Artigo de método

Melhorando o bem-estar dos gerbos por meio do treinamento de reforço positivo em ambientes de pesquisa

DOI:

10.3791/68657

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15 de agosto de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Animal Research Center, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O treinamento com clicker serve como uma técnica de reforço positivo para gerbos de laboratório. Este método visa reduzir o estresse e melhorar a eficiência do manejo por meio de reforço positivo, contribuindo assim para o bem-estar dos animais experimentais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melhorar o bem-estar dos animais de laboratório, minimizando o estresse e promovendo o manejo adequado à espécie, é um objetivo central da pesquisa biomédica contemporânea em todo o mundo. O treinamento com clicker, uma forma amplamente reconhecida de treinamento de reforço positivo, usa um som de clique como um reforçador condicionado para unir o comportamento desejado e a recompensa, permitindo que os animais aprendam mais rapidamente e com estresse reduzido. Nosso grupo de pesquisa demonstrou anteriormente que o treinamento com clicker funciona como uma forma de enriquecimento cognitivo em camundongos e ratos. No presente estudo, adaptamos com sucesso essa abordagem de treinamento para gerbos mongóis (Meriones unguiculatus), adaptando o protocolo às características comportamentais específicas da espécie dos gerbos. Uma coorte de 43 gerbos endogâmicos (27 fêmeas e 16 machos) foi submetida a um protocolo padronizado de treinamento com clicker de 10 dias, durante o qual aprenderam a se aproximar e interagir voluntariamente com a mão do experimentador em troca de uma recompensa alimentar. Após o período de treinamento, os animais foram submetidos a avaliações comportamentais, incluindo um Teste de Campo Aberto e um teste padronizado de interação humana, para avaliar os efeitos do treinamento no comportamento exploratório e na interação humano-animal. Nossos resultados demonstram que a implementação do treinamento com clicker em gerbos é rápida, eficiente e bem tolerada. Animais treinados, particularmente fêmeas, mostraram maior interação voluntária com a mão do experimentador e reduziram comportamentos semelhantes à ansiedade. Esses resultados sugerem que os protocolos de treinamento com clicker adaptados à espécie podem facilitar o desenvolvimento da confiança entre o experimentador e o animal, diminuindo o estresse e melhorando o bem-estar animal e a confiabilidade dos resultados experimentais.

Introdução

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Refinar o uso de animais na pesquisa biomédica para reduzir o estresse e melhorar o bem-estar é um objetivo internacional amplamente reconhecido 1,2,3. Em 2022, a Comissão Europeia informou que dos 838.539 animais utilizados na União Europeia (Alures), 3.440 eram gerbos4. Na Alemanha, aproximadamente 1,46 milhão de vertebrados e cefalópodes foram usados em experimentos com animais em 2023 sob a Seção 7 (2) da Lei de Bem-Estar Animal (TierSchG)5. Combinado com animais mortos para fins científicos, o número total de animais de laboratório usados na Alemanha em 2023 atingiu aproximadamente 2,1 milhões6. Esses números destacam a relevância do uso de gerbos em pesquisas biomédicas, enfatizando a necessidade de melhorias contínuas nos protocolos para o bem-estar animal.

As necessidades comportamentais dos animais de laboratório e a importância de estratégias de manejo que apoiem o bem-estar específico da espécie têm sido amplamente reconhecidas como essenciais para a prática ética e científica7. As interações humano-animal na criação são frequentemente limitadas à tarefa essencial de transferir animais de gaiolas sujas para limpas, sem promover um vínculo entre o condutor e o animal. Essa falta de interação social pode levar ao estresse, que afeta negativamente o comportamento e a fisiologia animal, influenciando os resultados experimentais8. O manuseio inadequado é uma fonte bem conhecida de variabilidade nos dados de pesquisa9. Por exemplo, levantar camundongos pela cauda aumenta a ansiedade e o estresse, enquanto os métodos de túnel ou mão aberta promovem uma abordagem voluntária e reduzem o comportamento semelhante à ansiedade10,11. O manuseio é até mesmo usado como um estressor agudo padronizado em estudos com pequenos mamíferos devido aos seus efeitos consistentes sobre marcadores fisiológicos como os níveis de glicocorticóides12. Essas descobertas destacam o impacto substancial de breves interações humanas e a necessidade de técnicas refinadas de manuseio de baixo estresse13.

O refinamento baseado em treinamento tem ganhado crescente reconhecimento como um método eficaz para melhorar o bem-estar animal e a qualidade da pesquisa10,14. Um dos métodos de treinamento mais eficazes usados na pesquisa com animais é o treinamento com clicker, que geralmente é combinado com recompensas alimentares15,16. Nas últimas décadas, 34 estudos sobre treinamento com clicker foram publicados, refletindo o crescente interesse científico nessa abordagem de treinamento17. Estudos mostram que cães (47%) e cavalos (30%) são os animais de laboratório mais comumente treinados, seguidos por gatos, bovinos, peixes, cabras e macacos (cada 3%)17. Animais treinados podem participar voluntariamente dos procedimentos, reduzindo o estresse e minimizando a necessidade de contenção física18.

