Artigo de método

Explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear

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DOI:

10.3791/68674

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26 de agosto de 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

Neste artigo

Resumo

Este protocolo baseado em RMN investiga interações proteína-glicano fracas usando cianovirina-N e D-manose. Combinando métodos detectados por ligantes e proteínas, ele mapeia locais de ligação, detecta efeitos alostéricos e identifica complexos de encontro. A abordagem descreve a preparação de amostras e a análise de dados, oferecendo insights estruturais e dinâmicos valiosos para diagnósticos específicos de glicanos e mecanismos de reconhecimento.

Resumo

As interações proteína-glicano são centrais para muitos processos biológicos e são cada vez mais reconhecidas como alvos promissores para estratégias diagnósticas em doenças infecciosas, inflamatórias e neoplásicas. No entanto, caracterizar essas interações, especialmente quando são fracas e transitórias, permanece tecnicamente desafiador. A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) oferece vantagens únicas para estudar tais interações em condições quase fisiológicas, fornecendo insights de resolução atômica sobre aspectos estruturais e dinâmicos. Neste estudo, apresentamos um protocolo integrado de RMN projetado para investigar interações proteína-glicano de baixa afinidade usando a lectina específica da manose, cianovirina-N, e o monossacarídeo D-manose como sistema modelo. O protocolo combina abordagens de RMN baseadas em ligantes e proteínas para mapear os locais de ligação de forma abrangente e detectar eventos de ligação sutis, incluindo potenciais efeitos alostéricos ou complexos de encontro. As etapas críticas do protocolo incluem preparação cuidadosa da amostra, controle preciso das concentrações e padronização espectral para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade dos dados. A RMN em solução permite a detecção de interações transitórias que muitas vezes são inacessíveis por outras técnicas. Embora interações fracas sejam essenciais para a vida, há um viés na literatura em relação a complexos de alta afinidade, embora complexos de baixa afinidade sejam relevantes em muitas funções biológicas importantes, como transdução de sinal e comunicação célula-célula. Essa técnica fornece uma plataforma poderosa para investigar o reconhecimento proteína-glicano e pode servir como uma ferramenta valiosa para identificar novos marcadores diagnósticos com base em interações específicas de glicanos.

Introdução

As interações proteína-glicano são fundamentais para uma ampla gama de processos biológicos, incluindo reconhecimento célula-célula, modulação da resposta imune e interações patógeno-hospedeiro 1,2. Essas interações moleculares são altamente específicas e dinâmicas e desempenham papéis cruciais nos mecanismos fisiológicos e patológicos 3,4,5. Um exemplo clássico de tais interações ocorre com lectinas, proteínas que reconhecem e se ligam especificamente aos glicanos. A cianovirina-N (CVN), por exemplo, tem sido amplamente estudada como modelo experimental devido à sua capacidade de interagir em alta afinidade com oligossacarídeos de alta manose 5,6,7.

Além das lectinas, muitas proteínas glicosiladas, como as integrinas, também desempenham papéis essenciais no reconhecimento e na sinalização celular. As integrinas são receptores transmembranares que freqüentemente sofrem glicosilação de suas subunidades, influenciando sua estabilidade e afinidade por ligantes, incluindo glicanos 5,8,9,10. No entanto, a caracterização estrutural dessas interações permanece desafiadora devido à heterogeneidade e flexibilidade intrínsecas dos glicanos, o que complica as abordagens tradicionais da biologia estrutural. Nesse contexto, o desenvolvimento de metodologias avançadas capazes de capturar essas interações em solução é de grande valia para esse campo, particularmente para a glicobiologia11,12.

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) surgiu como uma ferramenta poderosa para investigar as interações proteína-ligante no nível atômico. Ao contrário de outras técnicas, como cristalografia de raios-X e microscopia crioeletrônica, a RMN permite o estudo de interações biomoleculares em condições quase fisiológicas, fornecendo informações sobre estrutura e dinâmica. Essa flexibilidade permite que os pesquisadores modulem parâmetros ambientais, como pH (normalmente entre 4,0-8,0), força iônica (por exemplo, 0-500 mM NaCl) e temperatura (geralmente 273-330 K), adaptando assim as condições às especificidades dos complexos proteína-glicano. Além disso, a RMN é particularmente vantajosa para analisar interações transitórias e fracas, que muitas vezes são características de eventos de reconhecimento proteína-glicano13,14.

