Artigo de método

Aplicação da Optogenética Combinada com o Registro de Fotometria de Fibra na Regulação de Circuitos Neurais-Funções Viscerais por Eletroacupuntura

DOI:

10.3791/68667

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19 de setembro de 2025

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1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O objetivo deste experimento é estabelecer uma nova abordagem para a integração simultânea de optogenética, registro de sinal de cálcio intracerebral e monitoramento da motilidade gástrica, oferecendo um novo paradigma para monitoramento em tempo real da relação entre estimulação somática e interações de função visceral do circuito neural, que é aplicado à pesquisa em acupuntura.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve uma técnica para manipulação optogenética de tipos específicos de neurônios e registro em tempo real dos efeitos da eletroacupuntura em Zusanli (ST36) nos sinais nucleares de cálcio e motilidade gástrica em camundongos sob anestesia in vivo. A exploração dos mecanismos centrais subjacentes à eficácia da acupuntura tem sido limitada por restrições tecnológicas. No entanto, o avanço da tecnologia de imagem optogenética e óptica impulsionou o desenvolvimento da neurociência. O registro de fotometria de fibra, inicialmente aproveitando indicadores de cálcio geneticamente codificados para visualizar mudanças na dinâmica do cálcio indicativas de atividade neuronal, destaca-se como uma tecnologia-chave para caracterizar correlações cérebro-comportamento in vivo. A aplicação da optogenética permite a codificação genética dos neurônios, possibilitando sua ativação ou inibição em resposta à estimulação luminosa. Essa capacidade facilita o estabelecimento de ligações causais entre a função dos circuitos neurais e os resultados comportamentais. A fotometria simultânea de fibras, o registro de cálcio e a estimulação optogenética fornecem um método para registro e manipulação em tempo real da atividade neuronal, servindo como uma abordagem eficaz para investigar os mecanismos centrais da acupuntura. No entanto, ainda há uma escassez de estudos que documentem a utilização simultânea de fotometria de fibra, registro de cálcio, optogenética e monitoramento da função visceral na pesquisa de acupuntura. Os resultados deste experimento mostram que o EA-ST36 pode regular a motilidade gástrica relacionada ao circuito PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT. A estimulação optogenética desse circuito produz o mesmo efeito. Após a superposição dos dois, as alterações no sinal de cálcio e na motilidade gástrica atingem seu máximo. Este estudo estabeleceu uma nova abordagem para a integração simultânea de optogenética, registro de sinal de cálcio intracerebral e monitoramento da motilidade gástrica, oferecendo um novo paradigma para monitoramento em tempo real da relação entre estimulação somática e interações de função visceral do circuito neural.

Introdução

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Nos últimos anos, a proliferação de sensores fluorescentes biomoleculares impulsionou a utilização da fotometria de fibras em biologia molecular, facilitando o registro in vivo 1. Esse avanço permite o monitoramento em tempo real das alterações da atividade neuronal no cérebro. A integração da optogenética permite a manipulação neuronal, oferecendo a vantagem de realizar imediatamente o registro da optogenética e da fibra óptica simplesmente inserindo a fibra óptica. Combinado com o registro da função visceral, este método oferece boa resolução temporal e direcionamento em nível de núcleo para observar como a acupuntura modula as funções viscerais por meio de modificações na atividade neuronal.

Numerosos estudos ilustraram o impacto regulatório distinto da acupuntura na função gastrointestinal 2,3,4, embora os mecanismos centrais precisos permaneçam indefinidos. Muitos livros médicos chineses antigos, como HuangDiNeiJing, também registraram que o ST36 (no lado lateral posterior à articulação do joelho, aproximadamente 2 mm abaixo da fíbula do caput5) é frequentemente usado para tratar doenças gastrointestinais. Estudos recentes mostraram que os núcleos envolvidos em processos fisiológicos gástricos (por exemplo, comportamento alimentar6, cessação da alimentação7, supressão do apetite8) e processos patológicos (por exemplo, dor gástrica9, disfunção gástrica10) abrangem o núcleo parassubtalâmico (PSTn), núcleo dorsal da rafe (DRN), núcleo parabraquial lateral (BPL), núcleo do trato solitário (NTS) e núcleo motor dorsal do vago (DMV). Estudos demonstraram que a eletroacupuntura em ST36 pode aumentar o número de células c-Fos+ no DMV, aumentando assim a expressão de c-Fos+ no subnúcleo caudal do NTS11. Além disso, foi documentado que o núcleo paracentricular (PBN) está envolvido na composição do complexo nuclear paracentricular, pode se projetar até a medula oblonga NTS, que desempenha um papel importante na integração de informações sensoriais viscerais, como sinais gastrointestinais12,13. As informações acima sugerem que a acupuntura poderia potencialmente modular a motilidade gástrica pode estar relacionada ao circuito neural PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT. Os neurônios glutamatérgicos estão envolvidos principalmente no BPL e no NTS14, enquanto os neurônios colinérgicos estão envolvidos principalmente no DMV durante os processos fisiológicos e patológicos gástricos15. Investigar os efeitos regulatórios da acupuntura nos circuitos neurais e nas funções viscerais pode fornecer uma compreensão mais clara dos mecanismos da acupuntura e fornecer suporte teórico para intervenções clínicas de acupuntura em doenças viscerais.

