 250 mL com tampa de ventilação	Corning, Nova York, NY, EUA	431144	Equipamento de cultura de suspensão
66 - 440 kDa separação 8x25 cartuchos capilares	BioTechne, Minneapolis, MN, EUA	SM-W008	Kit de Western blot automatizado
96 Poços 2.2 mL Polipropileno DeepWell	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	AB0661	Placa de processamento e armazenamento de amostras
96 placa inferior preta/desobstruída boa, superfície do TC	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	165305	Ensaios de transdução
AAV2 VP1, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg, Alemanha	640823	Reagente Wes
AAV2 VP2, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg, Alemanha	640824	Reagente Wes
AAV2 VP3, proteína recombinante	PROGEN, Heidelberg, Alemanha	640825	Reagente Wes
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN, Heidelberg, Alemanha	PRAAV2XP	Usado para amostras refinadas de resina HT.
Módulo de detecção anti-mouse para Wes	BioTechne, Minneapolis, MN, EUA	DM-002	Kit de Western blot automatizado
Primer direto específico do ensaio/modelo	Costume	Costume	ddPCR / dPCR
Sonda específica do ensaio/modelo	Costume	Costume	ddPCR / dPCR
Primer reverso específico para ensaio/modelo	Costume	Costume	ddPCR / dPCR
BalanCD HEK293 - Líquido	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Estados Unidos	NC1192689	Meio para cultura de células em suspensão
Albumina de Soro Bovino	SERVA Electroforese, Heidelberg, Alemanha	cAlbumina de soro bovino	Suplemento para meio celular aderente
Filme de rayon respirável, estéril	VWR International LLC, Radnor, PA, EUA	391-1262	Equipamento de cultura de suspensão
Termociclador C1000	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA	1851096	ddPCR
Kit ELISA de vazamento de ligante CaptureSelec AAVX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	8113522000	ELISA
Analisador Cedex HiRes	Roche Holding AG, Basileia, Suíça	5650216001	Contador de células
Microplaca de cultura CELL, 96 poços	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Áustria	655162	Equipamento de cultura celular aderente
Ácido cítrico	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	5949-29-1	Reagente de purificação; CUIDADO
Câmera TEM baseada em CMOS TVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, Alemanha	XF416	Sistema de processamento de vídeo e imagem
Software Compass (versão 6.3.0)	BioTechne, Minneapolis, MN, EUA		WES Software
Placas de poços múltiplos tratadas com TC transparente de 6 poços Costar	Corning, Nova York, NY, EUA	3516	Equipamento de cultura celular aderente
Óleo Gerador de Gotículas ddPCR	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA	#1864110	reagente ddPCR
Óleo para Leitor de Gotículas ddPCR	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA	#1863004	reagente ddPCR
ddPCR Supermix para Sondas (sem dUTP)	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA	#1863023	reagente ddPCR
DMEM, glicose alta	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	11960044	Meio para cultura de células aderentes
DMEM, glicose baixa	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	11885084	Meio para cultura de células aderentes
Placas de DNA de baixa ligação de 96 poços	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	30129504	ddPCR / dPCR
Tubos de baixa ligação de DNA	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	30108051	ddPCR / dPCR
DPBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	14190094	Tampão de lavagem
Grades EM (T600H-698 l/polegada Hex. malha Barra fina; EMS)	Ciências da Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA, EUA	FFTH600--UL	Análise de microscopia eletrônica
Sistema de imagem EVO M5000	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	AMF5000	Microscópio de imagem ao vivo para ensaios de transdução
Pacote Padrão EZ 3	BioTechne, Minneapolis, MN, EUA	PS-ST03EZ-8	Kit de Western blot automatizado
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 15mL	Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	11507411	Processamento de amostras
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 50mL	Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha	10203001	Processamento de amostras
Geltrex LDEV-Free Fator de Crescimento Reduzido Matriz de Membrana Basal	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	A1413201	Revestimento de placa de cultura
