Produção baseada em microbioreadores de células estromais mesenquimatosais dependentes de ancoragem, preparadas para a síndrome aguda de desconforto respiratório

Summary

Um protocolo é descrito para a produção de células dependentes de ancoragem por microtransportadores-microbioretores como potenciais terapias baseadas em células. Focando em um caso de uso da síndrome de desconforto respiratório agudo, o rendimento celular comparável e a expressão gênica favorável em relação às condições de processo baseadas em frascos são ilustrados. Esse protocolo é extensível para outras células dependentes da ancoragem e indicações de alvo.

Abstract

A terapia baseada em células é uma abordagem terapêutica emergente para uma variedade de condições de saúde. No entanto, produzir quantidades suficientes de células de qualidade continua sendo um desafio científico e técnico ativo. O produto celular final não pode ser esterilizado; portanto, considerações de esterilidade e qualidade por design são fundamentais. Para células dependentes da ancoragem, a expansão baseada em frascos ainda é utilizada em escalas de desenvolvimento e industrial, exigindo grandes áreas físicas, limitando o controle do ambiente bioquímico (pH,_CO2 e_O2, gradientes difusivos de nutrientes e metabólitos) e fornecendo pistas físicas que podem afetar a qualidade celular final. Esses desafios motivaram a adoção de abordagens de fabricação baseadas em biorreatores, mas tais abordagens normalmente ocorrem em escalas volumétricas que apresentam desafios e podem ser custosas para pesquisas exploratórias de laboratório ou desenvolvimento de processos. A produção de terapia celular por microtransportadores micro-microbioradores foi relatada como fornecendo controle bioquímico durante a cultura para um caso de teste do tipo de fonte celular - células estromais mesenquimatos. Para avaliação inicial da qualidade celular in vitro, a síndrome do desconforto respiratório agudo foi considerada como um possível caso de uso. A abordagem ilustrada aqui permite o desenvolvimento rápido de processos em escala de laboratório devido ao pequeno volume (2 mL) e ao controle bioquímico rigoroso no microbiorator. Para alcançar isso em um tipo celular dependente de ancoragem, como as células estromais mesenquimatos, foi necessária uma modificação substancial do processo microbioreador e utilizou uma plataforma de microtransportadores de gelatina produzida internamente por meio de um processo microfluídico. Aqui, detalhes adicionais são ilustrados sobre os parâmetros do método e do processo usados para cultivar essas células dependentes de ancoragem no microbiorator, com a intenção de permitir que outros pesquisadores adaptem essas práticas para seus próprios casos de uso e tipos de fontes celulares.

Introduction

O uso de células vivas como produto terapêutico emergiu recentemente como uma nova e promissora opção de tratamento para vários desafios de saúde. Por exemplo, as células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) trouxeram remissão duradoura para aqueles com os chamados cânceres líquidos — leucemia, linfoma e mieloma múltiplo — que eram refratários a todos os tratamentos anteriormente^{disponíveis 1}. Mais recentemente, um produto mesenquimal-estaco/célula estromais (MSC) (Ryoncil) foi aprovado para tratar crianças que sofrem de doença aguda refratária a esteroides do enxerto contra o hospedeiro (SR-aGvHD), uma condição com mortalidade >^50%. Mas a extensão para outras necessidades clínicas não atendidas exige o desenvolvimento intensivo tanto da terapia quanto dos meios para desenvolver e fabricar esse produto.

