Regulação da Transição Epitelial-Mesenquimal no Câncer de Ovário por LncRNA MALAT1 via SNAI2 e MiR-200c-3p

Resumo

Este protocolo descreve métodos para avaliar o papel do MALAT1 na promoção da transição epitelial-mesenquimal no câncer epitelial de ovário por meio de sua regulação do eixo miR-200c-3p/SNAI2.

Resumo

O RNA longo não codificante MALAT1 regula a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e metástase no câncer de ovário epitelial (EOC) por meio de um mecanismo de RNA endógeno concorrente (ceRNA) envolvendo modulação de miRNA. Este estudo teve como objetivo elucidar a via molecular pela qual o MALAT1 influencia a EMT e o comportamento metastático via interação com miR-200c-3p e SNAI2. A expressão de MALAT1 foi geneticamente manipulada na linhagem celular EOC SK-OV-3 por superexpressão ou knockdown. Os efeitos funcionais nos níveis de proteína relacionados à EMT, migração celular e invasão foram avaliados usando Western blotting, cicatrização de feridas e ensaios de Transwell, respectivamente. A análise de bioinformática identificou o miR-200c-3p como um alvo comum de MALAT1 e SNAI2. O eixo MALAT1 / miR-200c-3p / SNAI2 foi validado por ensaios repórter de luciferase dupla e coloração de imunofluorescência para confirmar interações moleculares diretas. A superexpressão de MALAT1 aumentou a migração de células SK-OV-3 em 20% e a invasão em 5%, acompanhada por um aumento significativo na expressão de SNAI2 (P < 0,01). Por outro lado, o knockdown de MALAT1 suprimiu esses fenótipos. Ensaios de luciferase dupla confirmaram que o miR-200c-3p se liga diretamente a MALAT1 e SNAI2 (P < 0,001). A superexpressão de miR-200c-3p reduziu a EMT impulsionada por MALAT1 ao regular negativamente SNAI2 (P < 0,05), enquanto a restauração de SNAI2 reverteu os efeitos inibitórios do silenciamento de MALAT1 na metástase. Este protocolo demonstra que o MALAT1 promove EMT e metástase em EOC ao funcionar como um ceRNA que sequestra o miR-200c-3p, levando à desrepressão do SNAI2. Os resultados fornecem uma nova visão mecanicista e identificam o eixo MALAT1 / miR-200c-3p / SNAI2 como um potencial alvo terapêutico para inibir a metástase do câncer de ovário.

Introdução

O câncer de ovário (OvCa) é uma malignidade altamente insidiosa e diagnosticada tardiamente. Geralmente progride de forma assintomática até atingir estágios posteriores, caracterizados por crescimento agressivo principalmente dentro da cavidade peritoneal. Esse processo patológico geralmente se apresenta com ascite, redução da capacidade de resposta terapêutica e mau prognóstico¹. As estatísticas epidemiológicas de 2018 revelaram cerca de 295.000 novos casos diagnosticados em todo o mundo, com 185.000 eventos de mortalidade, refletindo uma trajetória ascendente persistente na carga da doença². Embora os protocolos de tratamento modernos incorporem intervenção cirúrgica e regimes farmacológicos, as limitações persistentes na detecção precoce combinadas com metástases e resistência terapêutica mantêm taxas de sobrevida em longo prazo abaixo de 45%³. A recorrência dentro de 12-18 meses é comumente observada em muitos pacientes com doença avançada⁴. Essas realidades clínicas ressaltam a necessidade urgente de identificar marcadores diagnósticos clinicamente relevantes e estratégias de monitoramento terapêutico. Portanto, é valioso para identificar marcadores diagnósticos clinicamente relevantes.

Atualmente, os pesquisadores descobriram que uma proporção substancial do genoma humano gera RNAs longos não codificantes (lncRNAs)⁵. Os lncRNAs não codificam proteínas, existem apenas na forma de RNA e desempenham papéis reguladores em várias funções biológicas das células. Os LncRNAs exibem não conservação e exibem padrões de expressão altamente específicos do tecido⁶. Notavelmente, a superexpressão específica de lncRNAs foi observada em vários tecidos cancerígenos⁷. O mecanismo de RNA endógeno (ceRNA) concorrente revelou um novo modo de interação de RNA. Está bem estabelecido que os microRNAs (miRNAs) podem silenciar genes por meio de interações específicas de sequência com regiões 3'não traduzidas (UTR) de mRNA. Enquanto isso, RNAs não codificantes (ncRNAs) podem se ligar competitivamente ao miRNA, impedindo assim sua capacidade de se ligar a genes-alvo e influenciando a expressão gênica⁸. O mecanismo de ceRNA é atualmente a hipótese mais amplamente aceita para o papel regulador dos lncRNAs. A interferência tripartida entre transcritos codificantes, miRNAs e RNAs reguladores constrói redes moleculares intrincadas que influenciam a iniciação e progressão do tumor⁹.