Protocolos de reforço positivo também foram aplicados a pequenos mamíferos. Estudos recentes relatam treinamento bem-sucedido em coelhos para procedimentos de criação e gerbos para pesquisa comportamental19,20. Em alguns trabalhos anteriores, mostramos que camundongos treinados com clicker exibiram maior contato com experimentadores e menos indicadores comportamentais associados ao estresse, como micção, defecação, vocalização e comportamento flutuante21 , 22 , 23 . Isso é consistente com as descobertas do campo veterinário, onde o treinamento de pequenos mamíferos - como coelhos, roedores e furões - demonstrou reduzir as respostas ao medo e facilitar o manuseio por meio de técnicas de reforço positivo24. Notavelmente, também observamos uma diferença específica do sexo no desempenho do treinamento: camundongos fêmeas mostraram maior motivação e maior frequência de resposta do que os machos nas sessões de treinamento. Isso sugere que camundongos fêmeas podem se envolver mais prontamente com tarefas de treinamento voluntário sob condições padronizadas21.

Embora promissoras, as abordagens de treinamento existentes para gerbos são tipicamente vinculadas a paradigmas comportamentais específicos e não projetadas para uso geral em rotinas diárias de criação25. Um protocolo padronizado amplamente aplicável para gerbos mongóis (Meriones unguiculatus) - independente de uma configuração experimental específica - ainda não foi estabelecido. Para resolver essa lacuna, o presente estudo teve como objetivo desenvolver e validar um protocolo de treinamento simples com clicker adaptado às características específicas da espécie dos gerbos. O protocolo se concentra na redução do estresse por meio de manuseio suave e envolvimento voluntário com o experimentador. Nossa hipótese é que essa abordagem melhorará o bem-estar animal, estabelecerá linhas de base comportamentais mais consistentes e aumentará a confiabilidade dos resultados experimentais. Devido à sua simplicidade e flexibilidade, pode ser prontamente implementado em uma ampla gama de ambientes laboratoriais.

Para avaliar a eficácia e aplicabilidade do protocolo de treinamento proposto, formulamos as seguintes previsões específicas e testáveis:
Gerbos treinados executariam de forma confiável o comportamento-alvo - sentar-se voluntariamente na mão do experimentador - dentro de um período de treinamento de 10 dias.
Os animais treinados exibiriam maior interação voluntária com o experimentador em um teste padronizado, em comparação com controles não treinados.
Animais treinados exibiriam indicadores comportamentais consistentes com a redução do comportamento semelhante à ansiedade, especificamente passando mais tempo na zona central de um teste de campo aberto.
Os gerbos fêmeas podem mostrar respostas comportamentais mais fortes ao treinamento do que os machos, refletindo potencialmente as diferenças sexuais na adaptação à interação humana.
Essas previsões orientaram o desenho das avaliações comportamentais e informaram os critérios de avaliação do protocolo.

Protocolo

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O manejo dos gerbos e os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais para cuidados com os animais. Aprovado pela licença das autoridades locais G 21-1-100. O protocolo inclui 10 dias de treinamento (segunda a sexta-feira), com intervalos nos finais de semana (sábado e domingo). O protocolo pode ser facilmente adaptado para atender a necessidades específicas. Todos os materiais necessários estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação animal

  1. Obtenha o número necessário de animais no criadouro institucional. Manter os animais em um ciclo claro/escuro de 12 horas em um sistema de alojamento aberto.
  2. Desmame a prole com 5 semanas de idade. Marcar os animais após o desmame e alojá-los em grupos do mesmo sexo de 2-3 indivíduos por gaiola.
  3. Traseira e abriga todos os gerbos em gaiolas Tipo 4 (590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2). Equipe cada gaiola com pelo menos três túneis e mastigue madeira para enriquecimento. Forneça comida e água ad libitum (ver Tabela de Materiais).
  4. Atribua aleatoriamente os animais a grupos treinados (fêmeas: n = 27; machos: n = 16) e não treinados (fêmeas: n = 16; machos: n = 5) para minimizar o viés de seleção e garantir condições basais comparáveis entre os tratamentos. Habitue os animais à recompensa alimentar e à mão do experimentador dentro do ambiente da gaiola de reprodução, conforme descrito na etapa 2.2. do protocolo. No início do treinamento, os animais (fêmeas e machos) tinham aproximadamente 8 semanas de idade.

2. Habituação animal

NOTA: Se os gerbos não foram transportados, o tempo de habituação pode ser reduzido. A visão geral gráfica do protocolo é representada na Figura 1. Em animais criados internamente, o período de habituação para juvenis pode ser drasticamente reduzido se os animais progenitores estiverem bem habituados e a habituação manual for continuada pelo menos uma vez por semana a partir do momento em que os filhotes se tornam móveis. Esta fase preparatória é projetada para reduzir a neofobia e estabelecer uma associação positiva de manipulação de alimentos, garantindo uma transição suave para o treinamento baseado em clicker.