Suplemento GlutaMAX (L-alanil-L-glutamina)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	35050061	Suplemento para meio celular aderente
HEK293A	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	R70507	Ensaios de transdução (somente para uso em pesquisa)
HEK293T	ATCC, Manassas, Virgínia, EUA	CRL-3216	Cultura de células aderente, usada para produção de rAAV (somente para uso em pesquisa)
Solução HEPES, 1M	Merck, Darmstadt, Alemanha	#H0887	Suplemento para meio celular aderente
Nuclease ativa HL-sal, SAN (25 U/µ L)	ArcticZymes Technologies, Troms, Noruega	70910-202	ddPCR / dPCR
Lavadora de microplacas HydroSpeed	Tecan, Mä nnedorf, Suíça	30190101	ELISA
Kit de astrócitos iCell, 01434	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, EUA	R1092	Ensaios de transdução
Kit de neurônios motores iCell, 01279	FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, EUA	R1051	Ensaios de transdução
Infinito 200 PRO	Tecan, Mä nnedorf, Suíça	30213617	ELISA
JEM-1400Plus é um microscópio eletrônico de transmissão	JEOL Ltd., Akishima, Tóquio, Japão	JEM-1400Plus	microscópio eletrônico de transmissão
Tampa sanduíche de baixa evaporação com pinos	Enzyscreen, Heemstede, Países Baixos	CR1224c	Equipamento de cultura de suspensão
Leitor de Microplacas  SpectraMax i3	Molecular Devices, San Jose, CA, EUA	i3x	ELISA
Anticorpo monoclonal anit-AAV2 VP1/VP2/VP3 de camundongo	PROGEN, Heidelberg, Alemanha	690058	Reagente Wes
Água livre de nuclease	Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha	3036430103	ddPCR / dPCR
Opti-MEM, Meio de Soro Reduzido	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	#31985070	Meio para formação de complexo PEI-DNA
PBS	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	#10010023	Tampão de lavagem
PEI-MAX, polietilenoimina, estoque de 1mg/ml	Policiências Europa,  Hirschberg an der Bergstraß e, Alemanha	24765 ou 24765	Reagente de transfecção
PEIpro	Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, França	101000033/10mL	Reagente de transfecção
Placa de microdiálise Pierce, 96 poços, 0,3 mL, 20K MWCO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	Rolamento A50472	Equipamento de purificação
Poloxâmero 188	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Estados Unidos	P5556-100mL	Reagente de cultura celular; CUIDADO
Solução de Poli-L-Ornitina (0,01%)	Sigma-Aldrich	A-004-M	Ensaios de transdução
Solução de proteinase K (20 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	25530049	ddPCR / dPCR
Proteína Simples " Wes"	BioTechne, Minneapolis, MN, EUA	004-600	Dispositivo para Western Blot autmatado
Sistema de plataforma QIAcuity Eight	Qiagen, Hilden, Alemanha	911052	para dPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96 poços	Qiagen, Hilden, Alemanha	250021	ddPCR / dPCR
Kit de PCR de sonda QIAcuity	Qiagen, Hilden, Alemanha	250101, 250102 ou 250103	ddPCR / dPCR
Pacote de software QIAcuity 1.2	Qiagen, Hilden, Alemanha		Software de dPCR
Gerente QX	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA		Software ddPCR
Leitor de gotículas QX200	Laboratórios Bio-Rad, Hércules, EUA	1864003	ddPCR
Microtubo com tampa de rosca, 1,5 ml, PCR Performance Tested	Sarstedt, Nü mbrecht, Alemanha	72.703.416	Equipamento de cultura de suspensão
Tampa de rosca, DNA LoBind, 5,0 mL	Eppendorf, Hamburgo, Alemanha	30122348	Equipamento de cultura de suspensão
Incubadora Shaker	Infors AG, Bottmingen, Suíça	Multitron	Equipamento de cultura de suspensão
Piruvato de sódio (100 mM)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	11360070	Meio para cultura de células aderentes
Sistema de buzina de microplaca Sonicator	QSonica, Newtown, CT, EUA	Q700MPXC	Sonicator usado para geração de lisado bruto
ESPÍRITO			Link para o banco de dados SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Unidade de filtro superior de tubo de centrífuga estéril Steriflip-GP	Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, EUA	SCGP00525	Equipamento de preparação de tampão
T-175, FRASCO DE CULTURA DE CÉLULAS, 550 ML, 175 CM²	Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Áustria	660175	Equipamento de cultura celular aderente
Tripsina / EDTA 0,025%	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	R001100	Reagente para cultura celular
Células de produção de vírus 2.0 (VPC2.0)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA	A49784 ou A51218	Produção de rAAV
		J63596. K2	Diluir 1:10 para solução de trabalho PBST