Desenvolvimento, caracterização e avaliação de sistemas líquidos iônicos baseados em CAGE para administração transdérmica

Resumo

Este protocolo discute a padronização para a preparação de sistemas líquidos iônicos baseados em CAGE para garantir a reprodutibilidade e agilizar o fluxo de trabalho geral em diferentes laboratórios científicos.

Resumo

Os líquidos iônicos ganharam recentemente um reconhecimento notável por suas aplicações na administração de medicamentos, em particular seu potencial para permitir a penetração cutânea de medicamentos e aumentar a permeação de medicamentos. Além de aumentar a permeabilidade da barreira, os líquidos iônicos têm excelentes propriedades de solvatação, enfrentando o desafio de dissolver medicamentos pouco solúveis. Devido à grande assimetria entre os cátions orgânicos e ânions, esses sais funcionais permanecem líquidos à temperatura ambiente. Do ponto de vista da aplicação, os líquidos iônicos fornecem uma abordagem promissora e altamente ajustável para atender a várias áreas terapêuticas. Um líquido iônico biocompatível composto de colina e ácido gerânico (CAGE), em uma proporção de íons estequiométricos de 1:2, possui imenso potencial para entrega transdérmica de uma ampla gama de ingredientes farmacêuticos ativos, incluindo pequenas moléculas, peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos. Isso tem um impacto mínimo na função de barreira da pele. Aqui, compartilhamos nossos métodos para a preparação, caracterização e avaliação do CAGE. Resultados representativos são mostrados para caracterização de CAGE usando espectroscopia de RMN, calorimetria exploratória diferencial, titulação de Karl-Fischer para análise de teor de água e estudos de interação de barreira ex vivo em pele suína.

Introdução

A pele é o maior e mais vital órgão do corpo, servindo como uma barreira protetora contra substâncias nocivas e, ao mesmo tempo, evitando a perda de água¹. Ao mesmo tempo, a aplicação de medicamentos na pele e através dela oferece uma ampla gama de vantagens. Em comparação com os injetáveis e a administração oral, a administração cutânea aumenta a adesão do paciente e evita o metabolismo de primeira passagem no fígado². Especialmente para doenças da pele, as formulações administradas por via cutânea primam por proporcionar um efeito localizado, diminuindo a exposição sistêmica³. No entanto, a natureza quase impermeável da pele desafia significativamente o sucesso do parto cutâneo⁴. A pele humana consiste em três camadas diferentes: epiderme, derme e^hipoderme4. A epiderme é a camada externa da pele e pode ser dividida em diferentes subcamadas, sendo o estrato córneo a camada mais externa, composta principalmente por queratinócitos. O estrato córneo atua como uma barreira de permeação proeminente para a maioria das moléculas, inibindo seu transporte para as camadas mais profundas da pele⁵. Essa função de barreira surge da presença de corneócitos embutidos em um arranjo lipídico compactado, compreendendo principalmente fosfolipídios, esteróis e ceramidas, muitas vezes chamados de estrutura de tijolo e argamassa⁶. Para superar essa barreira cutânea, intensificadores de permeação química (CPEs) foram implantados para fornecer macromoléculas, pois interrompem a estrutura do estrato córneo interagindo com os lipídios e proteínas presentes nele⁷.

Os líquidos iônicos (ILs) surgiram como os CPEs da próxima geração⁸. Estes consistem em cátions e ânions orgânicos volumosos, dispostos de maneira assimétrica e coordenados por interações iônicas fracas e não direcionais⁹. Devido a essas forças intermoleculares fracas, os ILs existem como líquidos abaixo de 100 ° C e são incapazes de se compactar em uma estrutura cristalina bem definida¹⁰ . Os ILs são altamente sintonizáveis, pois sua eficácia é altamente dependente da escolha de cátions ou ânions e da razão estequiométrica entre esses íons. Assim, apresentam alta capacidade solubilizante e estabilizadora para fármacos com hidrofobicidades variadas¹¹. Os ILs atendem às propriedades únicas de lipídios e polímeros, fornecendo liberação sustentada e encapsulamento de macromoléculas, respectivamente¹².