Uma dessas necessidades clínicas não atendidas pode ser encontrada em indivíduos que sofrem de síndrome de dificuldade respiratória aguda (SDRA). O ARDS é discutido aqui para fornecer um caso de uso específico que ilustre o método, os resultados e a discussão sobre possíveis extensões para outros alvos de doenças. Uma indicação crítica (progressão em horas a dias), prevalente (> 200.000 casos anuais nos EUA) e fatal (mortalidade de 27%-46%, dependendo da gravidade da apresentação), o SDRA atraiu atenção renovada e ampla durante a pandemia de COVID-19 como o mecanismo típico de morte para pacientes infectados com SARS-CoV-2 ^3,4. O SDRA é caracterizado pelo aumento da permeabilidade vascular pulmonar, levando a edema intersticial, inundação alveolar e infiltração de componentes celulares, incluindo neutrófilos e glóbulos vermelhos, no compartimento^{alveolar 5}. Na fase inicial de exudação da SDRA, a inflamação inata mediada por células imunes provoca esses resultados patogênicos ao danificar a integridade da barreira endotelial e epitelial e promover o recrutamento e a ativação das células imunológicas por meio da secreção de citocinas pró-inflamatórias; A resolução bem-sucedida da resposta inflamatória, a reparação da integridade da barreira e a prevenção de fibrose excessiva são críticas para a^{sobrevivência 3}. Embora terapias antivirais como o Remdesivir tenham mostrado potencial no combate ao SDRA mediado pelo SARS-CoV-2, para outras etiologias, atualmente não existem intervenções farmacológicas aprovadas que reduzam a^{mortalidade 5}.

As CSM podem oferecer uma abordagem promissora para o tratamento do SDRA, dado seu tropismo pulmonar específico após a injeção sistêmica e sua capacidade de secretar sinais paracrinos imunomoduladores para o microambiente ao^{redor 6,7}. Estudos mecanicistas implicaram a expressão de fatores paracrinos como interleucina-10 (IL-10⁾⁸, indoleamina 2,3-dioxigenase 1 (IDO1)⁹, prostaglandina E2 (PGE2)¹⁰ e outros na potência terapêutica da suposta MSC para múltiplas indicações, incluindo lesão pulmonar aguda (ALI)/^{SDRA 11}; portanto, os níveis de expressão desses produtos gênicos representam potenciais atributos críticos de qualidade (pCQAs) que podem ser preditivos da eficácia clínica, fornecendo critérios de liberação tratáveis para o produto celular final durante a fabricação. No entanto, produzir quantidades suficientes de células para atingir uma dose terapêutica eficaz é desafiador; O rioncil, por exemplo, é indicado para dosagem em 2 x 10⁶ células/kg de massa do paciente, administrado duas vezes por semana durante 4^{semanas e 12}. Para um paciente de 80 kg, isso equivale a > 1,2 bilhão de MSCs para um único tratamento, exigindo uma grande área física para abrigar uma área de superfície suficiente para essa condição de crescimento 2D. Considerando que esse produto de células vivas não pode ser esterilizado antes da administração do paciente sem prejudicar o potencial terapêutico das células, a utilização das atuais diretrizes de Boas Práticas de Fabricação para produção de forma estéril é fundamental, aumentando a complexidade logística da fabricação celular e, consequentemente, o custo dos^{bens 13}.

Além disso, estudos anteriores mostraram evidências de que a produção típica de MSC em frascos de poliestireno em cultura de tecidos (TCPS) contribui para o surgimento da heterogeneidade fenotípica intra-populacional. Para alguns usos finais, isso torna os esforços de controle de qualidade entre lotes desafiadores tanto na pesquisa quanto na tradução^{clínica 14, 15, 16, 17}. Especula-se que o controle bioquímico limitado disponível nos frascos TCPS, incluindo gradientes difusivos de gases, nutrientes e resíduos metabólicos, má regulação do pH, etc., contribuem para esses desafios.

Essas questões motivam a adoção de culturas baseadas em biorreatores para aproveitar a regulação bioquímica superior e a densidade celular disponíveis em um formato de crescimento tridimensional controlado com mistura^{dinâmica 18}. No entanto, o processamento ou fabricação baseado em biorreatores traz seus próprios desafios: como um tipo celular dependente da ancoragem, os MSCs requerem algum tipo de substrato sobre o qual crescerem em um biorreator, o que exige a adição de microtransportadores. Além disso, muitos biorreatores comercialmente disponíveis operam em escalas de volume que são proibitivamente intensivas em recursos (> 3 L de meio de crescimento) para o tipo de pesquisa exploratória de laboratório necessária para identificar e refinar parâmetros desconhecidos do processo que afetam a expressão de indicadores mensuráveis da qualidade celular. Essas características são descritas como atributos potenciais de qualidade crítica ou^{pCQAs 19}.