Várias técnicas de RMN têm sido empregadas para investigar as interações proteína-glicano, utilizando abordagens baseadas em proteínas e ligantes. Do ponto de vista da proteína, a titulação heteronuclear de coerência quântica única (HSQC) é amplamente utilizada para mapear locais de ligação, monitorando perturbações de deslocamento químico após a adição de ligantes. Experimentos de dispersão de relaxamento permitem a detecção de processos conformacionais e de troca química que ocorrem na escala de tempo de micro a milissegundos, fornecendo informações sobre os aspectos dinâmicos do reconhecimento de glicanos15,16. Essas técnicas baseadas em proteínas normalmente requerem concentrações de amostra na faixa de 50 μM a 2 mM, dependendo da estabilidade da proteína e da eficiência de marcação17,18.

As técnicas de RMN baseadas em ligantes oferecem informações complementares, concentrando-se nas mudanças de glicano durante a ligação. A diferença de transferência de saturação (STD-NMR) é particularmente útil para identificar epítopos de glicanos envolvidos no reconhecimento, pois satura seletivamente os sinais de RMN de regiões ligantes em contato próximo com a proteína19,20. Ligantes de água observados por espectroscopia de gradiente (WaterLOGSY) 21 , 22 e espectroscopia de efeito de sobrecarga nuclear transferida (Tr-NOESY) fornecem meios adicionais para avaliar a ligação do ligante e as mudanças conformacionais durante as interações23. Além disso, os experimentos de relaxamento de Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) auxiliam na identificação de interações fracas e transitórias que são difíceis de detectar com métodos convencionais24. Experimentos baseados em ligantes são frequentemente realizados em concentrações de proteína de 10-50 μM e podem exigir otimização dos tempos de mistura e parâmetros de saturação25. Notavelmente, esses métodos podem ser limitados pela baixa solubilidade dos glicanos ou pela baixa relação sinal-ruído ao trabalhar com ligantes pequenos.

Juntos, esses métodos de RMN fornecem uma estrutura abrangente para elucidar as propriedades estruturais e dinâmicas das interações proteína-glicano. Com os avanços contínuos nas estratégias de sensibilidade e marcação isotópica, essa técnica está se tornando cada vez mais essencial na glicobiologia, oferecendo novas perspectivas sobre mecanismos de reconhecimento molecular com aplicações potenciais no desenvolvimento de medicamentos e na descoberta de biomarcadores. No entanto, o sucesso dessas abordagens depende de fatores como homogeneidade da amostra, complexidade do glicano e presença de regiões flexíveis ou desordenadas que podem ampliar os sinais de RMN ou dificultar a interpretação26. A RMN é um método poderoso para estudar eventos transitórios, o que é um grande desafio na biologia estrutural.

O CVN reconhece resíduos de manosil ligados a α(1,2) presentes em oligossacarídeos com alto teor de manose com afinidades nanomolares 27,28,29. No entanto, ele reconhece mal o monossacarídeo D-manose. No presente trabalho, estudamos a interação da CVN com a D-manose como forma de ilustrar como a RMN é poderosa na compreensão de interações transitórias.

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Protocolo

NOTA: Execute todas as etapas envolvendo culturas bacterianas e preparações de tampão de acordo com os protocolos institucionais de biossegurança. Use equipamento de proteção individual (EPI) e, ao manusear culturas abertas ou produtos químicos, trabalhe em uma cabine de biossegurança ou capela de exaustão química, se necessário.

