Decodificando o comportamento natural da incorporação neuroetológica

Summary

Este protocolo fornece uma estrutura integrada baseada em métodos neuroetológicos computacionais avançados para entender a codificação cerebral em contextos naturalistas.

Abstract

Os animais se envolvem com seu ambiente natural por meio de uma atividade cerebral rica e dinâmica. Compreender como a dinâmica da população neural codifica o comportamento naturalista continua sendo um desafio fundamental na neurociência de sistemas. Avanços recentes na análise do comportamento baseada em aprendizado profundo e imagens de fluorescência em miniatura abriram novos caminhos para investigar como o cérebro codifica o comportamento natural. Aqui, este estudo apresenta uma estrutura experimental e computacional integrada que combina o Atlas de Comportamento Social (SBeA), Microscopia de Dois Fótons em miniatura (mTPM) e EmBeddings consistentes de gravações de alta dimensão usando variáveis auxiliares (CEBRA) para decodificar comportamentos complexos da dinâmica cerebral. Este estudo usa interações sociais naturalistas entre camundongos que se movem livremente como um sistema modelo, permitindo anotações comportamentais de alta resolução ao lado de imagens neurais simultâneas. Essa estrutura inclui estimativa precisa de pose comportamental, rastreamento sincronizado de mouse duplo, alinhamento de incorporação neural e decodificação de recursos comportamentais diretamente dos componentes principais neurais. Este estudo demonstra que essa abordagem atinge uma precisão de decodificação de 3. ± 1,5 pixels para postura e 89 ± 6% de precisão para decodificação de motivos entre animais, destacando sua robustez e generalização. Este método fornece uma ferramenta poderosa para explorar como a atividade cerebral reflete estados comportamentais estruturados e estabelece as bases para estudos futuros de princípios de codificação neural naturalista.

Introduction

Essa estrutura foi projetada para capturar e decodificar dados comportamentais e de neuroimagem de animais que se movem livremente em ambientes experimentais naturalistas. Ele compreende três componentes principais: métodos de estimativa de pose e classificação de comportamento baseados em aprendizado profundo, SBeA¹, técnicas de imagem de fluorescência em miniatura mTPM² e um algoritmo de incorporação neuroetológica baseado em aprendizado contrastivo, CEBRA³. Estudos recentes têm destacado a complexidade dos processos neuroetológicos em animais que se movem livremente, que supera a observada em paradigmas experimentais com cabeça^fixa4,5. No entanto, as limitações técnicas e a variabilidade têm dificultado a aplicação generalizada dessas abordagens a investigações mais amplas do comportamento natural. Este protocolo apresenta uma estrutura estável e integrada que garante a acessibilidade de dados comportamentais e neurais coletados em contextos naturalísticos para uma ampla gama de laboratórios de pesquisa.

Dado que os animais se movem livremente em ambientes naturais, essa estrutura incorpora estimativa de pose baseada em aprendizado profundo para obter um rastreamento preciso das posturas ^6,7. Os métodos tradicionais de rastreamento baseados em processamento de imagem são insuficientes para capturar movimentos em escala fina, como dinâmica de membros e patas, em comparação com abordagens baseadas em aprendizado profundo⁸. Os comportamentos diversos e complexos exibidos por animais que se movem livremente representam desafios para os métodos de classificação de comportamento supervisionado⁹, pois as categorias comportamentais predefinidas muitas vezes não abrangem toda a gama de fenótipos comportamentais naturais¹⁰. Consequentemente, os métodos de classificação baseados em aprendizado não supervisionado são mais adequados para analisar o comportamento em ambientes naturalistas¹. Eles podem decompor de forma abrangente o comportamento contínuo em motivos discretos de subsegundos de acordo com suas semelhanças estruturais intrínsecas e, em seguida, suas definições consistentes são fornecidas por meio de clusters orientados por dados.

A imagem cerebral em animais que se movem livremente requer a captura da extensa variabilidade da atividade de um único neurônio ^4,5. Os registros eletrofisiológicos em animais que se movem livremente são limitados em sua capacidade de detectar neurônios com atividade predominantemente subliminar¹¹. Além disso, a microscopia de fóton único sofre de baixa resolução e contraste, dificultando a manutenção de identidades neurais consistentes nas sessões de imagem¹². O mTPM oferece resolução e contraste superiores em comparação com a microscopia de fóton único, tornando-se uma ferramenta mais eficaz para investigar a codificação neural de comportamentos naturais 2,13,14,15.

Estabelecer um mapeamento robusto entre dados comportamentais e neurais requer métodos capazes de revelar sua estrutura informacional compartilhada¹⁶. As técnicas convencionais de redução de dimensionalidade, como Análise de Componentes Principais (PCA)¹⁷, Incorporação de Vizinhos Estocásticos Distribuídos em t (t-SNE)¹⁸ e Aproximação e Projeção de Variedades Uniformes (UMAP)¹⁹, não podem incorporar efetivamente dados comportamentais e neurais em um espaço de recursos comum. Em contraste, as abordagens de incorporação baseadas em aprendizado profundo, como o CEBRA, permitem a integração de múltiplas modalidades de dados em estruturas supervisionadas e auto-supervisionadas, gerando representações latentes de alta qualidade³. Embora vários métodos alternativos tenham surgido nos últimos anos 20,21,22, essa estrutura proposta prioriza aplicações práticas, incorporando métodos bem estabelecidos que estão disponíveis comercialmente ou são apoiados por tutoriais abrangentes.

Em comparação com estudos recentes ^4,5, essa estrutura oferece três avanços principais. Primeiro, elimina o viés humano na classificação do comportamento. Estudos anteriores basearam-se na rotulagem de comportamento manual, que é trabalhosa e propensa a inconsistências, principalmente quando os anotadores experimentam fadiga 23,24,25. Em contraste, essa estrutura emprega classificação de comportamento não supervisionado, que preserva a estrutura natural dos padrões comportamentais ao decompor e agrupar objetivamente os motivos de comportamento antes de atribuir definições^26,27. Em segundo lugar, o uso de mTPM permite a captura de dinâmicas neuronais mais intrincadas no nível de um único neurônio. Essa vantagem metodológica expande a aplicabilidade dessa estrutura para decodificar comportamentos naturais complexos de diversas populações neurais, incluindo aquelas envolvidas na codificação subliminar²⁸. Em terceiro lugar, essa estrutura integra dados comportamentais e neurais em um espaço representacional unificado, em vez de empregar UMAP para incorporar cada modalidade separadamente ou usar máquinas de vetores de suporte para impor um mapeamento rígido entre atividade neural e comportamento, desconsiderando sua dinâmica intrínseca ^4,5. Essa abordagem de incorporação conjunta garante uma representação mais abrangente e biologicamente significativa da relação entre comportamento e atividade cerebral.

Essa estrutura é adequada para projetos de pesquisa que envolvem o registro e a decodificação de dados comportamentais e neurais de animais que se movem livremente em condições experimentais naturalistas. Embora a implementação atual seja otimizada para estudos com camundongos, adaptá-la a outros modelos animais pode exigir desenvolvimento adicional. Como os componentes de hardware utilizados nesta estrutura estão disponíveis comercialmente, por um lado, o custo total pode ser relativamente alto. Por outro lado, essa disponibilidade comercial reduz significativamente o tempo gasto na solução de problemas logísticos e garante a aquisição de resultados estáveis e confiáveis de maneira eficiente.