Os ILs biocompatíveis à base de colina e ácido gerânico (CAGE), presentes em uma razão molar estequiométrica de 1:2, têm aplicações significativas na entrega transdérmica de compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. Foi relatado que o CAGE aumenta significativamente a entrega transdérmica de proteínas (insulina¹³) e ácidos nucléicos (siRNA¹⁴). O CAGE é preparado por reação de metátese salina entre bicarbonato de colina e ácido gerânico, com CO₂ como subproduto¹⁵. A reação de metátese salina oferece a formação de novos compostos por troca iônica sob condições amenas de maneira direta, rápida e altamente seletiva. Em geral, há uma falta de fluxos de trabalho fáceis de seguir para o desenvolvimento e avaliação do CAGE IL. Assim, aqui fornecemos um desses fluxos de trabalho, detalhando cada estágio da preparação do CAGE para permitir que pesquisadores de diferentes origens entrem neste espaço de pesquisa.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com a Diretiva da União Europeia 2010/63 e foram aprovados pela Administração Veterinária e Alimentar Dinamarquesa (Licença nº. DK-13-oth-931833).

1. Preparação de CAGE por reação de metátese de sal

1. Recristalização do ácido gerânico (85% de pureza, peso mol 168,23 g/mol)
   1. Pegue um balão de fundo redondo de 500 mL e meça seu peso.
   2. Pesar 40,0 g de ácido gerânico no balão. Isso corresponde a 0,2 mol de ácido gerânico.
   3. Recristalize o ácido gerânico em um ácido gerânico 70:30% (p / p): acetona: Adicione (40 g * 0,85 * 0,30) / (0,70 * 0,784 g / mL) = 18,42 mL de acetona ao frasco inferior redondo.
   4. Pegue um copo de 5 L e prepare cerca de 0,5 L de gelo seco e etanol.
   5. Colocar o balão de fundo redondo na mistura fria de gelo seco e etanol, sem agitar para permitir o arrefecimento externo. Decantar acetona e impurezas do ácido gerânico sólido/recristalizado quando a cristalização atingir o equilíbrio (correspondendo a aproximadamente o volume da acetona adicionada, normalmente dentro de 0,5-2 horas). Repita esta etapa 5 a 6 vezes para garantir pureza suficiente.
   6. Remover a acetona restante por evaporação rotativa sob vácuo a 40 rpm durante, pelo menos, 20 min ou até que o balão de fundo redondo deixe de estar frio ao tocá-lo (a acetona tem uma pressão de vapor de 240 mbar a 20 °C).
   7. Pesar e anotar a massa do balão e do ácido gerânico recristalizado. Calcular o rendimento com base no peso inicial do balão vazio. A faixa de rendimento esperada é de 60-80%.
2. Reação de metátese de sal
   1. Para uma proporção molar de 2:1 de ácido gerânico:colina, calcule o número de moles de colina, levando em consideração o rendimento da recristalização do ácido gerânico. Por exemplo, com um rendimento de 70%, 0,07 mol de colina deve ser adicionado (0,2 * 70/100 = 0,14, 0,14 / 2 = 0,07).
   2. O bicarbonato de colina tem 80% de pureza e um peso molecular de 165,19 g/mol. Assim, adicione 14,45 g (0,07 * 165,19 = 11,56 g; 100/80 * 11,56 g = 14,45 g) de bicarbonato de colina gota a gota para evitar transbordamento.
   3. Agitar a amostra durante a noite a uma velocidade de 300 rpm (ou adequada) à temperatura ambiente (18 ± 3 h) ou até cessar a evaporação do CO₂ .
   4. Secar a amostra por evaporação rotativa a 60 °C, 30 mbar durante 40 min. Primeiro, aumente a temperatura e, em seguida, reduza lentamente a pressão para evitar a formação de espuma.
   5. Alíquota CAGE em frascos de vidro em volumes apropriados para a aplicação pretendida (por exemplo, 2 mL de CAGE em frascos de vidro de 4 mL).
   6. Seque os frascos para injetáveis sob vácuo a 60 °C durante 48 h.