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Figura 1: Visão geral do protocolo de habituação e treinamento para animais de origem externa e criados internamente: Esta figura descreve a linha do tempo e as principais etapas processuais do protocolo de habituação e treinamento usado para gerbos de origem externa e gerbos criados internamente. O protocolo inclui manuseio inicial, habituação alimentar, introdução com clicker e treinamento com clicker, ajustado com base na origem e pré-exposição dos animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Semana 1: Habituação para animais de origem externa
    1. Na chegada, abrigar gerbos em grupos do mesmo sexo de 2 a 3 animais por gaiola. Adicione o material de nidificação e cama da caixa de transporte, juntamente com uma pequena quantidade de pellets de comida familiares para apoiar a aclimatação.
    2. Forneça a cada gaiola pelo menos 3-4 túneis (por exemplo, tubos de papelão ou abrigos de plástico) e encha a cama a uma profundidade de aproximadamente 8-10 cm para permitir o comportamento de escavação típico da espécie.
    3. Evite levantar os gerbos pela cauda, pois isso pode causar estresse e risco de lesões na cauda26. Em vez disso, use o manuseio em concha para transferir suavemente os animais quando necessário (consulte a Figura 2A).
    4. Inicie a habituação alimentar imediatamente, espalhando ~ 5 g de sementes de abóbora ou girassol na cama (consulte a Tabela de Materiais). Isso incentiva a escavação e familiariza os animais com a recompensa.
    5. No dia seguinte, introduza uma mão contendo ~10 sementes de recompensa na gaiola por 2-3 min. Se os animais não pegarem as sementes diretamente, coloque ~ 5 g de sementes na cama.
    6. Repita este procedimento uma vez ao dia até que os animais peguem comida da mão. Isso geralmente leva cerca de uma semana. Se for bem-sucedido antes, prossiga para o treinamento do clicker (consulte a etapa 3).
    7. Durante a habituação, avalie as preferências alimentares oferecendo diferentes tipos de sementes na mão e contando as sementes restantes após 2-3 min.
      NOTA: Forneça comida em pequenas porções apenas como recompensa para reforçar o comportamento desejado. Garantir que a recompensa alimentar esteja em conformidade com as diretrizes nutricionais para animais de laboratório. Embora este protocolo use sementes de abóbora e girassol, outras recompensas adequadas podem ser usadas se atenderem aos requisitos de higiene das instalações. Petiscos comercialmente disponíveis projetados para animais de laboratório também são aceitáveis.
  2. Semana 1: Habituação para animais criados internamente
    1. Comece a habituação à recompensa alimentar diretamente na gaiola de reprodução, colocando ~ 5 g de sementes de abóbora ou girassol na cama, conforme descrito na etapa 2.1.3. Esta etapa deve ser iniciada com o casal reprodutor antes do parto para estabelecer familiaridade com a recompensa.
    2. Uma vez que os animais reprodutores consumam de forma confiável as sementes da cama, ofereça a recompensa da mão do experimentador seguindo o procedimento descrito na etapa 2.1.4. Permita que os animais explorem e receba a recompensa voluntariamente por 2-3 minutos diariamente.
    3. Após o parto da fêmea, suspenda a habituação manual por no mínimo 1 semana. Durante esse período, continue a fornecer recompensas alimentares diretamente na cama da gaiola de 1 a 5 vezes por semana para manter a exposição.
    4. Retome a habituação manual assim que os filhotes se tornarem móveis (aproximadamente no dia 18-21 pós-parto). Permita que os animais explorem a mão com recompensa por 2-3 minutos por sessão. Isso apóia a familiarização precoce da prole com o contexto de treinamento.
    5. Às 5 semanas de idade, desmame os juvenis e agrupá-los em grupos do mesmo sexo de 2-3 animais por gaiola. Continue a habituação colocando a recompensa alimentar na nova cama da gaiola no dia da transferência.
    6. No dia seguinte ao desmame, reintroduza a entrega manual de alimentos conforme descrito acima (etapas 2.1.4 e 2.1.5).
    7. Repita este procedimento uma vez ao dia até que os animais peguem comida da mão.
    8. Uma vez que os juvenis peguem a recompensa consistentemente da mão, prossiga com o protocolo de treinamento (veja a etapa 3). Isso geralmente leva cerca de 1 semana. Se for bem-sucedido antes, prossiga para o treinamento do clicker (consulte a etapa 3).

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Figura 2: Manuseio e habituação de um gerbil usando reforço positivo. (A) Manuseio em concha de um gerbil: Um gerbilo é gentilmente escavado com as duas mãos em forma de concha para minimizar o estresse. (B) Início do treinamento: A mão do experimentador é colocada no chão da gaiola com recompensas de comida na palma da mão. O gerbil recebe uma recompensa e um clique é usado para marcar o comportamento. (C) O gerbilo senta-se voluntariamente na mão do experimentador, indicando treinamento bem-sucedido. A recompensa alimentar é visivelmente colocada na palma da mão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Treinamento com clicker

NOTA: Comece o treinamento apenas se o gerbilo aceitar comida da mão do experimentador. Caso contrário, prolongue a fase de habituação alimentar para além da duração descrita no passo 2.1. ou 2.2.