1. Expressão de cianovirina-N

  1. Transforme as células BL21 de E. coli com um plasmídeo que codifica o gene CVN inserido no vetor pET26a.
  2. Cultive as células em 1 L de Super Caldo (32 g de triptona, 20 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl por L), suplementado com canamicina (50 μg/mL), 0,5% (p/v) de glicose e 1,6 mM de MgSO4. Incubar sob agitação contínua a ~250 rpm a 37 °C.
  3. Para a produção de 15CVN marcado com N, cultive as células em meio mínimo M9 modificado usando 15NH4Cl como única fonte de nitrogênio.
    1. Prepare 1 L de meio mínimo M9 misturando 200 mL de solução estéril de sais 5x M9 contendo 64 g/L de Na2HPO4, 15 g/L de KH2PO4, 2,5 g/L de NaCl, 5 g/L de NH4Cl.
    2. Adicione 2 mL de 1 M MgSO4 (0,22 μm esterilizado por filtro), 0,1 mL de 1 M CaCl2 (0,22 μm esterilizado por filtro) e 4 g de glicose (concentração final de 0,4%, dissolvido em água destilada estéril e 0,22 μm esterilizado por filtro).
    3. Traga o volume final para 1 L com água destilada estéril.
      NOTA: Suplementos como aminoácidos ou vitaminas podem ser adicionados conforme necessário.
  4. Monitore a cultura até atingir uma densidade óptica (OD600) de aproximadamente 1,2. Em seguida, adicione isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) a uma concentração final de 1,0 mM para induzir a expressão da proteína.
  5. Incubar durante 20 h após a indução a 37 °C.
  6. Colha as células por centrifugação a 7.000 × g por 10 min a 4 °C.
  7. Isolar a fracção periplasmática do seguinte modo:
    1. Ressuspenda os grânulos celulares em 0,4 volumes de tampão Tris-HCl 30 mM (pH 8,0) contendo 20% de sacarose e 1 mM de EDTA e incube à temperatura ambiente com agitação por 10 min.
    2. Centrifugue a 10.000 × g por 10 min a 4 °C.
    3. Ressuspenda os pellets resultantes em 0,4 volumes de água destilada gelada e incube no gelo agitando por 10 min.
    4. Centrifugue novamente a 10.000 × g por 10 min a 4 °C.
    5. Colete o sobrenadante, que corresponde à fração periplasmática, para extração de proteínas.
      NOTA: Todos os tampões devem conter um coquetel de inibidores de protease para evitar a degradação da proteína.

2. Experimentos de RMN

NOTA: Todos os experimentos foram adquiridos a 14,1 T usando uma sonda de detecção inversa de ressonância tripla 1H / 15N / 13C (ver Tabela de Materiais) a 298K.