Este protocolo foi projetado para ser reproduzível e acessível a laboratórios de neurociência equipados para imagens de pequenos animais e rastreamento de comportamento. O sistema completo integra um dispositivo mTPM disponível comercialmente com uma configuração de aquisição comportamental multi-ângulo. As gravações neurais típicas são adquiridas a 4,84 Hz com resolução de 512 × 512 pixels, e os dados comportamentais são capturados a 30 quadros por segundo. A sincronização de dados é obtida por meio do alinhamento de pulso TTL durante o pré-processamento. O treinamento e a decodificação podem ser realizados em uma estação de trabalho padrão com uma GPU (por exemplo, NVIDIA RTX 3090 ou equivalente), e o pipeline completo requer aproximadamente 100 GB de armazenamento por experimento. Embora a implementação atual seja otimizada para camundongos que se movem livremente, o design modular do fluxo de trabalho permite a adaptação a outras espécies, ajustando a calibração de rastreamento e os parâmetros de imagem com base no tamanho e mobilidade do animal. Esses detalhes práticos apóiam a adaptabilidade e reprodutibilidade do protocolo em uma variedade de configurações experimentais.

Protocol

O Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Tecnologia Avançada de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências, aprovou todos os procedimentos experimentais e de criação.

1. Estabelecimento da plataforma

NOTA: A plataforma consiste em dois componentes principais: o dispositivo mTPM e o dispositivo de comportamento 3D (Figura 1A). O dispositivo mTPM facilita a sincronização em tempo real de imagens mTPM com dados comportamentais, permitindo assim a aquisição eficiente, estável e contínua de dados de alta qualidade de animais em movimento livre. O dispositivo de comportamento 3D é equipado com quatro câmeras para capturar a cena completa do comportamento animal e um módulo de calibração automática para reconstruir poses de animais em 3D. Ambos os dispositivos são obrigados a incorporar módulos de sincronização em suas respectivas versões.

1. Conexão do dispositivo
   1. Remova o revestimento externo do dispositivo de comportamento 3D. Coloque as partes restantes do dispositivo de comportamento 3D, incluindo quatro câmeras e um módulo de calibração automática, dentro da câmara de gravação comportamental do dispositivo mTPM.
   2. Conecte o cabo USB (Universal Serial Bus) do módulo de sincronização do dispositivo de comportamento 3D à estação de trabalho do dispositivo de comportamento 3D.
   3. Conecte o módulo de sincronização do dispositivo mTPM ao controlador do dispositivo mTPM por meio de um cabo SubMiniature versão A (SMA).
   4. Conecte a porta de saída Transistor-Transistor Logic (TTL) do módulo de sincronização do dispositivo de comportamento 3D à porta de entrada TTL do módulo de sincronização do dispositivo mTPM por meio de um cabo de conversão SMA-Bayonet Neill-Concelman (BNC).
2. Registro de carimbo de data/hora de quadros mTPM
   1. Ligue todas as fontes de alimentação do dispositivo mTPM.
   2. Inicie o software de gravação mTPM e o software de sincronização mTPM.
   3. Defina os caminhos de salvamento de quadros mTPM e carimbos de data/hora de sincronização.
      NOTA: Não use nenhuma das letras e caracteres especiais que não sejam do inglês para nomear caminhos.
   4. Defina o número de quadros de gravação do software de gravação mTPM. O número recomendado de quadros é 6000, o que é suficiente para concluir a etapa de depuração de sincronização.
   5. Selecione todos os canais do software de sincronização mTPM.
   6. Inicie a gravação do mTPM através do software de gravação mTPM. Antes de iniciar a gravação, desligue qualquer uma das luzes dentro da sala para proteger o mTPM de queimaduras leves. O software de sincronização mTPM será executado automaticamente quando o usuário iniciar a gravação.
   7. Verifique se os carimbos de data/hora do quadro mTPM são capturados pelo software de sincronização mTPM.
      NOTA: Os carimbos de data/hora do quadro mTPM mostrados no software de sincronização mTPM são pulsos TTL nítidos. Cada quadro de imagem aciona um pulso TTL nítido, que é de 4,84 Hz por padrão. Se não houver pulso mostrado no painel do software, há 2 problemas normais. A primeira é que o driver do controlador do dispositivo mTPM não suporta captura de carimbo de data/hora. Melhorar sua versão do driver para dar suporte à captura de carimbo de data/hora pode resolver o primeiro problema. O segundo é a má conexão do cabo SMA. Certifique-se de que os conectores SMA estejam bem apertados. Antes de verificar os carimbos de data/hora, volte para 1.1.2 e tente passo a passo.
   8. Aguarde até que a gravação pare. Verifique se o arquivo .tif dos quadros mTPM, um arquivo .tdms e um arquivo .tdms_index dos carimbos de data/hora foram salvos.
3. Gravação de carimbo de data/hora de quatro câmeras do dispositivo de comportamento 3D
   1. Defina o caminho de salvamento dos vídeos e os carimbos de data/hora de comportamento no script de sincronização de câmera personalizado.
      NOTA: O código de sincronização da câmera personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Inicie o software de sincronização mTPM. Defina os caminhos de salvamento dos carimbos de data/hora de sincronização do mTPM.
   3. Inicie a gravação do software de sincronização mTPM. Execute o script de sincronização de câmera personalizado.
   4. Verifique se os carimbos de data/hora de comportamento são capturados pelo software de sincronização mTPM.
      NOTA: Os carimbos de data/hora de comportamento mostrados no software de sincronização mTPM são pulsos TTL nítidos. Um carimbo de data/hora de comportamento é enviado ao software de sincronização mTPM para cada 30 quadros da gravação de quadro de vídeo de comportamento. Os carimbos de data/hora de comportamento também serão salvos na estação de trabalho do dispositivo de comportamento 3D.
   5. Verifique se quatro arquivos .avi de vídeos de comportamento, um arquivo .txt de carimbos de data/hora de comportamento no dispositivo de comportamento 3D e um arquivo .tdms e um arquivo .tdms_index dos carimbos de data/hora de comportamento na estação de trabalho mTPM foram salvos.
4. Calibração da câmera do dispositivo de comportamento 3D
   1. Ajuste o ângulo de disparo de quatro câmeras. As quatro câmeras devem cobrir de forma abrangente toda a base do campo aberto, ao mesmo tempo em que estendem seu campo de visão pelo menos 20 cm acima do limite mais distante do campo aberto para garantir que as instâncias do mouse se levantando sejam totalmente capturadas.
   2. Coloque o módulo de calibração no centro das áreas de disparo. Execute o software de calibração da câmera. Antes de executar o software de calibração da câmera, desligue todas as luzes.
      NOTA: Quatro câmeras capturarão os quadros do quadro de verificação móvel exibido pela tela de calibração. A calibração da câmera é baseada no método de calibração²⁹ de Zhang.
   3. Depois de executar o software de calibração da câmera, um arquivo .mat será salvo, que contém a matriz de projeção da câmera para reconstrução de poses 3D de animais. Como a indexação de dados de comportamento na etapa de sincronização do sistema depende do arquivo .mat de calibração, certifique-se de que a etapa de calibração da câmera seja concluída antes da etapa de sincronização de todo o sistema.
5. Sincronização de todo o sistema
   NOTA: Antes desta etapa, certifique-se de que os carimbos de data/hora dos quadros mTPM e do dispositivo de comportamento 3D possam ser recebidos pelo software de sincronização mTPM separadamente.
   1. Ligue todas as fontes de alimentação do dispositivo mTPM e do dispositivo de comportamento 3D.
   2. Inicie o software de gravação mTPM, o software de sincronização mTPM e o script de sincronização de câmera personalizado.
   3. Defina seu caminho e parâmetros de acordo com a etapa 1.3.1. Inicie a gravação do mTPM através do software de gravação mTPM.
   4. Execute o script de sincronização de câmera personalizado. Certifique-se de que o início da gravação de quadros mTPM esteja antes da execução do script de gravação de comportamento para que o software de sincronização mTPM possa receber os carimbos de data/hora do dispositivo de comportamento 3D. Defina a hora de término da gravação de quadros mTPM como maior do que a hora da gravação do comportamento para que o software de sincronização mTPM possa capturar os carimbos de data/hora do comportamento sem perda.
      NOTA: A recomendação do tempo de gravação de quadros mTPM é superior a 5 min da gravação do comportamento. Por exemplo, se o usuário quiser registrar o comportamento de 15 minutos, o número de quadros mTPM deverá ser definido como 4,84 x (15+5) x 60 = 5808 quadros.
   5. Aguarde a parada da gravação. Após a gravação, há um arquivo de .tif de quadro mTPM, dois arquivos .tdms de sincronização mTPM, dois arquivos .tdms_index, quatro arquivos de .avi de vídeo de comportamento e um arquivo de .txt de carimbo de data/hora de comportamento.
   6. Execute o código de sincronização personalizado para alinhar o quadro mTPM e os vídeos de comportamento. O código de sincronização personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
      1. Antes de executar esse script, organize manualmente os arquivos da seguinte maneira:
         ----\Root path # O caminho para salvar todos os dados
         --------\behavior_all # O caminho para salvar dados de comportamento
         ------------\A-B-C-D-E-caliParas.mat # Arquivo de calibração da câmera
         ------------\A-B-C-D-E-camera-1.avi # vídeo de comportamento da câmera 1
         ------------\A-B-C-D-E-camera-2.avi # vídeo de comportamento da câmera 2
         ------------\A-B-C-D-E-camera-3.avi # vídeo de comportamento da câmera 3
         ------------\A-B-C-D-E-camera-4.avi # vídeo de comportamento da câmera 4
         ------------\A-B-C-D-E-event.txt # carimbo de data/hora do comportamento do dispositivo de comportamento 3D
         ----\tpm_suite2p # O caminho para salvar dados mTPM
         --------\sep # O caminho para salvar quadros mTPM e carimbos de data/hora
         ------------\A-B-C-D-E-EVENT # O caminho para fazer o alinhamento do carimbo de data/hora
         ----------------\beh.tdms # O arquivo .tdms do canal de comportamento
         ----------------\beh.tdms_index #The canal de comportamento .tdms_index arquivo
         ----------------\tpm.tdms # O arquivo .tdms do canal mTPM
         ----------------\tpm.tdms_index # O arquivo de .tdms_index do canal mTPM
         ------------\A-B-C-D-E-tpm # O caminho para salvar quadros mTPM
         ----------------\F.tif # Os quadros mTPM de cada gravação
         --------\process # O caminho para extrair traços neurais
         ------------\C # O caminho de cada mouse
         ----------------\F.tif # Os quadros mTPM de cada mouse
         A a G são definições de campos de nome, onde
         A significa grupos experimentais, por exemplo, livres,
         B significa a sequência de vídeos, por exemplo, seg1,
         C significa a identidade dos animais, por exemplo, 1tpmss,
         D significa os parceiros de interação, por exemplo, 1wt,
         E significa a data experimental, por exemplo, 20220226, e
         F significa o bloco de quadros de gravação mTPM (5000 quadros por bloco), por exemplo, social 1.
         NOTA: A taxa de quadros do sistema de rastreamento comportamental 3D é de 30 Hz, enquanto a do mTPM é de 4,84 Hz. Como a precisão máxima de sincronização alcançável é limitada pela taxa de quadros mais baixa (4,84 Hz), a resolução temporal da sincronização é de aproximadamente 206 ms. Os carimbos de data/hora comportamentais servem como referência e cada quadro mTPM é alinhado ao ponto de tempo comportamental mais próximo. Os intervalos entre quadros mTPM sucessivos em relação à linha do tempo comportamental são interpolados usando uma abordagem passo a passo.