Identificado pela primeira vez em metástases de câncer de pulmão de células não pequenas, o MALAT1 emergiu como um lncRNA amplamente superexpresso em várias malignidades¹⁰. Em nossos estudos anteriores, identificamos aumento da expressão de MALAT1 em tecidos OvCa que se associa diretamente ao estadiamento OvCa¹¹. Aqui, apresentamos um protocolo para modular geneticamente a expressão de MALAT1 na linha celular epitelial OvCa (EOC) SK-OV-3 e avaliar seu impacto na expressão de proteínas relacionadas à transição epitelial-mesenquimal (EMT), capacidade migratória e potencial invasivo por meio de ensaios moleculares como qPCR, western blotting, ensaios repórter de luciferase dupla e ensaios funcionais, como ensaios de cicatrização de feridas e ensaios de Transwell. O objetivo é elucidar o mecanismo molecular pelo qual MALAT1 regula a EMT e a disseminação metastática em EOC por meio de interações com miR-200c-3p e SNAI2.

Os métodos existentes para estudar as interações lncRNA-miRNA geralmente empregam apenas ferramentas de previsão in silico , que podem carecer de validação experimental. Para estudos de regulação EMT, os métodos histológicos tradicionais podem não fornecer informações moleculares detalhadas. Ao empregar ensaios repórter de luciferase dupla para validação experimental, nosso estudo supera essas limitações, oferecendo uma confirmação mais confiável das interações previstas. Além disso, a combinação de vários ensaios funcionais, como ensaios de arranhões e Transwell, juntamente com técnicas moleculares, permite uma compreensão abrangente da EMT nos níveis celular e molecular, superando a profundidade fornecida pelas abordagens de ensaio único.

Protocolo

Cultura de células e transfecção

A linhagem celular OvCa humana SK-OV-3 foi cultivada em condições padrão. As células foram mantidas em meio de cultura composto por 89% de McCoy's 5A, 10% de soro fetal bovino e 1% de solução de penicilina-estreptomicina, em incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO₂. O meio foi substituído a cada 2-3 dias, e as células foram passadas ao atingir 80-90% de confluência usando 0,25% de tripsina-EDTA. Construções lentivirais para superexpressão de MALAT1 e knockdown de MALAT1 (shRNA), bem como miR-200c-3p mimic, inibidor e controles negativos, juntamente com siRNA direcionado a SNAI2 e seu siRNA de controle correspondente, foram obtidos de fontes comerciais. Para a transfecção, as células SK-OV-3 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 × 10⁴ células/poço em 500 μL de meio completo e deixadas aderir durante a noite. As transfecções foram realizadas usando um reagente de transfecção à base de lipídios (RRID: AB_2548650) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os ácidos nucléicos (miRNAs/inibidores ou siRNAs) e um reagente de transfecção à base de lipídios foram diluídos em meio de soro reduzido separadamente, incubados por 5 min, depois misturados e incubados por mais 15 min em temperatura ambiente para permitir a complexação. Os complexos foram adicionados gota a gota às células. Após 6 h, o meio foi substituído por meio completo fresco. As células foram colhidas 24-48 h após a transfecção para análises a jusante.

PCR quantitativo fluorescente em tempo real (qPCR)