No entanto, devido a limitações técnicas, pesquisas limitadas investigaram os mecanismos dos circuitos neurais da eletroacupuntura na modulação das funções viscerais. Portanto, o presente estudo apresenta diretrizes simplificadas para introduzir o processo detalhado de injeção de vírus. Notavelmente, a metodologia exposta neste artigo pode ser utilizada para elucidar os mecanismos de circuitos implicados na regulação da acupuntura de diversas funções viscerais.

Portanto, este estudo tem como objetivo investigar os efeitos regulatórios da acupuntura na motilidade gástrica, que podem estar relacionados ao circuito neural PBN Glu-NTSGlu-DMV ChAT, combinando optogenética com fotometria de fibra para registro de imagens de cálcio. O objetivo é estabelecer um protocolo para imagens de cálcio e sincronização optogenética, introduzindo uma nova estrutura de pesquisa para investigar a função visceral e os circuitos neurais.

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Protocolo

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Todos os procedimentos seguiram as diretrizes para cuidados e uso de animais de laboratório estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde e receberam aprovação do Comitê de Ética em Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Acupuntura e Moxabustão da Academia Chinesa de Ciências Médicas. Camundongos C57 machos adultos pesando 25 g foram empregados para injeção viral e implante de fibra óptica. O protocolo de experimentação animal seguiu rigorosamente os requisitos da norma nacional "Diretrizes para Revisão Ética do Bem-Estar de Animais de Laboratório" (GB/T 35892-2018) e foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição.

NOTA: Mantenha o ambiente limpo durante o processo de injeção de vírus e implantação de fibra óptica. Use máscaras durante toda a operação. Após o período de alta expressão viral (21-28 dias), a eletroacupuntura no ST36 e as manipulações optogenéticas foram realizadas para registrar a motilidade gástrica. Os animais foram alojados no biotério do Instituto de Acupuntura e Moxabustão, Academia Chinesa de Ciências Médicas, sob condições controladas (temperatura: 22-24 °C, umidade: 50%-60%, ciclo claro-escuro de 12 h), com livre acesso a comida e água. Informações específicas sobre os reagentes e equipamentos utilizados podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Preparo pré-operatório

  1. Desinfete o instrumento cirúrgico que passou por esterilização em alta temperatura e limpe a área cirúrgica com etanol a 70%.
  2. Anestesia: Administre uma injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (0,2 mL / 10 g de peso) ao camundongo. Avalie a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé para medir a profundidade da anestesia.
  3. Raspe o cabelo da cabeça e posicione os ratos em uma estrutura estereotáxica equipada com barras de orelha e dentes. Aplique pomada de eritromicina nos olhos dos camundongos para evitar danos causados pela luz cirúrgica.
  4. Mergulhe a ponteira de fibra óptica (tamanho da ponteira: 1,25 mm de virola branca, tipo de fibra: 200/0,37, comprimento da fibra: 5,5 mm, modelo de agulha de virola: V8475) em etanol a 75% por 30 min e, em seguida, lave o etanol a 70% com solução salina.
  5. Carregue o microinjetor (1 μL) com parafina (800-900 nL). Derreta o tubo de vidro e desenhe-o em duas seções. Afie uma seção na ponta usando uma retificadora de agulhas para servir como agulha de injeção. Para garantir a estanqueidade do microinjetor ao gás, encha o tubo com parafina e conecte-o ao microinjetor na ponta usando uma pistola de cola.