2. Caracterização do CAGE

1. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)
   1. Dissolver o CAGE até uma concentração de 25 mg/ml em dimetilsulfóxido deuterado (d-DMSO), assegurando um volume final de pelo menos 500 μL.
      NOTA: Solventes deuterados são essenciais na RMN para evitar a interferência de átomos de hidrogênio no solvente.
   2. Transfira 500 μL da solução preparada para um tubo de RMN limpo e seco (normalmente 5 mm de diâmetro, dependendo do instrumento). Sele o tubo com uma tampa para evitar evaporação e contaminação.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar, pois elas podem afetar a homogeneidade do campo magnético.
   3. Utilizar um espectrómetro de RMN (por exemplo, 400 MHz) com os seguintes parâmetros:
      -Número de varreduras: 8-16 para ¹H RMN; 1.000-5.000 para ^{RMN de 13}C (dependendo da concentração e da relação sinal-ruído (S/N) desejada.
      -Atraso de relaxamento (D1): 1-2 s para ¹H e ¹³C RMN.
   4. Processe os dados usando o software apropriado.
      1. Ajuste para formas de pico ideais por meio de correção de fase e linha de base.
         NOTA: Isso normalmente é realizado no software de RMN na guia Processamento ou Correção (dependendo do software usado), onde estão disponíveis ferramentas automáticas para ajuste de fase e correção de linha de base.
      2. Use o pico de solvente residual (d-DMSO) como referência: ~ aproximadamente 2,50 ppm para ¹H, ~ aproximadamente 39,52 ppm para ^{RMN de 13}C. Veja Fulmer et ^al.15para referências de impurezas.
   5. Integre os picos e atribua-os aos prótons na estrutura (veja a Figura 1).
2. Teor de água determinado pela titulação Karl Fischer
   1. Dissolver 300 mg de CAGE em 300 μL de metanol. Coloque em uma seringa de 1 mL e pese antes e depois da injeção.
   2. Determine o teor de água usando um titulador Karl Fischer coulométrico de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Injete a amostra na célula de titulação através do septo usando uma seringa, insira o peso da seringa vazia e pressione Enter. O resultado aparecerá como % p/p.
      2. Ajuste o teor de água do metanol para obter o teor real de água no CAGE (normalmente 1–2% p/p). (_Amostra W =_{amostra W + diluente} * (_amostra m +_diluente m) - (_diluente W *_diluente m) /_amostra m).
3. Estabilidade térmica do CAGE por Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
   1. Coloque 3-5 mg de cada amostra em panelas de alumínio Tzero e feche com uma tampa hermética.
   2. Analise as amostras usando um DSC na faixa de temperatura de 80 °C a - 80 °C com um período isotérmico de 10 min antes de resfriar a - 80 °C.
   3. Use uma taxa constante de aquecimento/resfriamento de 5 °C/min e uma purga de nitrogênio de 50 mL/min.
   4. Processe os dados usando o software apropriado.