  1. Experimentos baseados em ligantes
    1. Preparação da amostra
      1. Preparar duas amostras: uma contendo CVN e outra sem CVN (controlo apenas com ligante). Cada amostra contém 600 μL de 80 μM de CVN em tampão fosfato de sódio (pH 7,4) contendo 50 mM de NaCl.
      2. Adicionar D-manose a uma concentração final de 4 mM.
      3. Adicionar 5% (v/v) D2O a cada amostra.
      4. Transfira a amostra para um tubo de RMN de 5 mm.
      5. Use um excesso molar de 50 vezes do ligante em relação à proteína.
        NOTA: Um excesso de ligante na faixa de 10 a 1000 vezes é normalmente recomendado, com excessos mais baixos preferidos para proteínas pequenas.
    2. Aquisição espectral para atribuição de D-manose
      1. Adquira espectros 2D TOCSY e 2D 1 H-13C HMBC usando sequências de pulso padrão:
        2D TOCSY: Espectroscopia de correlação total sensível à fase (TOCSY) com escultura de excitação para supressão de água (DIPSI2ESGPPH).
        HMBC 2D: 1Correlação de ligações múltiplas heteronucleares H-13C com seleção de gradiente e aquisição não desacoplada (HMBCGPNDQF).
        NOTA: Esses experimentos foram realizados com o propósito de atribuição de D-manose, mas não são mostrados, pois a atribuição de deslocamento químico não está dentro do escopo deste estudo.
    3. Mapeamento da ligação do ligante por meio de perturbação de deslocamento químico (CSP) do ligante
      1. Para a preparação da amostra e aquisição dos espectros ¹H-¹³C HSQC, preparar uma solução 4 mM de D-manose em tampão fosfato de sódio (pH 7,4), com 50 mM de NaCl e 5% de D2O. Dividir a solução em duas amostras: uma com 80 μM de CVN e outra sem CVN (referência apenas de ligante).
        NOTA: Esses espectros serão usados para determinar o CSP de D-manose após a interação com CVN.
      2. Para a configuração dos parâmetrosde aquisição 1 H-13C HSQC, use a sequência de pulso padrão HSQCETGPSI (seleção de gradiente e sensibilidade aprimorada 1 H-13C HSQC). Defina os seguintes parâmetros para aquisição:
        Domínio do tempo (TD): 1024 × 128 pontos complexos (dimensões ¹H × ¹³C)
        Largura espectral (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) para ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) para ¹³C
        Frequências portadoras: 4,7 ppm para ¹H, 75 ppm para ¹³C
        - Número de varreduras: 448.
      3. Calcule o CSP usando a seguinte equação:
        figure-protocol-1
        onde figure-protocol-2 e figure-protocol-3 representam as diferenças de deslocamento químico entre D-manose na presença de CVN (Figura 1A, marcada em vermelho) e D-manose livre (Figura 1B).
    4. Mapeando a ligação do ligante por meio da diferença de transferência de saturação (STD)
      1. Crie um novo conjunto de dados e configure parâmetros para experimentos de RMN STD. Duas estratégias experimentais podem ser aplicadas: (i) triagem de diferentes frequências de saturação para otimizar a relação sinal-ruído; (ii) fixar a frequência de saturação e variar o tempo de saturação para avaliar o acúmulo.
      2. Configure experimentos de RMN 1D ¹H usando a sequência de pulso zgpr. Ajuste o espectrômetro para ¹H, execute o calço e meça um pulso forte de 90° (por exemplo, ~ 10 μs a -10.6 dB de atenuação, equivalente a ~ 11.482 W).
      3. Centralize a frequência portadora ¹H em aproximadamente 4.7 ppm, correspondendo ao sinal de água.
      4. Selecione a sequência de pulsos STDDIFFESGP.3 e configure os parâmetros de aquisição da seguinte forma:
        Defina a largura espectral de acordo com os requisitos da amostra.
        Defina o atraso de intervarredura (d1) para 4 s.
        Defina o tempo de saturação (d20) com base no experimento desejado.
        Carregue o FQ2LIST contendo a frequência de saturação fora da ressonância (-40 ppm) e as frequências na ressonância para saturar apenas o sinal da proteína.
        NOTA: As frequências de ressonância devem corresponder aos prótons de proteína e devem estar a pelo menos 1000 Hz de distância de qualquer sinal de ligante para evitar saturação direta.
      5. Teste as seguintes frequências de saturação por ressonância para determinar as condições ideais: -0,59 ppm, 0,73 ppm e 8,1 ppm (ver Figura 2A).
        NOTA: 0,73 ppm foi selecionado como frequência de saturação na ressonância, pois forneceu a melhor relação sinal-ruído. Utilizando essa frequência, o fator de amplificação de DST (ASTD) foi quantificado em função do tempo de saturação. Para isso, os espectros de STD foram adquiridos em diferentes tempos de saturação (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 4 s) para construir a curva de acúmulo de STD (Figura 2B). Os valores correspondentes deA STD foram então plotados em função do tempo de saturação (Figura 2C), permitindo a avaliação da eficiência da transferência de saturação, que é proporcional ao tempo e proximidade do ligante hidrogênio à proteína. Um fatorde DST é definido como:
        figure-protocol-4
        ISTD é a diferença na intensidade do sinal entre os espectros de ressonância e off, I0 é a intensidade do sinal no espectro de ressonância off, [L]T é a concentração total do ligante e [P] é a concentração de proteína. Essa normalização leva em conta os efeitos de concentração e permite a comparação entre diferentes condições experimentais. A DST depende da difusão de spin e do tombamento molecular lento para transferir com eficiência a saturação da proteína para o ligante ligado. Proteínas maiores (queda lenta) permitem saturação e disseminação mais eficientes da magnetização dentro da proteína 19,30,31,32.
      6. Defina o número de varreduras (ns) para 64 e calcule a média do experimento l4 (loop 4) vezes.
      7. Calcule o número total de varreduras como: Total de varreduras = ns × l4. Use 32.768 pontos complexos na dimensão direta (TD) com uma largura espectral (SW) de 10,0171 ppm (6.009,615 Hz).
      8. Defina o atraso entre varreduras (d1) para 4 s e o tempo de aquisição (AQ) para 2.7262976 s. O atraso total de relaxamento é igual a d1 + AQ.
      9. Configure o pulso de saturação da seguinte forma: duração 50 ms; forma gaussiana (p42); controlado através do programa moldado 9 (SP9).
      10. Use uma variante de sequência de pulso STD que inclua um filtro T1ρ para suprimir os sinais residuais de proteínas. Defina o tempo de bloqueio de rotação (d29) com base no peso molecular da proteína. Para proteínas maiores, use tempos de bloqueio de rotação menores (~ 20 ms) e para proteínas menores, maiores (> 40 ms).
        NOTA: Todos os espectros STD foram adquiridos em 599,93 MHz (BF1). O ajuste de d29 é fundamental para minimizar o fundo da proteína, preservando a integridade do sinal do ligante. Otimize esse parâmetro empiricamente, se necessário.
    5. Mapeamento da ligação do ligante via 1H-R2
      1. Selecione o programa de pulso CPMG_ESGP2D na biblioteca padrão Bruker. Esta sequência é baseada no experimento Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), incorporando escultura de excitação para supressão de água33.
      2. Defina o experimento como uma aquisição 2D.
        NOTA: Este é um experimento pseudo-2D no qual apenas a dimensão direta é usada para informações de deslocamento químico.
      3. Configure os parâmetros de aquisição da seguinte maneira:
        Domínio do tempo (TD): 32.768 pontos complexos na dimensão direta ¹H.
        (TD1): 2 pontos.
        Largura espectral (SW): 7,9932 ppm (4.795,396 Hz).
        Atraso de intervarredura (d1): 4 s.
        Frequência portadora (o1): 4,7 ppm (centrado no sinal de água).
        Número de varreduras (ns): 8.
        Número de digitalizações fictícias (ds): 4.
        Atraso da CPMG (d20): ≤1 ms (ou seja, menor que 1⁄3 J_HH).
        Número de médias (TDav): 200.
      4. Execute o experimento por 200 ciclos de 8 varreduras cada, resultando em um acúmulo total de 1.600 varreduras. Ajustar a lista de contadores de variáveis (vclist) de acordo com o tempo total desejado do ciclo CPMG (TCPMG). Aqui, 2 ciclos foram escolhidos para um TCPMG = 8 ms e 200 ciclos foram escolhidos para um TCPMG = 800 ms.
      5. Execute dois experimentos de 1H-CPMG, um para a amostra contendo a proteína (4 mM de D-manose e 80 μM de CVN) e outro para a D-manose livre (4 mM de D-manose).
      6. Plote os espectros de 1H para cada TCPMGatravés do comando efp (multiplicação exponencial seguida de transformada de Fourier e correção de fase) ou sinm (multiplicação senoidal deslocada em 90°, SSB=2) seguido de fp (transformada de Fourier e correção de fase). Ajuste a função da janela de acordo com a melhor estratégia de processamento.
        NOTA: Neste experimento foram utilizados sinm e fp. A1ª série será o espectro com um TCPMG de 8 ms (primeiro na vclist), e a2ª série será de 800 ms (segunda na vclist). Os espectros 1H processados são representados na Figura 3.
      7. Calcule o quociente CPMG (Q) por meio da equação 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Experimentos baseados em proteínas
    1. Preparação da amostra
      1. Prepare 600 μL de uma amostra contendo 436 μM uniformemente 15CVN marcado com N em tampão fosfato de sódio (pH 7,4) suplementado com 50 mM de NaCl e 5% de óxido de deutério (D2O). Titular a D-manose na amostra até uma concentração final de 60 mM. Para a titulação, use um tubo de RMN de 5 mm.