Krupczak et al. relataram anteriormente uma abordagem microtransportador-microbioreator que produziu MSCs com melhor expressão de pCQA para ARDS, limitada a avaliações in vitro ²⁰. Essa abordagem combinava o uso de uma plataforma de microtransportadores de gelatina solúve, produzida internamente, com uma plataforma de microbioreator comercialmente disponível, o Mobius^{Breez 21}. Este microbioreador utiliza câmaras descartáveis descartáveis de 2 mL e incorpora muitas características desejáveis para melhor controle bioquímico, incluindo regulação de temperatura, pH, CO₂ e_O2 em um sistema de perfusão de circuito fechado e misturado dinamicamente, mas não foi projetado pensando em células dependentes de ancoragem como as MSCs. De fato, os canais microfluídicos padrão usados para injetar o conteúdo do reator são pequenos demais para permitir a passagem de microtransportadores, exigindo adaptações substanciais para possibilitar a produção bem-sucedida de MSCs nessa plataforma.

Aqui, um protocolo detalhado é descrito e ilustrado com o propósito de adaptar esse microbioreador para a cultura dependente de ancoragem de MSCs. Os parâmetros do processo aqui relatados foram identificados com a intenção de informar o desenvolvimento e a fabricação de processos de MSCs para avaliação pré-clínica e in vitro da eficácia terapêutica do SDRA. No entanto, em princípio, esse protocolo pode ser adaptado para outras aplicações de usuários finais, outras condições inflamatórias ou relacionadas a imunomoduladores, e outros tipos celulares dependentes de ancoragem que poderiam se beneficiar de um controle bioquímico aprimorado em um ambiente de laboratório. A Figura 1 esquematiza o protocolo descrito no vídeo acompanhante, e as Figuras 2, 3 e 4 ilustram os principais resultados.