2. Cirurgia de injeção viral

  1. Incise o couro cabeludo ao longo da linha média, dos olhos até a nuca, para revelar o crânio. Posteriormente, excise os músculos do pescoço para expor o osso occipital. Limpe a superfície óssea com H2O2 por 30 s e depois limpe com um cotonete seco para remover a fáscia subcutânea e os tecidos conjuntivos ( Figura 1A ).
    NOTA: Esta etapa é para facilitar a cobertura do cimento dentário no osso occipital, tornando a fixação da fibra óptica de forma mais estável.
  2. Nivele o crânio.
    1. Nivelamento do eixo X: Marque dois pontos que estão a 3,5 mm de distância do ponto Bregema na sutura coronal e conecte os dois pontos para formar uma linha. O ponto médio desta linha é o zero. O valor absoluto da diferença do eixo Z na superfície óssea a 3,5 mm da origem deve ser ≤ 0,03 mm.
    2. Nivelamento do eixo Y: Marque dois pontos que estão a 3,5 mm de distância do ponto Lambda na sutura lambdoide, defina o ponto médio dos dois pontos e conecte esse ponto médio ao ponto Lambda para formar uma linha. O ponto médio desta linha é outro zero. O valor absoluto da diferença do eixo Z entre esse zero e o zero em que a superfície óssea foi ajustada durante o eixo X deve ser ≤ 0,03 mm.
  3. Marque as coordenadas estereotáxicas da injeção de vírus com uma caneta marcadora. Para PBN: -1,1 mm Ântero-Posterior (AP, eixo Y), -5,45 mm Medial-Lateral (ML, eixo X), -3,3 mm Dorsal-Ventral (DV, eixo Z) (com bregma como ponto zero); Para NTS: -0,35 mm AP, 0,2 mm ML, -3,3 mm DV (com o ponto mais alto do osso occipital como ponto zero); Para CPO: -0,35 mm AP, 0,0 mm (ponto mais alto do osso occipital), -3,5 mm VD (com o ponto mais alto do osso occipital como ponto zero) (Figura 1B). Use uma microbroca de alta velocidade (diâmetro da broca de 0,8 mm) para penetrar no crânio nos locais designados para expor a superfície do cérebro. Posteriormente, use uma pinça fina para perfurar suavemente a dura-máter e removê-la, aplique solução salina na abertura perfurada para manter a umidade na superfície do cérebro.
  4. Aplique o adesivo Single Bond Universal na superfície do crânio (excluindo a região perfurada) e exponha-o à luz por 30 s para cura. É importante manter uma superfície seca do crânio antes de aplicar o adesivo universal de ligação única para garantir uma forte adesão. Além disso, o adesivo deve ser evitado nos músculos durante a aplicação.
  5. Fixe o microinjetor no braço mecânico de um aparelho estereotáxico. Encha com 250 nL de vírus (rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA). Ao entrar em contato com a ponta da agulha com a superfície do cérebro, ajuste a profundidade (Z) para 0. Abaixe a agulha até o local alvo dentro do núcleo parabraquial (PBN) e injete o vírus na região PBN a uma taxa de 35 nL / min. Após a injeção, mantenha a agulha no lugar por 10 min e, em seguida, retraia-a a uma velocidade de 6 mm / min. Em seguida, mergulhe a agulha em um tubo Eppendorf contendo solução salina para limpeza (Figura 1C,D).
    NOTA: As doses de injeção de todos os seguintes vírus são 250 nL; O DMV é 100 nL 16,17.
  6. Empregue o protocolo idêntico para injetar rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs no núcleo do trato solitário (NTS) e rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA no núcleo motor dorsal do vago (DMV) (Figura 1D). Todos os títulos de vírus são ≥ 1 × 1012 VG / mL.