    2. Atribuição de ressonância (etapa de validação opcional)
      1. Confirmar a atribuição de CVN livre em solução utilizando os valores de desvio químico previamente comunicados34. Adquira os seguintes espectros de ressonância tripla: HNCO, HNCA, HNCACB e CBCACONH 35,36,37.
        NOTA: Esses experimentos servem apenas para validar a atribuição e não são mostrados, pois a atribuição de deslocamento químico não é o objetivo principal deste protocolo.
    3. Mapeando a ligação de D-manose em CVN por perturbação de deslocamento químico da proteína
      1. Adquira 1espectro H-15N HSQC de 15CVN marcado com N a 298 K. Realize uma titulação adicionando D-manose para atingir as seguintes concentrações finais: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 60 mM.
      2. Configure o experimento 1 H-15N Fast-HSQC usando a sequência de pulso de FHSQCF3GPPH sensível à fase da biblioteca padrão Bruker. Use os seguintes parâmetros:
        Domínio do tempo (TD): 1024 × 140 pontos complexos nas dimensões 1H e 15N.
        Largura espectral (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) na dimensão 1H e 34 ppm (2067,119 Hz) na dimensão 15N.
        Frequência portadora: 4,7 ppm (1H) e 119 ppm (15N).
        Número de varreduras: 128.
      3. Calcular a perturbação do desvio químico (Δδ) utilizando a seguinte equação:
        figure-protocol-6
        onde figure-protocol-7 e figure-protocol-8 são as diferenças de deslocamento químico entre o CVN na presença e ausência de D-manose (Figura 4A).
        NOTA: O fator 10 é responsável pela diferença nas larguras espectrais entre as dimensões do próton e do nitrogênio.
      4. Calcular a constante de dissociação (KD) traçando os valores de CSP para cada resíduo em função da concentração de D-manose. Ajuste os dados resultantes a uma isoterma de ligação de sítio único usando a seguinte equação (5).
        figure-protocol-9Equação 5
        onde [PT] é a concentração de proteína usada na titulação (CVN), [PT] é a concentração do ligante (D-manose) e CSPmax é o CSP na concentração de saturação do ligante e CSPmin na ausência do ligante.
    4. Mapeando a ligação de D-manose à CVN através da posição 15N-R2 da proteína.
      1. Medir os 15valores N-R2 dos resíduos individuais de CVN na ausência e presença de 60 mM de D-manose. Realize todos os experimentos a 298 K.
      2. Configure o experimento 15N-R2 usando a sequência de pulso baseada em CPMG sensível à fase HSQCT2ETF3GPSI3D da biblioteca padrão Bruker. Use os seguintes parâmetros:
        Domínio do tempo (TD): 1024 × 128 pontos complexos nas dimensões 1H e 15N, com 8 pontos na pseudodimensão.
        Largura espectral (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Hz) e 34 ppm (15N; 2067,119 Hz).
        Frequência portadora: 4,7 ppm (1H) e 119 ppm (15N).
        Número de varreduras: 32. (v) Lista de contadores variáveis: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 e 7, correspondendo a atrasos de relaxamento (relaxamento T) de 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 e 118,72 ms, respectivamente.
      3. Processe os espectros pseudo3D como uma série de espectros de relaxamento de correlação 1H/15N semelhantes a HSQC usando NMRPipe38, seguindo o tutorial do software (consulte a Tabela de Materiais para obter um link para o tutorial).
      4. Importe os espectros processados para uma plataforma de análise de RMN adequada (por exemplo, CCPNMR39). Selecione todos os espectros e aplique a ferramenta "Seguir mudanças de intensidade". Plote a intensidade de cada pico cruzado em função dorelaxamento de T e ajuste o decaimento a uma função monoexponencial para extrair 15valores N-R2 para cada resíduo.
      5. Calcule o erro experimental a partir da relação sinal-ruído dos espectros do tipo HSQC a 67,84 ms. Processe uma região do espectro contendo apenas ruído e converta-a em um arquivo de texto usando o seguinte comando:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Determine o desvio padrão da região de ruído usando software estatístico (por exemplo, Origin (Pro), versão 2021). Defina esse valor como a intensidade do ruído Iruído.
      7. Calcular o erro experimental para cada resíduo utilizando a seguinte equação:
        figure-protocol-10
        NOTA: É importante usar o erro experimental em vez do erro de ajuste. O erro experimental define os limites de interpretação ao comparar os 15N-R2 na ausência e presença de D-manose.