Protocol

1. Montagem e preparação de microbioreadores

1. Preparação do número necessário de consumíveis para microbioreatores
   1. Certifique-se de que o gabinete de biossegurança (BSC) esteja ligado e estéril. Remova a bolsa de alumínio que cobre o novo consumível, perfurando a parte superior da bolsa e mantendo a bolsa de alumínio até a conclusão deste experimento (para registrar detalhes do lote# em caso de defeito). Abra a embalagem externa do blister e descarte a bolsa de hidratação que está dentro. Descarte a embalagem externa com blister.
   2. Borrife a embalagem interna, com etanol 70%, e leve para dentro do BSC. Abra a embalagem interior do blister e descarte.
   3. Usando uma seringa estéril, remova o êmbolo e conecte o bico a um filtro estéril de 0,22 μm. Despeje 50 mL de água ultrapura não esterilizada no barril da seringa. Enquanto segura a seringa sobre um tubo estéril de 50 mL em espera, reinsira o êmbolo na seringa e injete a água filtrada estéril no tubo de coleta em espera.
   4. Remova a tampa plástica transparente que conecta à garrafa LL no suporte de garrafas. Usando uma nova seringa estéril de 50 mL, remova o êmbolo e conecte o bico ao frasco LL. Despeje a água filtrada estéril no cano da seringa e injete no frasco LL.
      NOTA: As portas de conexão sem agulha podem travar durante o procedimento de esterilização do fabricante, então pode ser necessário conectar e desconectar a seringa várias vezes para romper a vedação do frasco e injetar o conteúdo com sucesso. Alternativamente, você pode usar um soldador de tubos para conectar um frasco fonte ao tubo soldável de forma estéril para o frasco apropriado.
   5. Usando esse mesmo procedimento, encha o frasco L com 25 mL de DMEM de glicose baixa sem suplemento com FBS, o frasco R com 25 mL de PBS estéril e o frasco RR com 8 mL de solução antiaderente para enxágue. Use uma seringa estéril nova para cada líquido.
   6. Repita esse procedimento para o número de consumíveis necessários no experimento.
2. Realize um autoteste de POD em cada POD utilizado neste experimento.
   NOTA: O autoteste deve ser concluído sem problemas; Se um componente do autoteste falhar, trate a falha antes de continuar.
3. Retire as fitas auto-testadas para colocar em seus sacos de armazenamento protegidos contra luz.
4. Monte o consumível no biorreator conforme descrito abaixo.
   1. Remova a fita verde das válvulas do consumível e a coloque na posição no POD. Reinstale as grampos e certifique-se de que não se ouve gás/ar chiado ao escapar.
   2. Conecte a linha branca do sensor de pressão do rack de garrafas, a linha de pressão de ar vermelho e a linha azul de vácuo entre os consumíveis e a estação base/POD. Certifique-se de que a porta lateral de injeção esteja fechada com uma grampa em forma de gota branca.
   3. Siga os passos do software para iniciar um novo experimento. Esses fatores culminam com o recurso de autoprime e calibração, que leva ~4-5 horas e pode rodar durante a noite.
5. Rotule cada suporte de garrafas com a localização do POD para facilitar a identificação de qual POD devolver o consumível após ele ser removido do biorreator. Use fita colorida para indicar a posição: Pod0 = vermelho, Pod1 = laranja, Pod2 = amarelo, Pod3 = verde. Escreva o nome do experimento e a data na fita.
6. Deixe os consumíveis para calibrar durante a noite. Garanta que a mídia possa entrar no reator e sair pela linha de resíduos.
7. Se planejar usar células armazenadas em nitrogênio líquido, descongele e place-as para que tenham > 24 horas para se recuperar do armazenamento criogênico antes da injeção.

2. Recalibração e preparação de microtransportadores

1. Certifique-se de que as etapas de auto-priming e calibração foram concluídas com sucesso.
   1. Se a calibração não for concluída com sucesso, identifique e corrija quaisquer problemas de causa raiz e então tente uma recalibração. Problemas comuns incluem não remover a gramposa branca do suporte de garrafas, não remover a fita verde do consumível antes de colocá-lo no POD, e volume insuficiente do meio na garrafa de mídia.
2. Certifique-se de que os sensores de oxigênio dissolvido estejam estáveis.
   1. Quase 10% dos consumíveis apresentarão desvio do sensor no sensor DO após a calibração. Realize a ação corretiva preferida, que é refazer a calibração completa. Se necessário, realize uma das seguintes ações.
      1. Certifique-se de que não haja ar na fita, depois desmarque a caixa de visualização para mostrar os controles, e então clique em Autocalibrar DO e pH.
         1. Se ar estiver presente no reator quando for necessária uma recalibração, retorne à primeira página do painel MBS clicando na seta azul esquerda no canto superior esquerdo da janela para o POD específico em questão. Clique no botão para ativar as operações manuais. Marque a caixa Tubo de resíduo pronto e digite W na caixa de entrada de texto para selecionar a garrafa de resíduo. Clique no botão Ejetar-lavar e depois clique em Sim, na janela pop-up. Isso esvaziará as câmaras do reator e as reabastece com mídia da garrafa de origem.
3. Prepare o número correto de microportadores em tubos cônicos de 15 mL, um para cada condição.
   NOTA: Número de microtransportadores, área de superfície agregada e densidade de semeadura celular dependerão da sua aplicação. Para esse protocolo, recomenda-se injetar um número absoluto de microtransportadores, resultando em 75^cm2 de área de crescimento disponível para comparação com um frasco T75.
4. Permitir que os microtransportadores se assentem no tubo; aspire o máximo de sobrenadante possível sem remover microtransportadores para abrir espaço para células e meios frescos.

