Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos cardioprotetores da sinalização NRG1/ErbB4 em um modelo de lesão de isquemia-reperfusão em ratos, avaliando o estresse oxidativo e as vias de sinalização apoptótica.
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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos cardioprotetores da sinalização NRG1/ErbB4 em um modelo de lesão de isquemia-reperfusão em ratos, avaliando o estresse oxidativo e as vias de sinalização apoptótica.
A lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI) perdura como um impedimento substancial para o manejo da doença cardiovascular. A fisiopatologia do MIRI é complexa, envolvendo estresse oxidativo, sobrecarga de cálcio, inflamação e apoptose. A via de sinalização NRG1 / ErbB4 tem sido implicada na modulação das respostas ao estresse oxidativo no coração, reduzindo potencialmente o dano celular causado pelos radicais livres. Este estudo teve como objetivo elucidar os mecanismos moleculares pelos quais a via NRG1/ErbB4 confere proteção em um modelo de lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (MIRI) em ratos. Um modelo MIRI de ratos foi estabelecido, envolvendo 30 ratos Sprague-Dawley machos adultos aleatoriamente divididos em cinco grupos: controle, operação simulada, MIRI, NRG1 recombinante e AG1478. As concentrações de NRG1 nos tecidos cardíacos foram medidas por ELISA, enquanto os níveis de proteína p-ErbB4 e ErbB4 total foram avaliados por Western blot. A apoptose dos cardiomiócitos e os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) foram avaliados por citometria de fluxo. No grupo MIRI, os níveis de NRG1 foram significativamente reduzidos em comparação com os grupos controle e operação simulada (p < 0,05). O tratamento com NRG1 recombinante levou a um aumento acentuado nos níveis de NRG1 no tecido cardíaco, juntamente com uma proporção de expressão p-ErbB4 / ErbB4 aprimorada (p < 0,05). O grupo AG1478 exibiu níveis mais baixos de NRG1 e uma relação p-ErbB4/ErbB4 reduzida em comparação com o grupo NRG1 recombinante (p < 0,05). Em termos de níveis de apoptose e ROS, o grupo MIRI apresentou taxas significativamente maiores do que os grupos controle e operação simulada (p < 0,05). O tratamento com NRG1 recombinante reduziu significativamente os níveis de apoptose das células miocárdicas e ROS (p < 0,05), enquanto o AG1478 também atenuou esses efeitos, mas em menor grau. A via de sinalização NRG1 / ErbB4 desempenha um papel protetor fundamental no MIRI em ratos. A suplementação com NRG1 exógeno eleva efetivamente os níveis de NRG1 no coração, ativa a via de sinalização ErbB4, reduz a apoptose das células miocárdicas e diminui os níveis de ROS, mitigando assim os danos induzidos pelo MIRI.
A lesão de isquemia-reperfusão miocárdica (IRMI) representa um desafio crítico no manejo das doenças cardiovasculares1. Embora a restauração do fluxo sanguíneo para o miocárdio isquêmico seja essencial para o tratamento do infarto do miocárdio, a própria reperfusão pode exacerbar o dano ao tecido cardíaco, limitando assim o efeito terapêutico. Os mecanismos subjacentes ao MIRI são complexos e incluem vários processos fisiopatológicos, entre os quais o estresse oxidativo, a sobrecarga de cálcio, as respostas inflamatórias e a apoptose 2,3,4.
O fator de crescimento nervoso 1 (NRG1) e seu receptor Erb-B2 Receptor Tirosina Quinase 4 (ERBB4) desempenham papéis fundamentais na fisiologia e patologia cardíaca. O NRG1, um ligante extracelular, interage com o receptor ErbB4 para ativar uma cascata de vias de sinalização que são cruciais para o desenvolvimento do coração, mantendo a integridade estrutural e respondendo a lesões cardíacas5. Evidências emergentes destacam o papel desempenhado pela via de sinalização NRG1/ErbB4 em doenças cardíacas. Em condições de isquemia-reperfusão miocárdica, a expressão e a função do NRG1 podem ser alteradas6. Estudos anteriores sugeriram que o NRG1 promove a sobrevivência das células miocárdicas e inibe a apoptose excessiva ao ativar o ErbB4. Além disso, a via de sinalização NRG1/ErbB4 pode regular a resposta ao estresse oxidativo no coração e mitigar os danos celulares causados pelos radicais livres. Portanto, elucidar a função da via de sinalização NRG1 / ErbB4 no MIRI é vital para entender a base biológica dessa lesão e desenvolver novas estratégias terapêuticas 7,8.