2. Registro de dados neuroetológicos

NOTA: O processo de registro de dados neuroetológicos consiste em quatro etapas principais (Figura 1B).

1. Montagem do mTPM
   NOTA: Como os detalhes da montagem do mTPM estão contidos no tutorial do mTPM, apenas as etapas principais são apresentadas aqui.
   1. Prepare a janela craniana.
      NOTA: A preparação da janela craniana inclui principalmente a injeção do vírus, a implantação da lamínula e a fixação da placa de metal. Como os locais de imagem são diferentes em várias pesquisas, os detalhes da preparação da janela craniana são diferentes. Nesse caso, a preparação da janela craniana é realizada por um serviço de terceirização. A área cerebral de imagem nos dados de exemplo é o córtex somatossensorial primário (S1).
   2. Fixe o limitador do mouse no micromanipulador mTPM. Fixe a cabeça do mouse no limitador através da placa de metal.
   3. Encontre a fluorescência através do mTPM. Desligue todas as luzes antes de ligar a imagem mTPM. Fixe o mTPM no suporte antes das etapas a seguir.
      1. Adicione uma gota de gel para os olhos Carbomer na parte superior da janela craniana. Mova o mouse pela plataforma de movimento quando a janela craniana estiver alinhada abaixo da objetiva mTPM.
      2. Mova o micromanipulador verticalmente para encontrar o plano de imagem. Mova o micromanipulador no plano para centralizar o plano de imagem.
   4. Fixe a base superior ao mTPM. Cole a base inferior na base superior e na janela craniana.
      1. Para garantir a estabilidade estrutural, preencha a lacuna entre as duas bases e o suporte da placa de metal preso à cabeça do mouse e cole-o com um adesivo estrutural acrílico de alto desempenho. Catalise o adesivo por 30 min antes de avaliar a estabilidade da colagem, sondando suavemente a base com uma pinça. Se necessário, é aplicado adesivo adicional até que se obtenha uma fixação segura.
         NOTA: É essencial evitar qualquer adesão direta entre a base e o próprio mTPM. As bases superior e inferior são pequenas molduras de alumínio. A base superior é fabricada sob medida para se ajustar perfeitamente ao contorno inferior da caixa mTPM. Bases inferiores com várias opções de altura são usadas para preencher a lacuna entre a base superior e a janela craniana. Todas as bases inferiores têm as mesmas dimensões planas que a base superior para garantir compatibilidade mecânica, diferindo apenas em altura para corresponder às distâncias variáveis do crânio à base superior.
   5. Adicione uma gota de gel para os olhos de carbômero dentro da câmara de base. Verifique a fluorescência neuronal através de mTPM. Se a fluorescência neuronal não for claramente visível, remova o adesivo usando uma broca craniana, permitindo a separação da base, após o que o procedimento acima é repetido até que a clareza da fluorescência seja alcançada.
   6. Prenda a folha de alumínio com fita adesiva entre a fibra do mTPM e a janela craniana.
      NOTA: Esta etapa é para manter a proteção contra luz adequada durante todo o processo de gravação. O uso de papel alumínio e fita adesiva foi minimizado para reduzir o peso total.
   7. Ligue a luz da sala e teste a clareza dos quadros mTPM.
2. Colocando o mouse em um campo aberto
   NOTA: Esta etapa envolve colocar o mouse em campo aberto, garantindo o equilíbrio de peso adequado para a fibra e o mTPM.
   1. Encha pelo menos 10 balões de hélio e amarre-os separadamente com barbante de algodão. Retire a placa de metal do limitador do mouse.
   2. Segure o mouse pela cauda usando uma mão. Suporta a fibra mTPM usando a outra mão.
   3. Posicione suavemente o mouse em campo aberto. Suspenda os balões de hélio usando barbante de algodão na fibra. Ajuste o número de balões até que o mouse possa se mover livremente e explorar o campo aberto sem restrições.
      NOTA: O número ideal de balões é determinado quando o camundongo permanece no chão, com seus membros anteriores não levantados por flutuabilidade para cima, enquanto ainda contrabalança suficientemente o peso do mTPM para permitir que o animal mantenha uma postura natural da cabeça e fique espontaneamente em pé. O fio de algodão deve ser amarrado a uma altura acima do campo aberto para garantir comprimento de fibra suficiente para movimento irrestrito do mouse. O fio de algodão foi amarrado na altura da fibra óptica, que estava aproximadamente alinhada com a borda superior da câmara de campo aberto. No exemplo dado, uma vez concluída esta etapa, um camundongo não tratado é introduzido no campo aberto para permitir a interação social livre.
   4. Feche a porta do gabinete mTPM para minimizar distúrbios externos.
3. Ativando a gravação mTPM.
   1. Inicie o software de gravação mTPM e o software de sincronização mTPM. Defina seu caminho e parâmetros referentes à etapa de estabelecimento da plataforma.
   2. Inicie a gravação do mTPM através do software de gravação mTPM. Verifique a presença de marcadores de tempo correspondentes a cada quadro de dois fótons no software de sincronização.
   3. Avalie se o contraste das imagens de dois fótons permanece inalterado e confirme se a locomoção do mouse não compromete a estabilidade dos quadros gravados. Se algum problema for detectado, repita o procedimento de sincronização e o processo de montagem mTPM até que a imagem de dois fótons produza quadros claros com marcadores de tempo alinhados com precisão.
4. Ativando a gravação de comportamento
   1. Inicie o script de sincronização de câmera personalizado.
      NOTA: O código de sincronização da câmera personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/camera_code/mul_camera_save_video_event.py.
   2. Defina o caminho e os parâmetros referentes à etapa de estabelecimento da plataforma.
   3. Inicie a gravação do comportamento por meio do script de sincronização de câmera personalizado. Verifique a presença de marcadores de tempo correspondentes a cada 30 quadros de comportamento no software de sincronização mTPM.
   4. Verifique se os quatro fluxos de vídeo das câmeras estão sincronizados corretamente e verifique os parâmetros de captura de vídeo do sistema de rastreamento comportamental 3D.
      NOTA: Na configuração acima, as câmeras usam uma resolução de quadros de 640 × 480 pixels, uma taxa de quadros de 30 quadros por segundo, quadros RGB e exposição automática. A exposição automática permite que a câmera ajuste dinamicamente o brilho com base nas condições de iluminação ambiente. Como o tempo de exposição afeta diretamente a taxa de quadros alcançável, principalmente em condições de pouca luz, onde são necessárias exposições mais longas, a taxa de quadros pode diminuir. Para garantir uma aquisição de quadro estável a 30 Hz, é importante controlar a iluminação de fundo para minimizar o tempo de exposição. As configurações de ganho e binning da câmera são mantidas em seus valores padrão durante toda a gravação.
   5. A gravação comportamental será interrompida automaticamente assim que a duração predefinida for atingida. Depois de concluir a gravação comportamental, desligue manualmente a gravação e a sincronização do mTPM. Seguindo essas etapas, um único teste de aquisição simultânea de dados neurais e comportamentais é concluído.