3. Injeção de células e microportadores

1. Certifique-se de que as funcionalidades de autoprime e calibração foram concluídas com sucesso.
2. Clique na janela do software como se o reator estivesse sendo inoculado de acordo com o fluxo padrão de células de suspensão.
3. Insira uma nota na janela pop-up para indicar que nenhuma injeção de células ocorreu até o momento.
4. Ative as operações manuais para pausar a mistura do reator e adicione um C-clamp branco às linhas do suporte de garrafas.
5. Remova cada consumível e transfira para o BSC. Remova o meio gasto dos resíduos e frascos de perfusão e descarte.
   1. Certifique-se de remover todos os resíduos do frasco grande de perfusão, assim como do tubo menor de 1,5 mL contido dentro do frasco de perfusão, caso planeje coletar meio condicionado em qualquer momento do estudo.
6. Remova o meio de cultivo não suplementado com soro do frasco L e descarte. Enxágue a garrafa L com ~20 mL de PBS estéril e descarte. Adicione 25 mL de meio de cultivo suplementado com soro ao frasco L.
7. Devolva os consumíveis aos respectivos PODs. Coloque as garrafas de meio em gelo durante o restante do experimento. Renove o gelo diariamente.
   NOTA: O gelo úmido pode ser complementado com pacotes de congelador para prolongar a duração do controle de temperatura.
8. Lave os reatores com PBS e lave as linhas.
   1. Clique no botão Lavar garrafas , ative o botão Radio para a Garrafa L, selecione Saída para Desperdício e depois clique em Iniciar Lavar MSCserum.
      NOTA: Isso irá expulsar a mídia hMSC recém-adicionada pela linha para garantir que nenhuma outra mídia não suplementada por FBS entre no reator.
   2. Clique novamente no botão Flush bottles , selecione o botão Radio para Bottle RR e comece a dar descarga. Isso vai lavar a solução antiaderente através da linha e garantir que ela esteja preparada para entrada no reator.
   3. Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique no software que o MSCserum está localizado na Garrafa R, que na verdade contém PBS.
   4. Vá para a operação manual e realize três ciclos de ejeção-lavagem na garrafa de lixo.
9. Adicione solução de enxágue antiaderente ao reator.
   1. Volte à janela de Conteúdo da Garrafa e indique que o MSCserum está localizado na Bottle RR, que na verdade contém solução antiaderente para enxágue.
   2. Vá para a operação manual e realize um ciclo de ejeção-lavagem na garrafa de resíduo.
      NOTA: A antiga lavagem PBS servia para evitar que qualquer componente do DMEM interferisse com a lavagem antiaderência; agora, o reator deve estar cheio de solução antiaderente com PBS em traços.
10. Após 30 minutos com a solução antiaderente presente, enxágue o consumível com PBS.
    1. Na janela de Conteúdo da Garrafa, indique no software que o MSCserum está localizado na Garrafa R, que na verdade contém PBS.
    2. Vá para a operação manual e realize três ciclos de ejeção-lavagem na garrafa de lixo.
    3. Volte para a janela de Conteúdo da Garrafa e indique no software que o MSCserum está localizado na Garrafa L, que contém mídia hMSC.
11. Esvazie o reator para aguardar a injeção de células e microtransportadores. No painel de operações manuais, clique em Reinocular e deixe o sistema na fase em que o painel indica para inocular o reator.