3. Cirurgia de implante de fibra óptica

  1. Prenda a ponteira de fibra óptica pelo suporte do optrodo e prenda-a ao braço mecânico do aparelho estereotáxico. Defina as coordenadas de implantação correspondentes a uma posição cerca de 100 μm acima do local da injeção viral do DMV (Figura 1E, F).
  2. Misture 1-3 g de cimento dentário com 1 mL de resina endurecida à temperatura ambiente até ficar uniforme. Administre imediatamente a mistura ao redor da ponteira de fibra óptica e na superfície do crânio, deixando 5 mm da seção superior da ponteira de fibra óptica exposta. Assim que o cimento solidificar, solte o parafuso de suporte, levante e remova o suporte (Figura 1G).
  3. Use suturas cirúrgicas absorvíveis (6-0) para suturar o couro cabeludo occipital posterior de camundongos. Remova os camundongos da estrutura estereotáxica e coloque-os em um ambiente quente para se recuperar da anestesia. Uma vez que os animais exibiram movimento irrestrito, eles foram realocados para uma gaiola limpa e espaçosa para acomodação, com 4-5 camundongos alojados juntos e com livre acesso a comida e água.
    NOTA: Durante o experimento, observou-se que uma gaiola maior é benéfica para o movimento normal dos camundongos e é crucial para manter seu peso. O aumento do espaço também reduz a probabilidade de contato acidental com a fibra implantada, minimizando assim possíveis danos. Camundongos pesando 25 g ou mais mostraram mudanças significativas na pressão intragástrica após a acupuntura.

4. Cirurgia de inserção de balão

  1. No pico da expressão viral (21-28 dias), jejue os camundongos por 4-5 h. Posteriormente, anestesiar os camundongos por meio de injeção intraperitoneal de tribromoetanol a 1,25% (0,1 mL / 10 g de peso). 15 min depois, administre uma injeção intraperitoneal de solução de carbamato de etila a 10% (0,15 mL / 10 g de peso). Avalie a profundidade da anestesia confirmando a ausência de um reflexo de pinça do dedo do pé.
  2. Raspe os pelos das regiões abdominal e ST36. Ligue a almofada de aquecimento e ajuste-a para manter uma temperatura de 37 °C, com o animal mantido na almofada de aquecimento durante toda a cirurgia para garantir uma temperatura corporal constante.
  3. Conecte o balão de látex à seringa e injete ar nele para verificar se o balão de látex (BS4 73-2787) não tem vazamento de ar.
  4. Exponha o estômago e uma porção do duodeno abaixo do processo xifóide. Faça uma pequena incisão no duodeno com aproximadamente 0,3 cm de comprimento, 0,5-1 cm distal ao piloro.
  5. Insira o balão no estômago ao longo da direção intestinal através da incisão duodenal, com o nó posicionado no seio pilórico.
  6. Remova a agulha da seringa, encha 5mL de água pura, descarregue o ar e conecte a outra extremidade do balão com a seringa. Puxe a trava luer da seringa para cima para evacuar o gás do balão e, em seguida, abaixe a trava luer para injetar a água pura no balão. Conecte o conjunto a uma torneira de três vias e um transdutor de pressão.

5. Registro síncrono da pressão intragástrica e imagem de cálcio

  1. Ligue o modelo Neurolog Digitimer, CED Micro1401-4, Inper Studio, sistema de gravação de fibra óptica multicanal, software Inper Signal e software Spike 2. Defina o software Inper, a gravação do sinal de cálcio a ser acionada pelo software Spike2 e pelo estimulador optogenético, garantindo que a estimulação a laser e a aquisição do sinal de cálcio pelo software Inper estejam alinhadas com o registro da pressão intragástrica pelo software Spike2.
  2. Abra todas as torneiras de três vias que se conectam ao balão, gire o botão ZERO no modelo de digitimer Neurolog e observe no software Spike 2 se a linha de base está ajustada para o ponto 0. Depois de equalizar a pressão dentro do balão com a pressão atmosférica, injete água pura no balão até que a pressão intragástrica seja exibida 15-35 cm H2O. Assim que a pressão intragástrica e os sinais de cálcio atingirem um estado estável, registre uma linha de base de 60 s de pressão intragástrica e sinais de cálcio no DMV (Figura 2A).

6. Eletroacupuntura em ST36 e estimulação a laser

  1. Insira uma agulha de acupuntura (0.25 mm × 25 mm) no ponto de acupuntura ST36 esquerdo e conecte-a a um aparelho de eletroacupuntura (10 Hz, 1 mA). Administre eletroacupuntura por 60 s enquanto registra mudanças na pressão intragástrica e nos sinais de cálcio.
  2. Após a estabilização da pressão intragástrica basal e dos sinais de cálcio, forneça estimulação optogenética (635 nm, 5 ms, 5 Hz, 30 mW) através da fibra por 60 s, monitorando as mudanças na pressão intragástrica e nos sinais de cálcio.
  3. Assim que a linha de base da pressão intragástrica e dos sinais de cálcio se estabilizar novamente, combine a eletroacupuntura em ST36 (10 Hz, 1 mA) com estimulação optogenética (635 nm, 5 ms, 5 Hz) por 60 s e registre as alterações na pressão intragástrica e nos sinais de cálcio.