3. Pré-processamento de dados neuroetológicos

NOTA: Se todas as etapas anteriores forem concluídas com êxito, três categorias de arquivos de dados devem ser obtidas: quadros de imagem de dois fótons (.tif), quatro gravações de vídeo comportamentais (.avi) junto com um arquivo de calibração da câmera (.mat) e dois arquivos de carimbo de data/hora de sincronização (.tdms) para pré-processamento de dados subsequente (Figura 1C). Esses dados devem ser renomeados manualmente e colocados nas pastas referentes à etapa 1.5.7.

1. Pré-processamento de dados mTPM
   1. Extraia trajetórias de sinais neurais de quadros mTPM por meio do suite2p³⁰. Mantenha os parâmetros de suite2p em seus valores padrão para garantir a reprodutibilidade. Ajuste apenas a taxa de quadros para corresponder às configurações de aquisição de mTPM.
      NOTA: Como as etapas subsequentes incluem processamento de sinal e controle de qualidade, não há necessidade de ajustar extensivamente os parâmetros suite2p neste estágio. Manter a consistência entre os conjuntos de dados é de maior importância.
   2. Execute o código personalizado para alinhar os carimbos de data/hora entre os quadros mTPM e os vídeos de comportamento.
      NOTA: Este script alinha os carimbos de data/hora de eventos comportamentais com os tempos de aquisição de mTPM correspondentes. Ele gera e salva mapeamentos de índice para cada gravação, permitindo a análise sincronizada de dados de comportamento e neurais. Este código personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step1_align_tpm_data.m.
   3. Execute o código personalizado para converter o formato de dados da saída suite2p.
      NOTA: Este script extrai e reorganiza dados mTPM para animais individuais, identificando e mapeando índices de quadros relevantes. Ele seleciona os traços de atividade neural correspondentes e os reestrutura em um formato de dados padronizado, permitindo uma análise simplificada de gravações segmentadas. Este código personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step2_separate_tpm_data.m.
   4. Execute o código personalizado para reamostrar sinais neurais para alinhar com quadros de comportamento.
      NOTA: Este script executa a reamostragem temporal de dados mTPM para alinhar rastreamentos de atividade neural com carimbos de data/hora comportamentais. Ele carrega dados neurais previamente segmentados e índices de sincronização, extrai traços reamostrados de acordo e salva a saída em um formato padronizado para processamento adicional de sinais. O método de reamostragem temporal é a interpolação gradual. Este código personalizado está em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step3_resample_tpm_data.m.
   5. Execute o código personalizado para refinar as trajetórias neurais.
      1. Como a interpolação passo a passo pode introduzir artefatos de toque e ruído de alta frequência, projete um filtro passa-baixa equiripple com uma frequência de banda passante de 2 Hz e uma frequência de banda de parada de 2,2 Hz para mitigar esses artefatos. A ordem do filtro é 61.
      2. Depois disso, use o método de redução de ruído de Weijian Zong para refinar os traços de cálcio mTPM reamostrados¹³. Ele estima linhas de base locais usando critérios de percentil e variância local e calcula os sinais ΔF/F. ΔF/F é uma medida adimensional que representa a mudança relativa na intensidade de fluorescência em relação à linha de base, comumente usada para quantificar a atividade neural em imagens de cálcio. Como o numerador (ΔF) e o denominador (F) estão em unidades de fluorescência arbitrárias, o valor ΔF / F resultante não tem unidade física e é expresso como uma razão ou porcentagem. Células com sinais extremamente planos ou saturados são excluídas com base nos limites de alcance do sinal. Os traços de atividade neural de alta qualidade resultantes são salvos para análise downstream ( Figura 2A, Figura 3A e Figura 4A).
         NOTA: O código personalizado está disponível em https://github.com/YNCris/natural_behavior_device/blob/main/preprocess_code/step4_filter_tpm_data.m.
2. Pré-processamento de dados de comportamento
   1. Extraia poses comportamentais de gravações de vídeo usando um rastreador de poses anti-deriva (ADPT)⁷.
      NOTA: O ADPT aborda a questão do desvio de ponto frequente observado em métodos baseados em redes neurais convolucionais, como o DeepLabCut⁶ e o SLEAP²². O ADPT é particularmente adequado para cenários que envolvem dispositivos de gravação neural, como imagens mTPM em animais em movimento livre, pois reduz efetivamente o desvio de ponto causado pelo movimento da fibra. O repositório do ADPT está em https://github.com/tangguoling/ADPT.
      1. Dado que a configuração experimental envolve dois camundongos, com o mTPM servindo como um identificador para um deles, treine dois modelos ADPT independentes de um único mouse para estimar as poses de cada camundongo separadamente.
      2. Para cada modelo, anote manualmente 16 pontos-chave 1,10,15,31 - incluindo nariz, orelha esquerda, orelha direita, pescoço, membros dianteiros esquerdo e direito, membros posteriores esquerdo e direito, patas dianteiras esquerda e direita, patas traseiras esquerda e direita, costas, base da cauda, cauda média e ponta da cauda - para aproximadamente 600 quadros, com 150 quadros rotulados manualmente por câmera view para um vídeo de 15 minutos.
      3. Treine os modelos ADPT usando parâmetros padrão. Os detalhes dos parâmetros de treinamento e previsão estão em https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config.yaml e https://github.com/tangguoling/ADPT/blob/main/code/config_predict.yaml.
   2. Reconstruindo poses de animais em 3D. Uma vez treinados, aplique os dois modelos independentemente para prever as poses de cada mouse a partir de cada um dos vídeos capturados por diferentes câmeras. Mescle os dados resultantes em um único arquivo de tabela para processamento posterior.
   3. Realize uma reconstrução 3D das trajetórias comportamentais usando triangulação em combinação com o arquivo de calibração da câmera³². Após a reconstrução, obtenha as trajetórias de movimento do mouse sujeito (aquele que carrega o mTPM, Figura 2B, Figura 3B, Figura 4B) e do mouse objeto (o coespecífico interativo, Figura 2C, Figura 3C, Figura 4C) para análise subsequente.
   4. Nos estudos de interação social, as distâncias interindividuais servem como indicadores críticos da dinâmica social³³. Calcule as distâncias corporais relativas entre os dois camundongos usando distâncias euclidianas pares entre os pontos corporais correspondentes, fornecendo medidas quantitativas para posterior análise do comportamento social ( Figura 2D, Figura 3D, Figura 4D).
   5. Decomponha e classifique motivos comportamentais.