    NOTA: Aqui, o termo inocular significa simplesmente a injeção das células destinadas à expansão no microbiorator.
12. Adicione os resistores adicionais para modular a velocidade de mistura em linha com o resistor padrão R0.
13. Retire as células do cantil e conte-as em um hemocitômetro. Realize todas as operações abertas em um BSC para garantir a esterilidade.
    1. Aspire o substrato e depois lave com 5-10 mL de PBS pré-aquecido. Aspire o PBS e adicione 5 mL de tripsina + EDTA ao frasco.
    2. Incube a 37 °C por 5 minutos ou até que todas as células tenham se levantado visivelmente da superfície do frasco.
    3. Adicione 10 mL de meio hMSC pré-aquecido para neutralizar a atividade de tripsina. Retire o conteúdo líquido e deposite-o em um tubo centrífugo de 15 mL.
    4. Centrifuge as células a 300 x g por 5 minutos. Descarte o sobrenadante e resuspenda a célula em um volume apropriado de mídia hMSC para contagem. Para um frasco T75 totalmente confluente, um volume adequado é tipicamente de 2-4 mL, o que resultará em uma concentração celular de ~1-2E6 células por mL.
    5. Misture uma amostra das células ressuspensas com uma parte igual de corante de viabilidade Trippan Blue e coloque a mistura em um hemocitômetro para contagem. Conte as células conforme as instruções do fabricante.
14. Calcule o volume de solução celular necessário para alcançar 150.000 células e pipetee essa quantidade no tubo cônico de 15 mL que espera contendo microtransportadores para cada condição. Aumente o volume do tubo para ficar entre 2,2 e 2,5 mL com mídia hMSC fresca e quente.
    NOTA: O volume em cada cônico de 15 mL deve ser ligeiramente maior que 2 mL, de modo que a injeção resulte em uma condição de reator levemente sobrecarregado para evitar bolhas, que serão equalizadas em uma etapa posterior.
15. Adicione o volume apropriado de células ao controle do frasco T75.
16. Trabalhando com um ou dois consumíveis por vez, remova os consumíveis do POD e leve-os para o BSC.
17. Retire células e microtransportadores em uma seringa de 5 mL usando agulhas verdes de 4 polegadas rombas. Injete as células e microtransportadores no reator.
18. Devolva o consumível à estação base e repita até que todos os consumíveis tenham sido injetados.
19. Clique nas Janelas do Software para indicar que a vacinação foi realizada. Quando o software retorna à página inicial normal, remova o grampo branco das linhas de saída dos consumíveis.
20. Entre em operação manual e execute uma função de Ejetar Excesso com a porta de saída configurada para P para perfusão. Ative o modo de mistura estática, usando 1680 s ligado e 120 segundos desligado. Mantenha a frequência de mistura em 5 Hz para a mistura estática.
21. Desligue a medição de referência de densidade óptica.
    1. Abra o Cliente MBS e clique em Conectar. Insira o seguinte comando contido nas aspas: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Clique em enviar, aguarde confirmação de que o comando foi enviado com sucesso e feche o Cliente MBS.
22. Após 24 horas, desative o modo de mistura estática e reative a mixagem normal. Reduza a frequência de mistura para 1,5 Hz.