  1. Visão geral do treinamento
    1. Realize uma sessão de treinamento por gerbil por dia, cada uma com duração de 4 min. Conduza o treinamento diretamente na gaiola doméstica do animal para reduzir o estresse e manter um ambiente familiar. Não é necessário remover todos os itens de enriquecimento, mas garantir que pelo menos um tubo ou túnel permaneça na gaiola e que haja espaço suficiente para a mão do experimentador no chão da gaiola.
      NOTA: Idealmente, o treinamento deve ser realizado em uma sala silenciosa dedicada. Se tal não for viável, pode ser utilizado um armário com proteção acústica no interior do biotério, desde que reduza eficazmente a exposição ao ruído e às perturbações ambientais.
    2. Para evitar que as pistas auditivas se tornem variáveis de confusão, evite estritamente a comunicação verbal ou sons vocais durante as sessões de treinamento. Limite qualquer interação vocal com os animais a períodos fora do contexto de treinamento.
    3. Use a repetição do comportamento-alvo (por exemplo, sentar-se voluntariamente na mão do experimentador) como um indicador prático de habituação e aprendizado bem-sucedidos durante o treinamento. Considere o treinamento bem-sucedido quando esse comportamento for observado pelo menos 5x por sessão durante três dias consecutivos (consulte a etapa 3.4.4).
  2. Preparação para o treinamento
    1. Prepare todos os materiais necessários: corte as sementes de girassol ao meio ou as sementes de abóbora em terços como recompensa. Forneça um clicker de pé, um aplicativo de cronômetro que usa dicas de cores (sem som) ou qualquer outro cronômetro silencioso (digital ou analógico) e uma gaiola secundária limpa (consulte a Tabela de Materiais).
    2. Mova a gaiola doméstica para uma área tranquila e livre de distrações, onde o treinamento ocorrerá para minimizar os estressores ambientais. Evite ruídos repentinos ou altos, como falar, bater a porta ou sons de equipamentos durante a sessão, pois os gerbos são altamente sensíveis a estímulos auditivos.
    3. Remova todos os itens de enriquecimento, exceto um túnel. Certifique-se de que o túnel restante não obstrua o acesso à área de treinamento. Certifique-se de que haja espaço suficiente para acomodar uma mão.
    4. Transfira qualquer animal de companhia para a gaiola secundária limpa, incluindo uma pequena quantidade de cama da gaiola doméstica e enriquecimento para reduzir o estresse durante a separação.
    5. Coloque o clicker do pé (um dispositivo mecânico que produz um som de clique quando pressionado com o pé; consulte Tabela de materiais) abaixo da mesa ou superfície de treinamento. Isso permite que o treinador marque o comportamento desejado sem usar as mãos, garantindo um tempo consistente enquanto mantém as duas mãos disponíveis para interagir com o animal.
  3. Dia de treinamento 1-5: introdução ao clicker
    1. Inicie o cronômetro: toque em Iniciar no aplicativo ou pressione o botão no cronômetro silencioso.
    2. Fique de pé ou sente-se na frente da gaiola. Coloque cinco pedaços da semente selecionada na palma da mão e coloque a mão plana no substrato em um canto da gaiola.
    3. Clique no momento em que o gerbilo pega uma semente da mão (Figura 2B). Se várias sementes forem colhidas em sequência, clique após cada uma. Use o som do clique para associar a recompensa alimentar ao comportamento de alimentação da mão.
    4. Termine o treinamento quando o animal realizar o comportamento desejado 5x ou quando o cronômetro chegar a zero (após 4 min).
    5. A partir do dia 3, dependendo do comportamento do gerbil, comece a oferecer as sementes uma de cada vez. Segure a mão logo acima do chão da gaiola para encorajar o animal a se esticar ou fazer um breve contato com as patas dianteiras (Figura 2C). Isso ajuda a moldar o comportamento gradualmente e prepara o animal para a próxima fase de treinamento (consulte a etapa 3.4).
  4. Dia de treinamento 6-10
    NOTA: Dica de treinamento opcional: Se um gerbilo estiver relutante em subir na mão, divida a tarefa em etapas menores e de construção de confiança. Primeiro, reforce o comportamento de tocar a mão antes de esperar que o animal suba. Use essa estratégia de modelagem para reduzir o estresse e apoiar os animais que precisam de mais tempo para se habituar ao manuseio.
    1. Ofereça apenas uma semente de cada vez. Segure a mão ligeiramente elevada acima do substrato para encorajar o gerbilo a subir totalmente na mão para acessar a recompensa. Esta etapa se baseia no processo de formatação anterior e representa a transição para o comportamento de destino final.
    2. Assim que o gerbilo subir consistentemente na mão, clique para reforçar o comportamento. Comece a oferecer a semente usando sua segunda mão (veja a Figura 3). Mantenha a mão de treinamento acima do chão da gaiola para que o gerbilo suba totalmente nele. Use uma mão para segurar a semente entre o polegar e o indicador (Figura 3A) ou use uma mão para apresentar a recompensa acima da palma da outra mão, na qual o animal é encorajado a subir (Figura 3B).
    3. Avalie o sucesso do treinamento como o gerbilo voluntariamente sentado na mão do experimentador 5x por sessão e aceitando a recompensa da palma da mão ou da segunda mão.
    4. Conclua o treinamento após uma duração máxima de 3 semanas (5 dias por semana) ou quando a meta de treinamento for demonstrada de forma consistente durante um período de 3 dias consecutivos.
      NOTA: Embora o protocolo defina uma fase de treinamento estruturada de até 3 semanas, as sessões de reforço podem ser continuadas além desse período, se necessário, principalmente quando se espera um atraso entre o final do treinamento e o início dos procedimentos experimentais. O reforço positivo contínuo pode ajudar a manter o comportamento aprendido e garantir a confiabilidade ao longo do tempo. Recomendamos continuar o reforço uma vez por semana após a conclusão bem-sucedida da fase de treinamento. No entanto, para garantir consistência e comparabilidade entre os animais, um ponto final de treinamento claro - definido pelo desempenho estável e repetido do comportamento-alvo - deve ser documentado antes da transição para tarefas experimentais.