7. Exame histológico da injeção viral e colocação de fibras

  1. Após a conclusão dos protocolos acima mencionados, perfundir os camundongos com solução salina e fixar com paraformaldeído a 4% via coração imediatamente. Colha os cérebros dos ratos. Realize a desidratação gradiente usando soluções de sacarose a 20% e 30% e, em seguida, corte após a incorporação com agente de incorporação de congelamento rápido. Compare as fatias do cérebro com os mapas cerebrais de camundongos para observar se as posições de injeção de vírus e implantação de fibra óptica eram precisas. O posicionamento preciso das injeções virais e implantes de fibras confirmou a validade dos dados de pressão intragástrica e sinal de cálcio (Figura 1H,I).

8. Análise dos dados

  1. Analise os dados do sinal de cálcio usando o software Inper Data Analysis e os dados da motilidade gástrica pelo software Spike2. Compare as diferenças entre os sinais de cálcio ou amplitudes de motilidade gástrica no momento da estimulação (60 s) e antes da estimulação (60 s) para observar os efeitos regulatórios de diferentes estímulos na motilidade gástrica e nos sinais de cálcio. Todos os dados mostrados na Figura 2 são os gráficos de dados originais.

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Resultados

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Os vírus foram injetados no núcleo parabraquial (PBN), núcleo do trato solitário (NTS) e núcleo motor dorsal do vago (DMV) de camundongos, com uma fibra implantada no DMV (Figura 1A-G). Durante o período de pico de expressão viral, variações na pressão intragástrica e sinais de cálcio dentro do DMV foram registradas após eletroacupuntura em ST36 e estimulação optogenética. O objetivo deste estudo é observar os efeitos regulatórios da eletroacupuntura no ST36 e da estimulação...

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Discussão

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A investigação científica central da acupuntura refere-se à regulação dos órgãos-alvo por meio da estimulação do ponto de acupuntura dos nervos autônomos. Os achados sugeridos por Q. Ma sugeriram que a influência da acupuntura na modulação da função de órgãos remotos surge de reflexos autonômicos somáticos que ativam vias simpáticas e/ou parassimpáticas, especialmente aquelas relacionadas a doenças gastrointestinais e inflamação sistêmica18. No entanto, a pesquisa...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 82174518, 82474661), pelos Fundos de Pesquisa Fundamental para os Institutos Centrais de Pesquisa de Bem-Estar Público (ZZ-2023008) e pelo Projeto de Inovação Científica e Tecnológica da Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas (CI2021A03402).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Virus
rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH poliA (AAV2/9)BrainVTAGato#PT-0020
rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREs (AAV2/9)BrainVTAGato#PT-12637
rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyA (AAV2/9)BrainVTAGato#PT-10973
Outro
1 μ L microinjetorHamilton80135
Adesivo Universal de Ligação Única 3M EPSPOficial da Dental World41269
Agulha de acupunturaZhongYanTaiHe0,25/13s
CED Micro1401-4CED (Inglaterra)1401-4
Cimento dentário/resina endurecida à temperatura ambienteYAMAHACHI ODONTOLÓGICAN/A
Fórceps FinoRWDF11028-13
Tubo de vidroInstrumentos de precisão mundiais504949
HANS-200AInstituto HANSHANS-200
Inper Signal (software)InperN/A
Estúdio Inper (Vênus)InperB1502
Balão de látexAparelho HarwardBS4 73-2787
Sistema de gravação de fibra óptica multicanal (Vista Pro)InperR5268
Modelo de digitimer Neurolog DigitimerNL900D
Ferrule de fibra óptica InperV8475
Spike 2 (software)CED (Inglaterra)N/A
Instrumentos estereotáxicos (com calculadora de coordenadas)David Kopf InstrumentosKOPF 942
TribromoetanolSigmaT48402
tribromoetanolSigma T48402

Referências

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