Este estudo especula que a via de sinalização NRG1 / ErbB4 desempenha um papel protetor no MIRI. Portanto, neste estudo, um modelo de isquemia-reperfusão miocárdica em ratos foi construído para investigar sistematicamente o mecanismo da via de sinalização NRG1/ErbB4 no MIRI. Regulando a concentração de NRG1 e observando as mudanças no estado de ativação de ErbB4, taxa de apoptose de células miocárdicas e nível de estresse oxidativo. Este estudo tenta revelar o mecanismo molecular pelo qual a via de sinalização NRG1 / ErbB4 exerce um efeito protetor no MIRI. A novidade deste estudo reside em revelar a importância da via de sinalização NRG1/ErbB4 na lesão miocárdica de isquemia-reperfusão, além de fornecer uma nova perspectiva para as estratégias de tratamento de cardiopatias baseadas nessa via.
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Animais experimentais
Trinta ratos Sprague-Dawley (SD) machos adultos, com 8 semanas de idade e pesando 180-200 g, foram obtidos de um fornecedor comercial. Esses ratos foram alojados em condições específicas livres de patógenos por 1 semana antes dos experimentos. Os experimentos receberam aprovação do Comitê de Ética do Primeiro Hospital de Nanping (NO. NPSY202208010).
Modelos animais de lesão miocárdica de isquemia-reperfusão
Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 3% na dose de 50 mg/kg. Após a confirmação da ausência de reflexos, os animais foram colocados em decúbito dorsal, e as áreas do pescoço e tórax foram raspadas e desinfetadas com etanol a 75%. Uma incisão cervical na linha média (~2 cm) foi feita para expor a traqueia, seguida de intubação oral usando um cateter 16 G para manter a permeabilidade das vias aéreas durante a cirurgia. Posteriormente, o músculo peitoral maior esquerdo foi cuidadosamente dissecado para expor o terceiro e quarto espaços intercostais. Foi realizada uma toracotomia fazendo uma incisão entre esses espaços, e o pericárdio foi aberto para expor totalmente o coração. Para induzir a isquemia, a artéria coronária descendente anterior (DAE) foi ligada com um 8-0 sutura de nylon. Um tubo de polietileno (PE-10) foi inserido entre a DAE e a ligadura para permitir a oclusão reversível. A isquemia foi mantida por 45 min, confirmada visualmente pelo branqueamento miocárdico e alterações no ECG. A reperfusão foi iniciada com a liberação da ligadura, permitindo a retomada do fluxo sanguíneo por 3 h. A ligadura foi removida 45 min depois.
Agrupamento experimental
Os ratos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos (n = 6 cada). (1) Grupo controle: os ratos receberam tratamento padrão sem qualquer intervenção cirúrgica ou tratamento. (2) Grupo operação simulada: ratos foram submetidos a toracotomia e rosqueamento da artéria coronária descendente anterior (DA) sem ligadura, servindo como controles cirúrgicos. (3) Grupo MIRI: ratos foram submetidos à indução da lesão miocárdica de isquemia-reperfusão e receberam soro fisiológico por via intragástrica como controle veicular. (4) Grupo NRG1 recombinante: os ratos receberam uma injeção intravenosa de NRG1 humano recombinante (rh-NRG1) na dose de 5 mg/kg, 30 min antes da toracotomia, seguida do procedimento MIRI. (5) Grupo AG1478: os ratos receberam rh-NRG1 (5 mg/kg) por via venosa combinada com AG1478 (20 mg/kg), um inibidor do receptor quinase de ErbB, 30 min antes da toracotomia, e depois foram submetidos ao procedimento de MIRI.
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Os animais foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (150 mg/kg). Os tecidos cardíacos foram coletados imediatamente após a reperfusão e homogeneizados em gelo em um volume apropriado de PBS gelado. Os homogeneizados foram então centrifugados a 1200 x g por 10 min a 4 °C para separar o sobrenadante. A concentração de NRG1 no sobrenadante foi quantificada usando um kit ELISA NRG1 disponível comercialmente, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante. Resumidamente, amostras e padrões foram adicionados aos poços da placa ELISA, incubados em temperatura ambiente pelo tempo recomendado, seguidos de lavagem e adição de anticorpos de detecção. A absorbância foi medida no comprimento de onda especificado usando um leitor de microplacas, e os níveis de NRG1 foram calculados com base na curva padrão. O volume da amostra foi de 100 μL, a diluição do anticorpo foi de 1:100 e o comprimento de onda para medir a absorbância foi fixado em 450 nm.