O RNA total foi extraído de células SK-OV-3 cultivadas usando o reagente de extração de RNA de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram lisadas em 1 mL de reagente por poço de uma placa de 6 poços, e o RNA foi isolado usando um kit comercial de extração de RNA seguindo o protocolo fornecido. A concentração e a pureza do RNA foram determinadas usando um espectrofotômetro, e amostras com uma proporção A₂₆₀ / A₂₈₀ entre 1,8 e 2,0 foram usadas para aplicações a jusante. A transcrição reversa foi realizada usando o RT Master Mix (RRID: SCR_018597) com 500 ng de RNA total em um volume de reação de 20 μL. As condições de ciclagem térmica foram as seguintes: 37 °C por 15 min, seguido de 85 °C por 5 s para inativar a transcriptase reversa. O cDNA resultante foi armazenado a -20 ° C até o uso. A PCR quantitativa em tempo real foi realizada usando um kit comercial de detecção de miRNA qRT-PCR em um instrumento de PCR em tempo real. Cada reação foi realizada em um volume de 20 μL contendo 10 μL de master mix 2x qPCR, 1 μL de primers específicos (direto e reverso, 10 μM), 2 μL de molde de cDNA e 7 μL de água livre de RNase. As condições de ciclagem térmica foram: 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s. A análise da curva de fusão foi realizada para verificar a especificidade do produto. Os níveis de expressão foram calculados usando o método ΔΔCt, com GAPDH (para mRNA) ou U6 (para miRNA) como controles internos. Todas as reações foram realizadas em triplicata, e os dados são apresentados como média ± DP.
NOTA: O reagente de extração de RNA é um produto químico perigoso. Deve ser manuseado em um exaustor, pois é corrosivo e pode causar irritação na pele e nos olhos. Os resíduos que contêm o reagente devem ser descartados de acordo com os regulamentos locais de descarte de resíduos perigosos.

Ensaio de arranhões

As células SK-OV-3 foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 × 10⁴ células/poço e cultivadas até atingirem aproximadamente 90-100% de confluência, formando uma monocamada uniforme. Uma ponta de pipeta estéril de 10 μL foi então usada para criar um arranhão linear através da monocamada de células no centro de cada poço. Para garantir a consistência, o mesmo ângulo e pressão foram aplicados durante a formação de arranhões em todos os poços. Após coçar, o PBS foi adicionado para remover as células destacadas com duas lavagens suaves. As células foram então cultivadas em meio 5A de McCoy sem soro para minimizar os efeitos da proliferação. As imagens da área de arranhões foram capturadas imediatamente (0 h) e novamente em 24 h e 48 h usando um microscópio invertido com aumento de 10x. A largura do arranhão em cada ponto do tempo foi medida usando o software ImageJ e a porcentagem de fechamento da ferida em comparação com a largura inicial usada para calcular a taxa de migração.

Ensaio Transwell

As células SK-OV-3 foram semeadas nas câmaras superiores das pastilhas Transwell (a câmara superior contém 200 μL de meio completo a 1%, a câmara inferior contém 1 mL de meio completo a 5%) a uma densidade de 5 × 10³ células por inserção, incubadas a 37 ° C, ambiente umidificado de CO₂ a 5% por 24 h antes de uma análise mais aprofundada. Após incubação por 24 h, as inserções foram removidas e lavadas 3x com PBS, seguidas de fixação em paraformaldeído a 4% (PFA) por 15 min. Após a lavagem com PBS, as células foram coradas com uma solução de cristal violeta a 1%. Após a coloração, as células foram enxaguadas com PBS e observadas ao microscópio invertido.
NOTA: O cristal violeta é uma mancha biológica e pode ser prejudicial se ingerido ou em contato com a pele. Deve ser manuseado com cuidado e os resíduos devem ser descartados adequadamente de acordo com os regulamentos locais.

Ensaio repórter de luciferase dupla

As células transfectadas são incubadas em condições de cultura padrão (37 °C, ambiente umidificado com 5% de CO₂) por 48 h antes da lise. Após 48 h de incubação, as células foram lisadas e centrifugadas a 5.000 × g por 5 min a 4 °C. Uma alíquota de 50 μL do sobrenadante foi transferida para uma placa de 96 poços, seguida pela adição sequencial de 100 μL de reagente de luciferase de vaga-lume e 100 μL de reagente de luciferase de Renilla em cada poço. As atividades de luciferase de vaga-lume e Renilla foram medidas usando o Sistema de Ensaio Reporter de Luciferase Dupla em um Luminômetro. A atividade da luciferase de Renilla foi normalizada para a atividade de luciferase de vaga-lume para explicar as variações na eficiência da transfecção.