      NOTA: Embora as etapas anteriores produzam trajetórias de pose refinadas, elas ainda não nos dizem o que o animal está fazendo. O comportamento refere-se a como um animal se move durante um período específico, e atribuir comportamento envolve dar a cada um desses períodos um rótulo significativo e interpretável por humanos. A maneira normal é usar anotações humanas.
      1. Como as gravações comportamentais geralmente são muito longas para serem rotuladas manualmente em sua totalidade, use métodos de aprendizado de máquina.
         NOTA: O aprendizado supervisionado segue regras de rotulagem predefinidas: os anotadores humanos atribuem rótulos a segmentos de comportamento selecionados, que são usados para treinar modelos de aprendizado de máquina ou IA para prever rótulos em todo o conjunto de dados. Embora essa abordagem melhore a eficiência da classificação do comportamento, ela permanece limitada pelo conjunto limitado de rótulos interpretáveis por humanos, uma limitação especialmente significativa ao lidar com comportamentos complexos e naturalistas. Para capturar a rica variabilidade dos comportamentos naturalistas, métodos de classificação de comportamento não supervisionados foram desenvolvidos. Essas abordagens identificam semelhanças intrínsecas entre os motivos comportamentais ao longo do tempo e os agrupam em espaços de características de baixa dimensão, permitindo uma interpretação humana mais eficiente e imparcial. Em essência, a classificação supervisionada depende de rótulos humanos predefinidos para orientar o reconhecimento do comportamento, enquanto a classificação não supervisionada revela estruturas comportamentais latentes sem rotulagem prévia, oferecendo maior flexibilidade na captura de dinâmicas naturalistas complexas.
      2. Dentro da estrutura do comportamento naturalista, identifique os motivos comportamentais dos dois camundongos usando o Atlas do Comportamento (BeA) ¹⁰ e o Atlas do Comportamento Social (SBeA) ¹ ( Figura 2E, Figura 3E, Figura 4E), ambos métodos de agrupamento não supervisionados projetados para segmentação comportamental. Esses métodos decompõem e agrupam o comportamento animal em motivos de subsegundos com base em suas estruturas dinâmicas e hierárquicas intrínsecas³⁴, associando-os posteriormente a categorias comportamentais definidas.
   6. Extraia motivos comportamentais de camundongos individuais usando BeA.
      1. Para reduzir o ruído, aplique um filtro mediano com uma janela de tempo de 500 ms. Realize o alinhamento do corpo usando os pontos-chave da base das costas e da cauda para facilitar a decomposição dos movimentos não locomotores, enquanto os pontos-chave do membro frontal direito, do membro frontal esquerdo, do membro traseiro direito e do membro posterior esquerdo são utilizados para a normalização do tamanho do corpo.
      2. Para a decomposição do comportamento, use 39 coordenadas corporais alinhadas, incluindo: nariz (x, y, z), orelha esquerda (x, y, z), orelha direita (x, y, z), pescoço (x, y, z), membro frontal esquerdo (x, y, z), membro frontal direito (x, y, z), membro posterior esquerdo (x, y, z), membro traseiro direito (x, y, z), pata dianteira esquerda (x, y, Z), pata dianteira direita (X, Y, Z), pata traseira esquerda (X, Y, Z), pata traseira direita (X, Y, Z), traseira (Z) e base da cauda (X, Z).
      3. Defina o índice de redução temporal como 5, com uma resolução de clustering de 3. Use clustering espectral para inicialização, empregando um kernel gaussiano com um sigma de largura de banda de 30. Defina os comprimentos mínimo e máximo de segmentação como 500 ms e 2000 ms, respectivamente.
      4. Para incorporação de motivos de comportamento, aplique UMAP com 30 vizinhos mais próximos e uma distância mínima de 0,05. Agrupe os motivos por meio de agrupamento hierárquico usando a ligação de Ward e a distância euclidiana em pares para melhorar a estabilidade da classificação. O repositório do BeA está em
      5. Identifique motivos comportamentais sociais usando SBeA. Defina os parâmetros de inicialização do SBeA para serem consistentes com os usados no BeA, com as seguintes modificações: o tamanho mediano da janela de filtro é definido como 1000 ms, o comprimento mínimo de segmentação é aumentado para 2000 ms e o comprimento máximo de segmentação é estendido para 5000 ms para decomposição de comportamento social.
      6. Para incorporação de motivos, aplique um kernel gaussiano com um sigma de largura de banda de 2. O número final de grupos de comportamento social varia de 16 (limite inferior) a 280 (limite superior). Nos exemplos apresentados, apenas os 16 maiores clusters são utilizados para fins de demonstração. O repositório do SBeA está em https://github.com/YNCris/SBeA_release/blob/main/README_SBeA_mapper.md.

4. Mapeamento de dados neuroetológicos

1. Prepare conjuntos de dados de mapeamento. Seguindo as preparações acima mencionadas, sete conjuntos de dados estão disponíveis para mapeamento neuroetológico, incluindo atividades neuronais, poses de sujeitos, poses de objetos, distâncias corporais, motivos de comportamento de sujeitos, motivos de comportamento de objetos e motivos de comportamento social. Organize manualmente esses arquivos da seguinte maneira:
   Caminho de dados # O caminho para salvar todos os dados
   ----\A-B-C-D-E-neu.mat # Atividades neuronais
   ----\A-B-C-D-E-pose-tpm.mat # Poses do sujeito
   ----\A-B-C-D-E-pose-free.mat # Poses de objeto
   ----\A-B-C-D-E-rel_dist.mat # Distâncias corporais
   ----\A-B-C-D-E-mov-tpm.mat # Motivos de comportamento do sujeito
   ----\A-B-C-D-E-mov-free.mat # Motivos de comportamento do objeto
   ----\A-B-C-D-E-sbea.mat # Motivos de comportamento social
   As definições dos campos A, B, C, D e E são as mesmas do ponto 1.5.7. Os dados de demonstração para reprodução estão em https://doi.org/10.6084/m9.figshare.29606795.v1.
2. Crie as incorporações do mapeamento usando o CEBRA.
   NOTA: Dado que o CEBRA integra abordagens orientadas por hipóteses e descobertas para construir incorporações, ele é adequado para descobrir representações neurais associadas a várias variáveis auxiliares (Figura 5A).
   1. Para garantir uma comparação sistemática de incorporações em diferentes modalidades, padronize os parâmetros dos modelos CEBRA. A arquitetura do modelo emprega os 10 deslocamentos, com um tamanho de lote de 1024, uma taxa de aprendizado de 0,0001 e um parâmetro de temperatura de 1.
   2. Defina a dimensão de saída como 3 e realize o treinamento para um máximo de 15.000 iterações. Use a distância do cosseno como métrica de similaridade, enquanto a variável condicional é definida como o delta de tempo com um deslocamento de tempo de 10. Use os dados de atividade neuronal como entrada e variáveis auxiliares como rótulos para gerar incorporações conjuntas.
3. Para a autoincorporação de atividades neuronais, aplique os mesmos parâmetros CEBRA, mas use apenas dados de atividade neuronal como entrada.