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Figura 3: Exemplos de posicionamento da mão durante a entrega da recompensa. (A) A recompensa é mantida entre os dedos polegar e indicador da mesma mão, enquanto o animal se senta na palma da mão. (B) A recompensa é segurada com o segundo dedo e o indicador, enquanto o animal se senta na palma da outra mão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Realização de testes comportamentais após o treino (dia 10+)

  1. Teste de interação
    NOTA: Variáveis dependentes: A variável dependente primária é a duração da interação voluntária entre o animal e a mão do experimentador durante o segundo minuto do teste. A interação é definida como contato físico direto, como cheirar, escalar ou tocar a mão com as patas dianteiras10. A pontuação comportamental é baseada em gravações de vídeo e pode ser realizada manualmente ou usando software de análise comportamental.
    1. Posicione uma câmera montada em um tripé acima da mesa onde o teste de interação será realizado.
    2. Se os animais forem alojados em grupos, transfira os animais para uma gaiola secundária limpa contendo um punhado de roupas de cama da gaiola doméstica.
    3. Remova todos os túneis ou abrigos da gaiola doméstica e coloque-os na gaiola limpa. Deixe apenas a roupa de cama na gaiola de teste (= gaiola inicial). Coloque a gaiola doméstica, agora contendo apenas roupas de cama, sob a câmera.
    4. Use o manuseio em forma de concha para retornar suavemente o animal de teste à gaiola de origem.
    5. Comece a gravar. Permaneça imóvel em frente à gaiola por 1 min. Após 1 min, coloque uma mão enluvada dentro da gaiola perto da borda frontal por mais 1 min.
    6. Troque as luvas entre animais de sexos diferentes.
  2. Ensaio em campo aberto
    NOTA: Variáveis dependentes: As variáveis medidas incluem distância total percorrida, tempo gasto na zona central versus periferia, número de entradas no centro e eventos de criação. Esses indicadores refletem a atividade locomotora geral e o comportamento semelhante à ansiedade. O aumento do tempo central é normalmente interpretado como ansiedade reduzida. O comportamento é registrado por vídeo e analisado usando software de rastreamento automatizado (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Posicione uma câmera acima da arena de campo aberto (100 cm x 100 cm x 40 cm).
    2. Inicie a gravação de vídeo e, em seguida, coloque suavemente o animal no centro da arena usando o manuseio em forma de concha. Registre o comportamento por 7 min.
    3. Após o teste, retorne o animal à sua gaiola de origem. Limpe a caixa de campo aberto e as paredes com etanol 70% após cada animal. Espere até que o etanol tenha evaporado completamente antes de colocar o próximo animal na arena.

5. Análise estatística

  1. Embora o cegamento total do experimentador não tenha sido viável durante as sessões de treinamento devido à natureza da interação direta com os animais, realize a análise de dados comportamentais de maneira cega para reduzir o viés do observador.
  2. Tanto para os testes de interação quanto para os testes de campo aberto, grave todas as sessões em vídeo. Colete variáveis dependentes manualmente por observadores treinados (teste de interação) ou automaticamente usando software de análise comportamental (consulte Tabela de Materiais) para registros de campo aberto (tempo gasto na zona central).
  3. Antes da análise estatística, testar todos os dados quanto à distribuição normal usando o teste de Shapiro-Wilk. Identifique valores discrepantes e exclua usando o método ROUT (Regressão Robusta e Remoção de Valores Discrepantes) com uma taxa de descoberta falsa (Q) definida como 10%. Para analisar os efeitos do treinamento e do sexo nos resultados comportamentais, realize uma ANOVA de medidas repetidas de duas vias para o teste de interação e uma ANOVA de duas vias mista para avaliar o tempo gasto no centro do teste de campo aberto.
  4. Categorizar o teste de interação e o tempo acumulado gasto na zona central do campo aberto como as principais variáveis dependentes. Realize comparações post hoc usando o teste de Diferença Significativa Honesta (HSD) de Tukey. Um valor de p de < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas usando software estatístico (ver Tabela de Materiais).