4. Operação do microbiorador

1. Monitore o microbioreator diariamente para garantir que nenhum problema atrapalhe o experimento. Certifique-se de que as garrafas fonte de mídia mantenham >5 mL de meio para perfundir o reator com sucesso sem problemas.
2. Troque os baldes de gelo conforme necessário para manter o controle de temperatura da garrafa de meio. Mantenha a cortina protetora contra a luz sobre a frente do microbioreator para evitar a degradação dos componentes do meio voláteis pela luz.
3. Certifique-se de que nenhuma bolha seja introduzida no reator. Não se esqueça de trocar periodicamente o meio no controle do frasco TCPS.

5. Colheita de microbioreadores

1. Certifique-se de que o BSC esteja estéril e pronto para operação.
   1. Aqueça os seguintes reagentes necessários em uma esfera ou banho-maria a 37 °C: ~25 mL de meio hMSC quente, 10 mL de PBS morno e 1,5 mL de Pronase 10 mg/mL necessária para a colheita.
2. Prepare o suporte para a colheita.
   1. Ative o modo de operações manuais para cada POD no software.
   2. Prenda as linhas de entrada dos consumíveis usando uma grampa branca em C ao longo da parte livre da linha.
   3. Remova os consumíveis para o BSC. Remova o conteúdo da garrafa de resíduos e descarte.
   4. Lave a garrafa de resíduos com ~20 mL de PBS e descarte. Avalie o volume restante no frasco de mídia e complete com mídia hMSC fresca (fria) se necessário.
      NOTA: Aqui, > 4 mL de meio são necessários para completar os três ciclos de ejeção-lavagem necessários para a colheita.
   5. Forre o frasco de resíduos com ~5 mL de meio hMSC frio para amortecer o fluido coletado.
3. Colhe as células do microbiorator.
   1. Usando uma seringa de 1 mL, extrai 200 μL de 10 mg/mL de Pronase na seringa e ~300-400 μL de ar.
   2. Desrosqueie a tampa da linha de injeção lateral e borrife o conector da válvula sem agulha com 70% de etanol. Remova a fita que prendia a linha de injeção lateral com nó e desfaça o nó. Desaperte a grampa branca em forma de gota.
   3. Conecte a seringa de 1 mL e injete suavemente a Pronase no reator. Acompanhe o líquido pela linha de injeção com ar para garantir que todo o conteúdo líquido seja entregue ao reator.
   4. Reengate a grampa de gota e recubra a linha de injeção da porta lateral. Devolva o consumível ao seu POD, reconecte todas as linhas, remova o C-clamp branco e retome a mistura.
   5. Certifique-se de que a garrafa de resíduos e a garrafa de origem do meio estejam congeladas. Inicie um temporizador de 5 minutos e permita que a Pronase digera os microtransportadores dentro do reator.
   6. Após 5 minutos, verifique se os microtransportadores se degradaram, verificando se não estão mais visivelmente presentes no reator. Se os microtransportadores ainda estiverem visíveis, reserve mais um minuto para a digestão. Se não houver microportadores visíveis, prossiga.
   7. Colhe as células. Ative o modo de operações manuais, defina o # dos ciclos para 3, e a saída da porta para W para desperdício, e clique em Eject Wash.
   8. Após os ciclos de lavagem de ejeção, retire o consumível de volta ao BSC e retire o conteúdo do frasco de resíduos usando uma seringa de 10 ou 20 mL.
   9. Dispense o conteúdo do frasco de resíduos em um tubo cônico de centrífuga de 15 mL. Centrifuge as células a 300 x g por 5 minutos, aspire o sobrenadante e avalie o tamanho do pellet celular.
   10. Ressuspenda o pellet celular em 1-5 mL de meio de crescimento ou PBS e conte as células em um hemocitômetro. Repita essa etapa para todos os consumíveis.
4. Colhe o(s) termo(s) frasco(s) usando seus protocolos normais de cultura celular. Um protocolo típico para MSCs é descrito na versão 3.13.

6. Analisar as células das condições do microbiorator e das condições do frasco para aplicação a jusante

NOTA: Os métodos analíticos usados para produzir os resultados apresentados são brevemente apresentados abaixo e descritos em mais detalhes em Krupczak, Farruggio e Van Vliet (2024)²⁰.