Results

O estudo do comportamento natural apresenta maior complexidade em comparação com experimentos baseados em ensaios. Primeiro, em condições naturais, tanto a atividade neural quanto o comportamento carecem de uma linha de base fixa. Essas atividades são recorrentes, o que significa que são influenciadas por estados anteriores e, portanto, alinhar o início de comportamentos específicos para comparação da atividade neural não consegue desvendar os efeitos de estados neuroetológicos anteriores. Em segundo lugar, a codificação neural no comportamento natural ocorre principalmente no nível da população ^4,5. A variabilidade observada em neurônios individuais é substancial o suficiente para ser considerada como ruído. Para validar isso, esta parte realizou uma análise de correlação entre a atividade neural e as poses comportamentais naturais (Figura 2F, Figura 3F, Figura 4F). As matrizes de coeficiente de correlação resultantes não revelaram correspondência específica do neurônio com os traços de pose. Especificamente, os coeficientes de correlação entre sinais neurais e poses de sujeitos, poses de objetos ou distâncias intercorporais caíram na faixa de -0,3 a +0,3, comumente consideradas correlações fracas¹⁵ (Figura 2G, Figura 3G, Figura 4G). Essas descobertas indicam que, em condições naturalísticas, as informações relacionadas à pose não são codificadas de maneira específica do neurônio.

Dados esses fatores, essa estrutura oferece uma abordagem objetiva para capturar e mapear dados neuroetológicos no nível da população neural. A imagem mTPM garante que a variabilidade de neurônios individuais seja preservada o máximo possível. Além disso, o uso de estimativa de pose baseada em aprendizado profundo por ADPT e métodos de decomposição de comportamento não supervisionados, como BeA e SBeA, gera variáveis auxiliares ricas, permitindo que o CEBRA interprete efetivamente a variabilidade dentro das populações neurais.

Esses exemplos demonstram que as incorporações conjuntas do CEBRA estão presentes em todas as variáveis auxiliares, incluindo poses de sujeito, poses de objetos, distâncias corporais, motivos de comportamento de sujeitos, motivos de comportamento de objetos e motivos de comportamento social (Figura 5A). Para verificar a consistência dos motivos comportamentais e incorporações neurais em sessões ou sujeitos, a análise de Procusto³⁵ é usada em três pares de camundongos (Figura 5B). Dado que as incorporações CEBRA são distribuídas em uma esfera unitária, apenas o parâmetro de rotação na análise de Procrustes foi habilitado. Como as incorporações CEBRA de comportamento natural carecem de uma linha de base clara, esta parte primeiro realizou amostragem de alinhamento guiada por rótulo nas incorporações para alinhar, garantindo pontos de ancoragem consistentes antes de aplicar a análise de Procrustes. Visualmente, essas incorporações CEBRA exibem um grau de consistência intrínseca, com distância corporal e motivos sociais mostrando o maior alinhamento. Ele se encaixa na quantificação do RMSE antes e depois do alinhamento de Procrustes (Figura 5C). Em seguida, a precisão da decodificação de incorporação é comparada para poses (Figura 5D) e motivos (Figura 5E). Embora suas representações sejam diferentes, cada uma é decodificável com alta precisão. Embora a decodificação RMSE da distância do corpo seja significativamente maior do que as poses do sujeito e do objeto, não é mais do que a precisão de rastreamento do ADPT⁷.

Para explorar as origens dessas incorporações orientadas por hipóteses, uma incorporação auto-organizada da atividade neural foi gerada por meio do CEBRA (Figura 5A, coluna da direita). A forma da incorporação neural é mais intrincada do que as outras incorporações articulares, incorporando padrões de várias incorporações articulares. Além disso, as semelhanças entre incorporações neurais e incorporações conjuntas foram comparadas usando a transformação de Procrustes e, em seguida, suas semelhanças de cosseno foram comparadas (Figura 5F). A semelhança de cosseno é derivada por minuto entre as incorporações alinhadas nos pontos de tempo correspondentes.

A incorporação conjunta da pose do sujeito S1 foi selecionada como linha de base para comparações de similaridade com base no papel bem estabelecido do S1 na codificação de entradas somatossensoriais auto-organizadas³⁶. Essa incorporação serve como um ponto de referência biologicamente significativo para avaliar como outras variáveis - como motivos relacionados a objetos - são representadas dentro do mesmo espaço neural. Tais comparações nos permitem avaliar a força relativa da codificação para diferentes dimensões comportamentais em relação a uma linha de base somatossensorial auto-relacionada.

Ao comparar a semelhança de cosseno de incorporações neurais com o sujeito S1 que apresenta a incorporação conjunta como linha de base, este estudo descobre que as incorporações conjuntas para motivos de objetos são significativamente menores. Isso sugere que, durante o período de 15 minutos de interação social livre neste exemplo, as atividades neurais S1 do camundongo sujeito codificam principalmente seu comportamento e as interações sociais em andamento. Embora essa análise sirva como um caso demonstrativo, a mesma estrutura metodológica pode ser prontamente aplicada a investigações mais granulares, por exemplo, comparando estruturas de incorporação em épocas temporais distintas para descobrir mudanças dinâmicas na codificação neural.