Resultados

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Todos os gerbos treinados aprenderam a tarefa atribuída em 10 dias, demonstrando a viabilidade do treinamento com clicker nesta espécie. A Figura 4 apresenta o sucesso do treinamento de gerbos fêmeas (n = 27) e machos (n = 16) do dia 1 ao dia 10. A ANOVA de medidas repetidas que analisa o desempenho no Dia de Treinamento 1 versus Dia 10 em gerbos machos e fêmeas não revelou efeito de interação significativo entre tempo e sexo (F (1, 41) = 0,003; p = 0,955), indicando que a melhora ao longo do tempo foi semelhante para ambos os sexos. Observou-se um efeito altamente significativo do tempo (F(1, 41) = 38,83, p < 0,0001), mostrando que os gerbos de ambos os sexos cumpriram integralmente o protocolo de treinamento no dia 10.

O fato de gerbos treinados terem cumprido a tarefa atribuída em 10 dias valida a eficácia da metodologia de treinamento com clicker nesta espécie. Essa taxa de sucesso se alinha com os princípios fundamentais do condicionamento operante, onde o clicker funciona como um reforçador secundário que preenche a lacuna entre o comportamento desejado e a recompensa primária (sementes de girassol / abóbora). O clicker serve como uma ponte entre o comportamento e a recompensa, permitindo que o treinador marque o momento exato em que o comportamento desejado ocorre com um tempo preciso. Isso ajuda a criar uma associação clara e imediata entre a ação e sua consequência positiva.

O teste comportamental foi realizado após a conclusão do protocolo de treinamento, especificamente após o 10º dia de treinamento. A análise ANOVA mista bidirecional mostrou que os gerbos treinados aumentaram a interação voluntária com a mão do experimentador (Figura 5A). Um efeito significativo do treinamento foi detectado (F (1, 60) = 22,89; p < 0,0001), com animais treinados se envolvendo com mais frequência com o experimentador. A análise post hoc revelou as diferenças específicas de treinamento em mulheres (p < 0,0001, n = 27) e homens (p = 0,049, n = 16). O efeito sexual não foi observado (F (1, 60) = 0,621, p = 0,434), sugerindo que gerbos machos e fêmeas tiveram desempenho geral semelhante. A análise não revelou interação significativa entre sexo e treinamento (F(1, 60) = 0,078, p = 0,781).

O aumento da interação voluntária dos gerbos indica que o treinamento com clicker reduziu efetivamente as respostas inatas ao medo por meio de reforço positivo. Isso pode ajudar a minimizar o estresse durante o manuseio e os procedimentos experimentais, melhorando o bem-estar animal e a qualidade dos dados.

Uma avaliação do comportamento semelhante à ansiedade pós-treinamento foi realizada usando o Teste de Campo Aberto. A Figura 5B ilustra a duração acumulada passada na zona central. Não foi observada interação entre sexo e treinamento na duração acumulada na zona central do Teste de Campo Aberto (F(1, 60) = 0,101, p = 0,751). Além disso, nenhum efeito principal significativo do sexo foi encontrado (F (1, 60) = 0,001, p = 0,969. Observou-se um efeito principal altamente significativo do treinamento (F(1, 60) = 17,26, p < 0,0001; Teste de Tukey HSD: p = 0,003 e p = 0,052 em mulheres e homens, respectivamente), indicando que os gerbos treinados passaram significativamente mais tempo no centro em comparação com os não treinados. Esses resultados refletem as respostas comportamentais medidas após os animais terem completado o período de treinamento de 10 dias.

O OFT explora o conflito natural de abordagem-evitação que os roedores experimentam ao explorar novos ambientes27. Os gerbos podem equilibrar seu impulso inato de explorar com sua tendência natural de evitar espaços abertos potencialmente perigosos. Portanto, o fato de os gerbos treinados terem passado mais tempo na zona central provocadora de ansiedade indica que o treinamento com clicker aumentou sua disposição comportamental geral de exploração, o que pode indicar melhorias no bem-estar geral.