1. Controle ambiental: Use a interface gráfica fornecida pelo microbiorator para acessar e exibir dados de cada um dos sensores integrados de um consumível durante o período de cultivo. Esses dados são fornecidos no software Breez Explorer, que vem instalado no laptop fornecido junto com o microbiorator.
2. Rendimento das células: Colha MSCs conforme descrito acima e faça pellets nas células a 300 x g por 5 minutos. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda completamente o pellet celular em volume apropriado de meio PBS ou hMSC (1-2 mL). Pegue uma amostra da mistura de células ressuspensas e misture com um volume igual de corante Trypan Blue. Micropipete a mistura de amostras coloridas em um chip de hemocitômetro e mede o número e a viabilidade celular em um hemocitometro automatizado ou manual.
3. Verifique a expressão gênica por transcrição reversa em duas etapas da reação em cadeia quantitativa da polimerase, conforme descrito abaixo.
   1. Purificação de RNA: Use um kit RNeasy Mini para isolar e purificar RNA de cada amostra seguindo as instruções do fabricante. Resumindo, lisar as células, transferir o conteúdo celular para um tubo de spin de purificação e lavar as amostras com cada tampão para remover componentes celulares desnecessários, ácidos nucleicos e proteínas que possam interferir na PCR subsequente.
   2. Conversão de cDNA: Use um kit de transcrição reversa de alta capacidade e um ciclador térmico para converter o RNA purificado em DNA complementar (cDNA) conforme as instruções do fabricante. Resumindo, descongele os componentes do kit e crie uma mistura master combinando componentes nos volumes apropriados para o número de samples. Carregue partes iguais de RNA purificado e mistura master preparada (10 μL cada) em cada poço de uma placa de PCR, mantendo o cuidado de acompanhar as localizações de cada amostra de identidade. Siga o protocolo do fabricante no termociclador para completar a reação de transcrição reversa.
   3. qPCR: Utilizando primers específicos para a sequência e que abrangem exons, validados para evitar o dimérito do primer, carregue uma placa qPCR de 384 poços com primer direto, primer reverso, cDNA do molde, água sem nuclease e mistura master em volumes apropriados (tipicamente, 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL, respectivamente) usando múltiplos poços técnicos de replicação para cada gene e amostra. Divida o conteúdo entre várias placas, se necessário, para capturar todos os alvos gênicos. Certifique-se de que todas as amostras de um determinado alvo genético sejam carregadas na mesma placa para evitar variabilidade de resultado entre placas, e que cada placa tenha um gene de manutenção adequado e controles sem mole. Meça a intensidade de fluorescência em uma máquina qPCR apropriada e utilize o método ΔΔCt para quantificação relativa e calcule a expressão gênica.

Results

O microbiorator permitiu monitoramento e regulação de fatores ambientais durante aproximadamente 10 dias em cultura. Fatores ambientais, incluindo pH (Figura 2A), temperatura (Figura 2B), oxigênio dissolvido (Figura 2C) e dióxido de carbono (Figura 2D), foram precisamente medidos e mantidos nas condições do microbiororador, mas não em co...

Discussion

Neste protocolo, é descrito um método para expandir, preparar e colher células usando uma abordagem microtransportador-microbioreador. Esse processo permite que células dependentes da ancoragem, como as MSCs, aumentem o número de células sob o controle bioquímico superior de uma plataforma de biorreator (em relação aos frascos convencionais TCPS) em escala de bancada, adequada para o desenvolvimento rápido de processos. Além disso, está demonstrado que a produção de MSCs por microtranspo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução antiaderente de enxágue	Tecnologias Stemcell	7010
Gabinete de biossegurança
Microbioreator Breez	MilliporeSigma
Centrífuga
Tubo cônico, 15 mL
Tubo cônico, 50 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, baixa glicose	Gibco	11885084
Etanol
Soro Fetal Bovino	Gibco	A5670701
Hemocitômetro
Fita de Laboratório
Microcarriers
Tubo de microcentrífuga, 1,5 mL
Microscópio
Agulha, cega, calibre 18 polegadas	Amazon	B0D663ZR6D
Soro Tamponado de Fosfato	Corning	21-040-CM
Pronase, de Streptomyces griseus	MilliporeSigma	10165921001
Pipeta Serológica, 10 mL	VWR	75816-100
Água estéril deionizada
Filtro de seringa, 0,22 um, estéril	Produtos Científicos Celltreat	229762
Seringa, 1 mL	BD	309628
Serina de 20 mL	BD	302830
Serina de 5 mL	BD	309646
Seringa, 50 mL	BD	309653
Frasco de Poliestireno para Cultura de Tecidos, T75	Thermo Fisher Scientific	130190
Trippan Blue	SigmaAldrich	T8154-100ML