Análise de Western blot
Os tecidos cardíacos foram excisados de ratos anestesiados e enxaguados em PBS gelado para remover o sangue residual. Para cada coração, aproximadamente 0,5 g de tecido ventricular esquerdo foi pesado e colocado em 500 μL de tampão de lise RIPA recém-preparado. O tecido foi então homogeneizado em gelo usando um moedor mecânico de tecido até ser totalmente lisado, seguido de incubação em gelo por 30 min para garantir a extração completa da proteína. Os lisados foram centrifugados a 12.000 × g por 15 min a 4 °C para remover os detritos. As concentrações de proteína foram determinadas usando um kit de ensaio de BCA. Quantidades iguais de proteína total (por exemplo, 30 μg por pista) foram carregadas e separadas por SDS-PAGE. As proteínas foram então transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 min. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h em temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra ErbB4 fosforilada (p-ErbB4) e ErbB4 total, cada uma diluída 1:1000. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) por 1 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas usando substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL) e capturadas usando um sistema de imagem de gel. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o software ImageJ, e a razão entre p-ErbB4 e ErbB4 total foi calculada para avaliar os níveis de fosforilação.
Citometria de fluxo
A apoptose do miócito cardíaco foi avaliada por citometria de fluxo. Os tecidos cardíacos foram finamente picados e digeridos enzimaticamente usando uma mistura de colagenase tipo II (1 mg / mL) e protease (por exemplo,., tripsina, 0,25%) a 37 ° C com agitação suave por 20-30 min. A digestão enzimática foi encerrada pela adição de um volume igual de soro fetal bovino (FBS). A suspensão celular foi filtrada através de uma malha de náilon de 70 μm e centrifugada a 300 × g por 5 min a 4 °C para coletar as células. O pellet celular foi ressuspenso em tampão de ligação e, em seguida, incubado com Anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) de acordo com o protocolo do fabricante. Após incubação por 15 min em temperatura ambiente no escuro, as amostras foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo. As células apoptóticas precoces foram identificadas como Anexina V positiva e PI negativa, enquanto as células apoptóticas tardias ou necróticas foram positivas para ambos os marcadores. As taxas de apoptose foram quantificadas e comparadas entre os grupos experimentais. A estratégia de passagem adota uma configuração de portão cruzado/portão retangular. Ao realizar a detecção na máquina, a porta cruzada foi definida como uma linha pontilhada e todos os parâmetros foram aplicados para garantir a consistência da triagem de dados. A taxa de fluxo foi ajustada de acordo com a concentração da célula (mantida em 1000 células / s), e o carregamento de amostra em baixa velocidade pode evitar o entupimento do bico.
Detecção de níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS)
Os cardiomiócitos foram isolados dos tecidos cardíacos, seguidos de centrifugação a 300 × g por 5 min e lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram então incubadas com 10 μM de corante diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína (DCFDA) a 37 °C por 30 min no escuro, seguindo as instruções do fabricante. Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com PBS para remover o excesso de corante não ligado. Os níveis intracelulares de ERO foram medidos imediatamente por citometria de fluxo, detectando a intensidade de fluorescência emitida após a oxidação do DCFDA. A intensidade média de fluorescência (MFI) de cada amostra foi quantificada usando o software FlowJo para comparar os níveis de ROS entre os grupos experimentais. A estratégia de gating é a descrita acima (seção de citometria de fluxo).
Análise estatística
A análise dos dados foi realizada por meio do software SPSS, apresentado como média ± desvio padrão (DP). A análise de variância de uma via com o teste post hoc de Tukey foi realizada para comparar vários grupos, e o teste t de Student foi usado para comparações pareadas. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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NRG1 exerce um efeito protetor contra a apoptose de cardiomiócitos induzida por MIRI
A análise por citometria de fluxo indicou uma elevação notável nas taxas de apoptose no grupo MIRI quando comparado aos grupos controle e simulado (P < 0,05). Ambos os grupos NRG1 recombinante e AG1478 exibiram taxas de apoptose significativamente reduzidas em comparação com o grupo MIRI (P < 0,05). Em contraste, o grupo NRG1 recombinante exibiu uma taxa de apoptose reduzida em comparação com o grupo AG1478 (P &...