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Figura 4: Validação do treinamento com clicker. Sucesso do treinamento no dia 1 versus dia 10 para indivíduos do sexo masculino e feminino: O sucesso do treinamento foi avaliado em gerbos femininos (barras brancas, n = 27) e machos (barras cinzas, n = 16) no dia 1 e no dia 10 do protocolo de treinamento. Uma ANOVA de medidas repetidas de duas vias revelou um efeito principal significativo do dia de treinamento (p < 0,0001). Comparações múltiplas usando o teste HSD de Tukey mostraram um aumento significativo no sucesso do treinamento do dia 1 ao dia 10 em mulheres (p < 0,0001, n = 27) e homens (p < 0,0001, n = 16). Os dados são apresentados como ± média DP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Avaliação comportamental. (A) Teste de interação: A duração da interação com a mão do experimentador (em s) foi medida em gerbos fêmeas e machos treinados (barras cinzas) e não treinados (barras brancas) após os animais terem completado o período de treinamento de 10 dias. A ANOVA mista de duas vias revelou um efeito principal significativo do treinamento (p < 0,05) e um efeito de interação significativo (p < 0,05). A análise post hoc usando o teste HSD de Tukey mostrou que os camundongos treinados interagiram significativamente mais tempo com a mão do experimentador em comparação com os camundongos não treinados (fêmeas: p < 0,0001, machos: p = 0,0497). Os dados são apresentados como média ± DP. Mulheres treinadas: n= 27; mulheres não treinadas: n = 16; machos treinados: n = 16; Machos não treinados: n = 5. (B) Teste de Campo Aberto: O teste foi realizado após a conclusão do protocolo de treinamento, especificamente após o dia 10 de treinamento. A duração acumulada passada na(s) zona(s) central(is) foi medida em gerbos fêmeas e machos treinados (barras cinzas) e não treinados (barras brancas). Uma ANOVA mista de duas vias foi realizada para analisar os efeitos do treinamento na exploração da zona central. Comparações múltiplas usando o teste HSD de Tukey revelaram que as mulheres treinadas passaram significativamente mais tempo na zona central em comparação com as mulheres não treinadas (p = 0,003). Os dados são apresentados como média ± DP. Mulheres treinadas: n= 27; mulheres não treinadas: n = 16; machos treinados: n = 16; Machos não treinados: n = 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Os resultados mostram a eficácia do protocolo proposto para habituar os gerbos à interação humana em ambientes experimentais. A capacidade de todos os animais treinados de concluir a tarefa desejada em 10 dias destaca a eficiência desse método.

Uma etapa crítica do protocolo é a habituação gradual à mão do experimentador, garantindo que os gerbos associem a interação humana a um estímulo positivo. O uso de recompensas específicas da espécie otimiza ainda mais o processo de treinamento. Modificações, como ajustar a duração das sessões de treinamento ou alterar o tipo de recompensa, podem adaptar ainda mais o protocolo às diferenças individuais entre os gerbos e otimizá-lo para os requisitos específicos do experimento.

Nós nos concentramos nas notáveis diferenças específicas da espécie no comportamento e na dinâmica de aprendizagem entre camundongos e gerbos da Mongólia. Tais diferenças devem ser consideradas na elaboração de protocolos de treinamento. Por exemplo, os camundongos tendem a ser mais neofóbicos e sensíveis ao estresse, muitas vezes exigindo mais tempo para se habituar a novos ambientes e interação humana28. Em contraste, os gerbos exibem maior impulso exploratório e curiosidade social, o que pode facilitar o envolvimento mais rápido com as tarefas de treinamento29. No presente estudo, os gerbos prontamente se aproximaram da mão do experimentador e aprenderam a associar o clicker a uma recompensa em menos sessões do que o normalmente relatado para camundongos21,22. No entanto, os gerbos também mostraram maior variabilidade individual, particularmente nos machos, o que pode refletir estresse específico do sexo ou fatores motivacionais menos pronunciados em modelos de camundongos. Essas distinções destacam a importância de estratégias de treinamento adaptadas à espécie e sugerem que os gerbos podem se beneficiar de sessões mais curtas e focadas na recompensa, com maior ênfase na interação voluntária, enquanto os camundongos podem exigir dessensibilização mais gradual e repetição consistente. Compreender essas diferenças comportamentais e cognitivas é crucial para refinar os protocolos de treinamento e maximizar sua eficácia entre as espécies.

Os gerbos da Mongólia podem se beneficiar substancialmente do treinamento clicker não específico ou generalizado, que se concentra na interação positiva humano-animal e no condicionamento comportamental básico, em vez da preparação para uma configuração experimental específica. Esse treinamento generalizado aumenta a tolerância ao manuseio, reduz os níveis de estresse basal e promove fatores comportamentais de linha de base mais previsíveis que são valiosos em uma ampla gama de contextos experimentais30. O treinamento não específico promove flexibilidade comportamental e interação voluntária consistente com o experimentador, tornando os animais mais adaptáveis a diferentes ambientes, configurações ou paradigmas de teste 16,31,32. Isso é particularmente benéfico em estudos de longo prazo ou experimentos multifásicos, onde os animais são expostos a uma variedade de procedimentos. No presente estudo, embora o treinamento não estivesse diretamente vinculado a um único protocolo de teste, os gerbos mostraram melhor interação com o experimentador e reduziram o comportamento relacionado ao estresse, apoiando a ideia de que a habituação geral por meio de reforço positivo pode melhorar a resiliência experimental geral e o bem-estar animal.