Figura 1: Procedimento para coleta de dados neuroetológicos. (A) A integração de dispositivos. (B) A operação de registro de dados. (C) Extração de sinal neural, estimativa de pose 2D e reconstrução da trajetória corporal 3D após a gravação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Dados pré-processados do camundongo 1 para análise posterior. (A) Atividades neuronais. (B) Poses do sujeito. (C) Poses de objetos. (D) Distância do corpo. (E) Motivos de comportamento. De cima para baixo estão os motivos de sujeito, objeto e comportamento social. (F) As matrizes de coeficiente de correlação entre a atividade neural e as poses. Esquerda: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Centro: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses dos objetos. Direita: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e a distância corporal. Os coeficientes de correlação são entre cada traço de neurônio e cada dimensão de pose. (G) As distribuições dos coeficientes de correlação de F. Os índices de neurônios são classificados de acordo com os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Abreviações: N & S = atividade neural e poses de sujeitos, N & O = atividade neural e poses de objetos, N & B = atividade neural e distâncias corporais, CC = coeficientes de correlação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dados pré-processados do camundongo 2 para análise posterior. (A) Atividades neuronais. (B) Poses do sujeito. (C) Poses de objetos. (D) Distância do corpo. (E) Motivos de comportamento. De cima para baixo estão os motivos de sujeito, objeto e comportamento social. (F) As matrizes de coeficiente de correlação entre a atividade neural e as poses. Esquerda: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Centro: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses dos objetos. Direita: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e a distância corporal. Os coeficientes de correlação são entre cada traço de neurônio e cada dimensão de pose. (G) As distribuições dos coeficientes de correlação de F. Os índices de neurônios são classificados de acordo com os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Abreviações: N & S = atividade neural e poses de sujeitos, N & O = atividade neural e poses de objetos, N & B = atividade neural e distâncias corporais, CC = coeficientes de correlação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dados pré-processados do camundongo 3 para análise posterior. (A) Atividades neuronais. (B) Poses do sujeito. (C) Poses de objetos. (D) Distância do corpo. (E) Motivos de comportamento. De cima para baixo estão os motivos de sujeito, objeto e comportamento social. (F) As matrizes de coeficiente de correlação entre a atividade neural e as poses. Esquerda: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Centro: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses dos objetos. Direita: os coeficientes de correlação entre a atividade neural e a distância corporal. Os coeficientes de correlação são entre cada traço de neurônio e cada dimensão de pose. (G) As distribuições dos coeficientes de correlação de F. Os índices de neurônios são classificados de acordo com os coeficientes de correlação entre a atividade neural e as poses do sujeito. Abreviações: N & S = atividade neural e poses de sujeitos, N & O = atividade neural e poses de objetos, N & B = atividade neural e distâncias corporais, CC = coeficientes de correlação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Análise das incorporações de dados neuroetológicos do CEBRA. (A) Incorporações do CEBRA. Da esquerda para a direita estão a incorporação conjunta da atividade neural S1 e poses de sujeito, a incorporação conjunta de atividade neural S1 e poses de objetos, a incorporação conjunta de atividade neural S1 e distâncias corporais entre dois animais, a incorporação conjunta de atividade neural S1 e motivos de comportamento de sujeito, a incorporação conjunta de atividade neural S1 e motivos de comportamento de objeto, a incorporação conjunta da atividade neural S1 e motivos de comportamento social e a incorporação neural de S1. (B) A análise de Procusto alinha as incorporações acima. Os círculos cinzas representam o par de mouses 1, servindo como a incorporação de referência. Os sinais de mais verdes representam o par de ratos 2 e as cruzes laranja representam o par de ratos 3, ambos alinhados com o par de ratos 1. (C) A raiz do erro quadrático médio (RMSE) antes (esquerda) e depois (direita) do alinhamento de Procusto (teste t pareado, n = 3, média ± SEM). (D) O RMSE da reconstrução de pose a partir de incorporações CEBRA (ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey, n = 3, média ± SEM). (E) A precisão da reconstrução do motivo a partir de incorporações CEBRA (ANOVA unidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey, n = 3, média ± SEM). (F) As semelhanças de cosseno entre incorporações conjuntas e incorporação neural de S1 (ANOVA unidirecional seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett, n = 45, média ± SEM). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Não.	Problema observado	Causa provável	Soluções possíveis
1	Sem carimbos de data/hora de comportamento	(1) Cabos SMA ou BNC defeituosos	(1) Substitua os cabos SMA e BNC
		(2) Driver USB para TTL ausente	(2) Instale o driver USB Prolific PL2303
		(3) Seleção incorreta da porta COM	(3) Verifique o número da porta COM no Gerenciador de dispositivos e atualize-o no software mTPM e no script da câmera de comportamento.
2	Sem fluorescência visível durante a montagem mTPM	(1) Falta de expressão viral	(1) Use um mouse diferente
		(2) Campo de visão incorreto	(2) Reajuste o campo de visão
		(3) Potência insuficiente do laser	(3) Aumente gradualmente a potência do laser
		(4) Gel de carbômero seco	(4) Reaplique o gel de carbômero fresco
3	A imagem mTPM mostra uma tela completamente branca	(1) Vazamento de luz	(1) Embrulhe novamente a folha de alumínio para proteção adequada
		(2) Potência insuficiente do laser	(2) Aumente gradualmente a potência do laser
		(3) Fibra desconectada do cabeçote mTPM	(3) Reinsira a fibra no mTPM e aperte o parafuso de fixação
4	Quadros perdidos em vídeo comportamental	(1) Baixa iluminação ambiente	(1) Aumente a iluminação de fundo
		(2) Porta USB incorreta	(2) Use pelo menos portas USB 3.0
		(3) Desempenho insuficiente do computador	(3) Use uma máquina com Intel i7-9700K ou superior, RAM de canal duplo e armazenamento SSD.
5	Sem locomoção em mouses montados em mTPM	(1) Uso repetitivo do mesmo mouse	(1) Evite reutilizar mouses dentro de 3 dias
		(2) Uso excessivo de papel alumínio	(2) Use o mínimo de folha necessária para proteção contra luz
		(3) Número ou volume insuficiente de balões de hélio	(3) Ajuste o número e a inflação dos balões para suportar a fibra mTPM, permitindo a postura natural e o movimento dos ratos.
6	Estimativa de pose 2D imprecisa	(1) Número insuficiente de quadros rotulados manualmente	(1) Anote pelo menos 200 quadros incrementalmente
		(2) Modelo ADPT subtreinado	(2) Aumentar as épocas de treinamento no arquivo config.yaml do ADPT
7	Reconstrução de pose 3D anormal	(1) Calibração inadequada da câmera	(1) Melhore o contraste de calibração e o ângulo de inclinação
		(2) Entrada de pose 2D imprecisa	(2) Aumente o número de quadros de checkboard capturados
			(3) Resolva os problemas de pose 2D primeiro (consulte o Problema 6)
8	Desalinhamento entre dados neurais e comportamentais	(1) Sequência incorreta de inicialização do software	(1) Sempre inicie a gravação mTPM antes da câmera de comportamento
		(2) Quadros de comportamento descartados	(2) Resolva problemas de queda de quadros (consulte o Problema 4)
			(3) Certifique-se de que haja espaço em disco suficiente disponível
9	Estouro de memória durante o processamento BeA/SBeA	(1) Duração excessiva da gravação	(1) Divida as gravações em segmentos mais curtos (5 a 60 minutos) e execute BeA/SBeA
		(2) RAM do sistema limitada	(2) Aumente o fator de redução temporal (por exemplo, de 5 para 10) em BeA
			(3) Atualize a RAM para pelo menos 64 GB
10	O CEBRA falha ao executar na GPU	(1) Incompatibilidade entre CUDA e driver de GPU	(1) Não siga diretamente o tutorial para instalar o CUDA 11.3
		(2) Versão incompatível do PyTorch	(2) Verifique o modelo da GPU e a versão do driver (nvidia-smi)
			(3) Instale as versões corretas do CUDA e do PyTorch de acordo e, em seguida, instale o CEBRA via pip

Tabela 1: Lista de solução de problemas. A seguir está uma lista de 10 problemas não triviais encontrados anteriormente e possíveis soluções.

Discussion

Essa estrutura de gravação e decodificação neuroetológica é construída sobre dispositivos disponíveis comercialmente, garantindo que a maioria dos problemas de solução de problemas possa ser resolvida pelas respectivas empresas. Mesmo assim, este estudo fornece uma lista de problemas encontrados com frequência para facilitar a referência e agilizar a solução de problemas (Tabela 1). Essa acessibilidade torna a estrutura mais fácil de usar para os recém-chegados. Além disso, a estrutura é altamente flexível, com sincronização entre gravações neurais e comportamentais contando com sinais TTL padrão. Como resultado, é simples integrar outros dispositivos de registro fisiológico na estrutura, se necessário. Os procedimentos de análise subsequentes também são suficientemente gerais para suportar sistemas de registro neural e comportamental totalmente personalizados.

O custo associado a essa estrutura, que é baseada em dispositivos comercializados, é relativamente alto (~ 500.000 USD), impondo assim um ônus financeiro adicional ao laboratório. Embora ferramentas recentes de código aberto, como MINI2P¹³ e Anipose³⁷ , possam ajudar a reduzir os custos de material, essa experiência sugere que as despesas gerais permanecerão semelhantes ao contabilizar os custos de recursos humanos envolvidos na depuração. Outra limitação dessa estrutura está na interpretabilidade das incorporações do CEBRA. Como um método baseado em redes neurais artificiais, é inerentemente desafiador de interpretar. Embora este exemplo forneça uma abordagem simples para explicar as incorporações, outros métodos precisarão ser desenvolvidos caso a caso para diferentes projetos. Uma solução potencial para uma interpretação mais aprofundada das incorporações do CEBRA é a aplicação de sistemas dinâmicos³⁸. Além disso, o comportamento natural pode ser segmentado em fases distintas, como interações quando os dois camundongos estão distantes ou próximos. Diferentes questões científicas podem exigir o desenvolvimento de fluxos de trabalho de análise de dados personalizados.