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O MIRI continua a representar um obstáculo significativo no manejo da doença cardiovascular, uma vez que o restabelecimento da perfusão ao tecido cardíaco isquêmico pode, paradoxalmente, intensificar a lesão miocárdica. A ocorrência de IRMI é multifatorial, envolvendo estresse oxidativo, sobrecarga de cálcio, reações inflamatórias e disfunção mitocondrial 9,10.
NRG1, um ligante extracelular, ativa as v...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian (número de concessão.2024J011604,2023J011877) e pelo Projeto de Pesquisa Juvenil da Comissão de Lareiras da Província de Fujian (número de concessão.2019-9-25).
CONTRIBUIÇÃO DO AUTOR:
Maozhi Huang liderou a concepção e o desenho do projeto de pesquisa, planejou e detalhou o protocolo experimental, participou de experimentos importantes e escreveu o primeiro rascunho do manuscrito. Jianping Zheng contribuiu igualmente para a pesquisa geral, incluindo o design, a coleta de dados e a redação do manuscrito. Xianlu Cheng contribuiu para o desenho da pesquisa, coletou amostras e analisou dados. Chaoqun Você ajudou a escrever e estruturar o manuscrito. Ziguo Chen verificou os dados e ajudou a melhorar a seção de métodos e materiais. Ling Jiang forneceu controle acadêmico e orientação durante todo o processo de pesquisa. Shanghua Xu orientou a direção geral do projeto, coordenou recursos e revisou e revisou o manuscrito final.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| AG1478 | Tecnologia BioLab | WD102925 | Medicamento de intervenção AG1478 |
| Kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC/PI | Meilune | MA0220 | Apoptose por citometria de fluxo |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Meilunbio | MA0082-2 | Quantificação da proteína WB |
| Sistema de imagem por quimioluminescência | Bio-Rad (EUA) | Toque ChemiDoc | Imagem de Western blot |
| Cloridrato de ciamemazina | Huamu Saúde Animal | 20220601 | Anestésico para modelagem animal |
| Kit de detecção de ECL | Meilunbio | MA0186-1 | Quimioluminescência WB |
| ERbB4 | Tecnologia de proteína | 19943-1-AP | Anticorpo primário WB |
| Citômetro de fluxo | BD | FACSCalibur | Detecção de apoptose por citometria de fluxo |
| GAPDH | Tecnologia de proteína | 60004-1-IG | Anticorpo de controle de carga WB |
| IgG anti-rato de cabra conjugada com HRP (H + L) | Tecnologia de proteína | SA00001-1 | Imuno-histoquímica |
| IgG anti-coelho de cabra conjugada com HRP (H + L) | Tecnologia de proteína | SA00001-2 | Imuno-histoquímica |
| Leitor de microplacas | Thermo | K3 | Detecção de ELISA |
| Kit de Preparação de Gel PAGE 15% | Meilunbio | MA0384 | Eletroforese WB |
| p-ERbB4 | Afinidade | AF3445 | Anticorpo primário WB |
| Marcador de proteína pré-corado | Meilunbio | MA0342 | Eletroforese WB |
| Kit ELISA Neuregulin-1 (NRG-1) para ratos | Meimian | MM-61434R2 | Detecção de ELISA |
| Kit de ensaio de espécies reativas de oxigênio (ROS) | Meilune | MA0219 | Ensaio WB |
| rhNRG1 | Tecnologia BioLab | WD091127 | Medicamento de intervenção NRG1 |
| Tampão de lise RIPA | Meilunbio | MA0151 | Extração de proteínas para Western blot |
| Buffer de carregamento SDS-PAGE (5x) | Beyotime | Pág. 0015L | Eletroforese WB |
| Dodecil Sulfato de Sódio | Sigma | 151-21-3 | Eletroforese WB |
| Su Tai 50 | Virbac (França) | 8X22A | Anestésico para modelagem animal |
| Sistema de eletroforese de proteínas verticais | Bio-Rad (EUA) | PODER PAC 200 | Eletroforese de Western blot |
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