Além do aumento da interação com o experimentador, as fêmeas treinadas passaram significativamente mais tempo na zona central do teste de campo aberto. Esse padrão comportamental é comumente interpretado como uma redução no comportamento semelhante à ansiedade em roedores, particularmente em resposta a ambientes novos ou levemente aversivos33. Esses achados sugerem que o treinamento com clicker pode contribuir para a diminuição dos indicadores comportamentais de ansiedade, aumentando assim a capacidade dos animais de lidar com procedimentos experimentais. Isso apóia a conclusão mais ampla de que os protocolos de habituação baseados em reforço positivo podem melhorar a resiliência ao estresse e a estabilidade comportamental em gerbos de laboratório. Além da redução do estresse, o treinamento com clicker tem implicações mais amplas para os resultados experimentais34. Gerbos treinados demonstraram maior tolerância ao manuseio, o que minimiza as variações fisiológicas induzidas pelo estresse que podem confundir os resultados da pesquisa. Achados semelhantes foram relatados em outras espécies, incluindo coelhos e camundongos de laboratório, onde animais treinados com clicker exibiram maior interação com o experimentador e menos comportamentos relacionados à ansiedade e depressão, como redução da micção, defecação, vocalização e comportamento flutuante19,21.

Esses resultados destacam o potencial do treinamento com clicker para melhorar o bem-estar animal e a consistência dos dados comportamentais, reduzindo a variabilidade nas respostas relacionadas ao estresse. É importante esclarecer que o objetivo deste protocolo não é condicionar os animais a associar procedimentos inerentemente aversivos - como coletas de sangue - a estímulos positivos como o clicker. Em vez disso, o objetivo é reduzir o estresse da linha de base, habituar os animais à interação humana e promover a participação voluntária em tarefas neutras ou levemente desafiadoras. Embora alguns estudos tenham explorado o uso de reforço positivo para preparar animais para procedimentos mais invasivos35, isso requer um processo de dessensibilização cuidadosamente estruturado e está além do escopo do protocolo atual. A aplicação incorreta de dicas de clicker em contextos associados ao desconforto pode, de fato, resultar em associações negativas não intencionais. No entanto, quando aplicadas corretamente, as técnicas de reforço positivo podem ajudar os animais a lidar com procedimentos potencialmente aversivos, aumentando a previsibilidade e permitindo um grau de controle36. Mais estudos são necessários para determinar se os gerbos podem ser treinados de forma confiável para tais contextos, como foi demonstrado com sucesso em outras espécies, como cães e primatas não humanos37,38.

Apesar de seu sucesso, o método tem limitações. Alguns gerbos exigiram períodos de habituação mais longos, indicando variabilidade individual na velocidade de aprendizado. Além disso, o número relativamente baixo de gerbos machos não treinados limita o poder estatístico da análise, dificultando a obtenção de conclusões robustas. Aumentar o tamanho da amostra neste grupo provavelmente melhoraria a confiabilidade e a interpretabilidade dos resultados. Estudos futuros devem explorar possíveis diferenças entre os sexos nas respostas ao estresse e nos mecanismos de aprendizagem.

As implicações mais amplas deste estudo vão além da redução do estresse. A implementação de protocolos de treinamento estruturados como parte da criação padrão pode reduzir a variabilidade causada por respostas fisiológicas induzidas pelo estresse e melhorar a confiabilidade dos resultados experimentais39,40. Isso é especialmente relevante em disciplinas como neurociência ou pesquisa metabólica, onde o estresse é um fator crítico de confusão. Relatórios cuidadosos e padronização dos procedimentos de treinamento são essenciais para evitar efeitos de enriquecimento não intencionais.

No futuro, pesquisas futuras devem explorar cronogramas alternativos de reforço, automação de procedimentos de treinamento e efeitos de longo prazo entre as espécies. Com o aumento do suporte científico, o treinamento com clicker representa uma valiosa estratégia de refinamento que pode melhorar a qualidade dos dados e o bem-estar animal. A padronização dos protocolos de treinamento e manuseio entre os laboratórios pode ajudar a melhorar a reprodutibilidade e apoiar a adoção mais ampla de práticas humanas e eficazes na pesquisa biomédica.

Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa Translacional em Animais do Centro Médico Universitário da Universidade Johannes Gutenberg de Mainz.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
GaiolasZoonlab GmbH3010006590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
CâmeraSonyHDR-CX240EGravador de câmera de vídeo digital HD Pellets
de alimentosSsniffV1644-000Art. Nr. I-Clicker-Blau
Foot Clickerhttps://www.hundeschulen.com
GraphPad PrismGraphPad Software, Inchttps://www.graphpad.com/featuresVersão 10 para janelas
Campo aberto CaixaNoldusMXO1S-M001opala 100 x 100 x 40 cm
Sementes de abóboraREWE8820911REWE Bio
Pylon viewerBaslerhttps://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Sementes de girassolSeeberger4744292
TripéManfrottoGT- mkbfra4gtxp bhBefree
GT TúneisPlexx14179152 x 76 x 3 mm

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