Embora o atual sistema de câmera mTPM + 3D seja implantado em uma arena de campo aberto, sua aplicação não se limita a esse contexto comportamental específico. As principais restrições surgem da amarração física do sistema de imagem, que limita a extensão da mobilidade animal, e do campo de visão da câmera 3D, que restringe o volume rastreável. Esses fatores podem ser abordados em iterações futuras, incorporando módulos de imagem sem fio³⁹ ou matrizes de câmeras ocultas⁴⁰ para permitir paradigmas comportamentais mais complexos e naturalistas. Notavelmente, tanto o sistema mTPM quanto a configuração da câmera 3D são capazes de aquisição contínua de dados^{24 horas 10,41}, tornando todo o pipeline adequado para estudos comportamentais e de gravação neural em escala de longo prazo.

Este estudo adota uma abordagem totalmente baseada em dados para investigar a codificação neural do comportamento espontâneo e, portanto, abstém-se intencionalmente de atribuir rótulos semânticos predefinidos a motivos comportamentais agrupados. Essa decisão está enraizada no objetivo de preservar a generalização da estrutura de mapeamento do comportamento neural, permitindo que ela opere independentemente das categorias comportamentais impostas pelo experimentador. Os leitores interessados na interpretabilidade biológica e na classificação supervisionada de motivos comportamentais podem consultar trabalhos anteriores ^1,10, bem como um estudo recente⁴², que comparou sistematicamente o agrupamento de motivos não supervisionados com comportamentos rotulados manualmente usando a mesma estrutura subjacente do Atlas do Comportamento. Esses estudos também fornecem visualizações extensas, incluindo sequências de poses 3D, trajetórias e incorporações em nível de motivo, disponíveis por meio de repositórios públicos. Juntos, esses recursos oferecem insights complementares sobre a estrutura semântica do comportamento, ao mesmo tempo em que suportam a abordagem de decodificação neural flexível e generalizável adotada aqui.

Esse pipeline de processamento de dados foi projetado com modularidade e flexibilidade em mente, permitindo a adaptação a diversas configurações experimentais e preferências do usuário. Cada componente principal do pipeline, variando de estimativa de pose 3D, agrupamento de motivos comportamentais não supervisionados, pré-processamento de sinal neural e incorporação neuroetológica conjunta, é implementado como um módulo independente com interfaces de entrada e saída claramente definidas. Essa arquitetura permite que os usuários substituam ferramentas ou algoritmos alternativos em cada estágio (por exemplo, diferentes estruturas de estimativa de pose ^6,22, algoritmos de agrupamento de comportamento^43,44 ou decodificadores neurais^45,46) sem interromper o fluxo de trabalho geral. Embora esses componentes sejam projetados para serem interoperáveis, este estudo não testou exaustivamente todas as combinações possíveis de métodos alternativos, e os usuários podem precisar realizar ajustes adicionais para garantir a compatibilidade em suas aplicações específicas. Essa modularidade facilita tanto a reprodutibilidade quanto a extensibilidade e permite que a estrutura seja adaptada a espécies, modalidades de registro ou paradigmas comportamentais além daqueles demonstrados aqui. Para apoiar o uso mais amplo da comunidade, este estudo fornece uma visão geral esquemática e uma tabela de resumo (Figura 1, Tabela de Materiais).

As configurações de parâmetros usadas para SBeA e CEBRA neste pipeline são baseadas em uma combinação de valores padrão e ajustes empíricos específicos para este contexto experimental, movendo livremente os mouses sob interação social natural. Esses parâmetros foram validados para reproduzir todos os resultados apresentados neste estudo sem a necessidade de ajustes adicionais. Embora os usuários possam querer ajustar certos parâmetros para acomodar diferentes configurações de gravação ou tarefas comportamentais, essas modificações não são necessárias para replicar esse pipeline. Para usuários que trabalham em outros contextos, recomenda-se consultar a documentação original e a literatura do SBeA e do CEBRA, onde são fornecidos intervalos de parâmetros e orientações específicas da tarefa. Essa implementação serve como uma configuração de referência robusta que pode ser aplicada diretamente ou adaptada conforme necessário.

O principal avanço dessa estrutura está em sua aplicação a animais que se movem livremente. Estudos anteriores realizados com animais com a cabeça fixa podem ser adaptados a condições de movimento livre dentro dessa estrutura. Por exemplo, tarefas como a Tarefa Go/No-Go⁴⁷ e a Escolha Forçada de Duas Alternativas⁴⁸ podem ser modificadas e integradas a essa estrutura com base em paradigmas de comportamento natural. Essa abordagem elimina artefatos causados pela restrição da cabeça, permitindo o estudo da relação entre a tarefa e os estados comportamentais naturais. Essa estrutura proporciona aos animais maior autonomia na tomada de decisões. Também apoia os estudos da medula espinhal em contextos naturalísticos, combinando o método de registro medular mTPM⁴⁹. Além disso, facilita o estudo do comportamento do grupo livre, um fenômeno que não é viável em configurações de cabeça fixa. O fluxo de trabalho de análise de dados permite a interpretação da atividade da população neural em várias variáveis, usando incorporações para desvendar a complexidade da função cerebral por trás das populações neurais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de registro de comportamento 3D	BayONE Científico	BA-3D-Mouse	Módulo de sincronização integrado
Balão	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/3uex669s	Qualquer balão que seja leve o suficiente para voar quando cheio de hélio. Os balões são balões esféricos de alumínio, com aproximadamente 45 cm de diâmetro, e possuem válvulas autovedantes. A URL fornece um exemplo dos balões.
Gel para os olhos de carbômero	Vidísico	Gel lubrificante para os olhos à base de carbômero 980	10 ouros
Barbante de algodão	AliExpress	URL: https://tinyurl.com/ywu7u754	Grosso e leve, 1-2 mm de diâmetro. O URL fornece um exemplo do fio de algodão.
Broca craniana	RWD	78001	Broca de 0,8, 1,4 e 2,1 mm
Módulo de câmera personalizado configurável	Inteligência	RealSense D435	/
Adesivo estrutural acrílico de alto desempenho	HUITIAN	1320	490ml
Rato para a imagem latente	TRANSCENDER VIVOSCOPE	URL: https://en.tv-scope.com/	O camundongo macho com fundo C57BL / 6J (10 semanas de idade) foi alojado em 1 camundongo por gaiola sob um 12  h ciclo claro-escuro em 22– 25  ° C com 40%– 70% de umidade e foi permitido acessar água e alimentos ad libitum. Os vírus AAV9-CaMKII-GCaMP6s foram injetados em seu córtex somatossensorial primário (AP, − 0,60 mm; ML, &menos; 2,40 mm; VD, 2,00 mm). Em nosso estudo, os camundongos foram preparados pelo TRANSCEND VIVOSCOPE como parte de seu serviço profissional de preparação animal. Este serviço inclui injeção de vírus, implantação de janela craniana e instalação de placa de base especificamente adaptada para seu sistema de microscopia de dois fótons em miniatura.
Mouse para interação	BayONE LAC	URL: https://lac.bayonesci.com/	Os camundongos machos com fundo C57BL / 6J (10 semanas de idade) foram alojados em 5 camundongos por gaiola sob um 12  h ciclo claro-escuro em 22– 25  ° C com 40– 70% de umidade e foram autorizados a acessar água e alimentos ad libitum. Todos os procedimentos de criação e experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Tecnologia Avançada de Shenzhen, Academia Chinesa de Ciências.
Sistema de gravação neural mTPM	TRANSCENDER VIVOSCOPE	SUPERNOVA-600	O SUPERNOVA-600 é um sistema de imagem em miniatura de dois fótons totalmente integrado para roedores que se movem livremente, incluindo todos os componentes ópticos e de gravação essenciais, mas excluindo dispositivos de estimulação externos. Ele deve conter o módulo de sincronização integrado.