Ensaio de imunofluorescência

As células SK-OV-3 foram fixadas em PFA a 4% por 15 min em temperatura ambiente e depois lavadas 3x com PBS. Para bloquear a ligação inespecífica, as células foram incubadas com 5% de soro de cabra em PBS por 1 h à temperatura ambiente. Após o bloqueio, as células foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra E-caderina (RRID: AB_2833860), N-caderina (RRID: AB_2837725) e Vimentina (RRID: AB_2835318), cada um diluído a 1:200. No dia seguinte, as células foram lavadas 3x com PBS e incubadas com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo apropriados [IgG-FITC de camundongo (RRID: AB_2843438) e IgG-FITC de coelho (RRID: AB_2843439)] diluídos 1:500 por 1 h a 37 ° C no escuro.
NOTA: O paraformaldeído é tóxico e potencialmente cancerígeno. Deve ser manuseado com cuidado, usando equipamento de proteção individual (EPI) adequado, como luvas e óculos de proteção. Os resíduos que contenham PFA devem ser descartados como resíduos perigosos.

Análise estatística

Para comparações entre dois grupos, foi utilizado o teste t e, para comparações de múltiplos grupos, foi aplicada ANOVA. Os dados são apresentados como média ± DP. A significância estatística foi estabelecida em *p < 0,05, **p < 0,01 e *** p < 0,001. Todos os experimentos foram realizados com três repetições biológicas (n = 3).

Resultados

Capacidades migratórias e invasivas de células SK-OV-3 moduladas por MALAT1

O fluxo de trabalho experimental é descrito na Figura 1. Para investigar o papel de MALAT1 na migração e invasão de células OvCa, modulamos sua expressão em células SK-OV-3. Após o knockdown de MALAT1, a qPCR confirmou supressão significativa dos níveis de MALA...

Discussão

OvCa, o quinto principal câncer ginecológico, continua sendo uma grande preocupação para a saúde da mulher². No entanto, a maioria dos casos é identificada em estágios avançados, o que limita significativamente as opções de tratamento eficazes, resultando em melhora mínima nas taxas de sobrevida global¹². A metástase do câncer se destaca como um dos principais contribuintes para a mortalidade do paciente no EOC¹³. Ev...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,22 μ m Membranas de PVDF	Beyotime	Luta Focal Aproximada 32
Kit de detecção de qRT-PCR de miRNA tudo-em-um	FulenGen	Rolamento QP115
Albumina de soro bovino	Beyotime	ST025
Substrato de quimioluminescência	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Substrato de quimioluminescência	Millipore	WBKLS0100
Kit de ensaio genético repórter de luciferase dupla	hora de começar	RG027
Soro fetal bovino	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
IgG anti-rato de cabra FITC	Afinidade	S0007
IgG anti-coelho para cabras FITC	Afinidade	S0008
Lipofectamina 2500	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	SJ-LIP-2500
Lentivírus de interferência MALAT1	Fornecedor verificado - SHANGHAI GENECHEM, Ltd.	LV-MALAT1-sh
Lentivírus de superexpressão de MALAT1	Fornecedor verificado - SHANGHAI GENECHEM, Ltd.	LV-MALAT1-OE
5A de McCoy	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305
miR-200c-3p imitação	Fornecedor verificado - SHANGHAI GENECHEM, Ltd.	mic-tem-200c-3p
Analisador de imunoensaio enzimático multifuncional	Perkin Elmer	Visão 2100
Solução de penicilina-estreptomicina	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002
Coquetel de inibidores de fosfatase	GSbioth	GS1439A
Anticorpo primário E-caderina	Afinidade	BF0219
Anticorpo primário N-caderina	Afinidade	AF5239
Anticorpo primário Vimentina	Afinidade	AF7013
Mix principal PrimeScript RT	Takara	RR036A
Sistema de detecção de PCR em tempo real	Bio-Rad	CFX96
Centrífuga Refrigerada	Eppendorf	5810R
Tampão de lise RIPA	GSbioth	GS504A
Géis de poliacrilamida SDS	Beyotime	Pág. 0012A
Anticorpo secundário Goat Anti-Mouse IgG FITC	Afinidade	S0007
Anticorpo secundário Cabra Anti-Coelho IgG FITC	Afinidade	S0008
SNAI2 siRNA	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	si-tem-caracol2
Banco de dados StarBase	Universidade Sun Yat-sen	http://starbase.sysu.edu.cn
O kit de ensaio BCA	Dingguo Biotech	BCA02
A incubadora de cultura de células	Heraeus	Célula Hera 150
O sistema de análise de imagem	Bio-Rad	GEL DOC 1000
O microscópio invertido	Mshot	MI152-N
O kit de extração de RNA	ECOTOP	EK-1328-50T
Reagente de TRIzol	Guangzhou Yingxin Biotechnology Co., Ltd.	T751379
Fonte de alimentação universal para eletroforese	WixScientific	WIX-EP600