3. Avaliação ex vivo da interação da barreira cutânea

1. Processamento de dermátomos de pele suína
   1. Corte o poliestireno expandido (EPS) para caber na lâmina do dermátomo e envolva-o com fita adesiva. Utilize a pele coletada da região do lombo dos porcos usando um bisturi. Aqui, a pele foi obtida de porcas dinamarquesas Landrace ou Yorkshire fêmeas de 3,5 meses de idade (30-40 kg).
   2. Remova o músculo e o tecido adiposo. Para facilitar a dermatologia do tecido, é importante garantir um lado plano e ainda mais basolateral.
   3. Remova o máximo de pelos possível da pele usando um aparador de pelos.
   4. Enxágue a pele com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) para remover sangue e cabelos soltos.
   5. Corte a pele em pedaços menores (5 cm x 15 cm) usando uma faca para encaixar os blocos de EPS.
   6. Prenda a pele ao bloco de EPS com agulhas.
   7. Defina o dermátomo para 0,5 mm de espessura e corte a pele.
   8. Armazene a pele dermatomed entre duas camadas de fita adesiva e armazene a -70 °C.
2. Perda de água transepidérmica (TEWL)
   1. Prepare o PBS (pH 7,4) dissolvendo 1 comprimido em 200 mL de água ultrapura. Desgaseifique por 20 min em banho ultrassônico.
   2. Ligue o banho-maria conectado às células de difusão de Franz. Adicione aproximadamente 12 mL de PBS desgaseificado e um grânulo magnético a cada célula. Ligue a agitação magnética (por exemplo, a 600 RPM) garantindo uma distribuição uniforme no meio receptor sem criar turbulência. Observe que nem todas as configurações de células de Franz permitem um controle preciso da velocidade de agitação. Regular a fonte de aquecimento para atingir uma temperatura de 37 °C no meio recetor.
   3. Corte a pele dermatomed em pedaços com um diâmetro de aproximadamente 3 cm (ou tamanho apropriado) usando um bisturi e monte cuidadosamente a pele dermatomed nas células de difusão de Franz usando grampos e anéis de vedação, com o estrato córneo voltado para cima.
   4. Em seguida, encha as câmaras receptoras completamente com PBS usando uma pipeta Pasteur de vidro, certificando-se de que estejam cheias até a marca que indica o volume conhecido do meio receptor. Remova as bolhas de ar invertendo cuidadosamente as células. Hidratar por 30 min.
   5. Ligue o dispositivo TEWL e equilibre por 20 min até estabilizar de acordo com as orientações do fabricante.
   6. Coloque a sonda TEWL em cada célula Franz e pressione Iniciar no software. Segure-o até que uma leitura seja exibida.
   7. Adicione 300 μL de amostra em cima da pele (em triplicatas, n = 3) e oclua colocando fita de enxerto em cima da célula de Franz. Incubar durante 24 h a 37 °C (temperatura do meio recetor).
   8. Remova a amostra limpando o tecido com lenços sem fiapos. Deixe por 30 min.
   9. Meça o TEWL para cada célula para examinar o efeito das amostras na barreira da pele. Calcule os valores de TEWL em relação aos valores de pré-exposição e ajuste em relação ao controle PBS (TEWL relativo = (TEWL pós-TEWL-pré/TEWL_pré)/(TEWL(PBS)pós-TEWL(PBS_)pré/TEWL(_PBS)pré))*100.

Resultados

Espectros de RMN
O objetivo desta técnica é confirmar a formação bem-sucedida de CAGE analisando os ambientes químicos de átomos de hidrogênio e carbono usando espectroscopia de RMN de ¹H e ¹³C. Os espectros resultantes fornecem mudanças químicas características, padrões de divisão e valores de integração que refletem a estrutura molecular e a composição do IL sintetizado. O espectro de RMN de prótons na Figura 1 confirma a razão molar de 2:1 do ácid...

Discussão

O método de preparo do CAGE descrito neste trabalho foi adotado da literatura¹⁵. No entanto, é importante reconhecer que o processo de síntese é sensível a vários fatores externos, que podem influenciar as propriedades do produto final. Portanto, uma vez preparado, o sistema CAGE deve ser caracterizado usando técnicas como espectroscopia de RMN para confirmar a formação de CAGE.

Conforme mostrado na Figura 1

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de RMN de 5 mm	Sigma Aldrich	41121705
Acetona	VWR	23L064039
Panelas Tzero de alumínio	TA Instruments	90,16,83,901
Dispositivo de Fluxo Aqua	Sistemas Biox
Bruker Avance III RMN	Bruker		Instrumento para espectroscopia de RMN
Bicarbonato de colina	Sigma Aldrich	C7519
Dermatoma	Zimmer Biomet
Calorímetro de Varredura Diferencial	TA Instruments
Etanol	VWR	23J314009
Poliestireno expandido	Isopor
Células de Difusão Franz	PermeGear
Ácido Gerânico	Sigma Aldrich	427764
Fita de enxertia	Parafilm
Karl Fischer Titrator	Mettler Toledo	30252662
Metanol	VWR	85681.32
PBS	Fischer Scientific	10388739
Software de análise universal TA 2000	TA Instruments		Software para análise de dados DSC
TopSpin Software	Bruker		Software para análise de dados de RMN