figure-protocol-11
Figura 1: Perturbação de deslocamento químico da D-manose na presença de CVN. (A) 1Espectro H-13C-HSQC da D-manose na presença de CVN. (B) 1espectro H-13C-HSQC de D-manose livre. Os rótulos nos espectros mostram cada uma das atribuições de deslocamento químico e a respectiva configuração anomérica (α ou β). Os rótulos em vermelho são aqueles atribuídos à conformação vinculada e os em preto são aqueles atribuídos à conformação livre. (C) Sobreposição dos espectros 1 H-13C-HSQC na presença (verde) e ausência (azul) de CVN. (D) Estrutura química da α e β-D-manose destacando o CSP observado, que foi calculado de acordo com a equação (1). Os valores CSP são representados abaixo dos círculos verdes. O círculo vermelho representa o hidrogênio β-anomérico que desapareceu na presença de CVN. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Espectros de diferença de transferência de saturação (STD) de D-manose na presença de CVN. (A) DSTs adquiridas em diferentes frequências de saturação: -0,59, 0,73 e 8,1 ppm. (B) DST adquirida em diferentes tempos de saturação: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 e 4 s. (C) Fator de amplificação de DST (DST A) calculado de acordo com a equação 2 em função do tempo de saturação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: 1H-R2 de D-manose na presença e ausência de CVN. (A) Representação dos espectros de D-manose 1H-CPMG esperados para um ligante e um não ligante adquiridos com tempos de relaxamento R2 de 8 e 800 ms na ausência (inferior) e presença (superior) de CVN. Q foi calculado de acordo com a equação 3. Na ausência de interação (Q ≈ 1), as intensidades de sinal permanecem semelhantes em ambos os tempos de relaxamento do ligante com ou sem a proteína. Após a ligação (Q < 1), as intensidades de sinal diminuem com o aumento do relaxamento para a amostra que contém a proteína. (B) Representação esquemática da troca química entre os estados livre e ligado de D-manose. Dependendo dos valores relativos da diferença de deslocamento químico (Δω) e da constante de taxa de câmbio (kex = kon + koff), o sistema cai em regimes de troca lentos, intermediários ou rápidos. (C)1H RMN de D-manose livre e D-manose na presença de CVN, mostrando diferenças nas intensidades de sinal em tempos de relaxamento de 8 ms e 800 ms. Os fatores Q calculados para hidrogênios específicos (H6β, H3β, H5α, H4β) são mostrados, com valores Q mais baixos indicando interações mais fortes com CVN e identificando as regiões do açúcar envolvidas na ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise de perturbação de deslocamento químico (CSP) revelando resíduos de CVN envolvidos na ligação de D-manose. (A) Gráficos de barras mostrando os CSPs de VCN de amida de backbone (15 N-1H) após titulação com D-manose em concentrações de 10 mM (superior) e 60 mM (inferior). As linhas horizontais indicam a média do CSP mais um ou dois desvios-padrão (av + sd, av + 2 sd), que foram usados como limiares para identificar resíduos significativamente perturbados. (B) Mapeamento de resíduos significativamente perturbados na estrutura do CVN complexado com o dissacarídeo Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Os resíduos com CSPs acima do limite av + 2 sd são destacados em vermelho, e aqueles entre av + sd e av + 2 sd são mostrados em azul. As moléculas de dissacarídeo Manα1-2Manα são exibidas em laranja para indicar sua localização de ligação. (C) Curvas de ligação selecionadas representando CSPs em função da concentração de D-manose. Os dados foram ajustados de acordo com a equação 5 como um modelo de ligação de sítio único para estimar KD, revelando uma gama de afinidades, com D44 mostrando a interação mais forte (KD = 1,1 ± 0,35 mM) e E41 a mais fraca (KD = 35 ± 29 mM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Análise de 15N-R2 para CVN livre e ligado à D-manose. (A, B) Taxas de relaxação transversal (15N-R2) medidas para cada resíduo de CVN nos seus estados (A) livre e (B) ligado à D-manose. (C) Diferença nos valores de R2 (ΔR2 = R2ligado − R2livre) plotado por resíduo. As linhas azul e vermelha representam um e dois desvios padrão da média (av ± sd e av ± 2 sd), respectivamente. Os resíduos com valores significativos de ΔR2 são rotulados. (D) Mapeamento dos valores de ΔR2 para a estrutura do CVN complexado com o dissacarídeo Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Os resíduos com ΔR2 acima ou abaixo de av± 2 sd são mostrados em vermelho; Aqueles entre AV± SD e AV± 2 SD são mostrados em azul. As moléculas de D-manose são exibidas em laranja para indicar sua localização de ligação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

No presente trabalho, apresentamos experimentos de RMN para investigar as interações proteína-glicano. O reconhecimento molecular de proteína-glicano está subjacente a vários processos biológicos envolvendo a matriz extracelular (MEC), incluindo a regulação da adesão celular, migração, proliferação e várias outras formas de comunicação celular.

Aqui, optamos por trabalhar com o monossacarídeo D-manose, que é descrito como um aglutinante fraco. O objetivo foi descrever métodos para medir intera...

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Discussão

A espectroscopia de RMN representa uma abordagem versátil para investigar interações proteína-glicano, particularmente devido à sua capacidade de detectar interações fracas e transitórias, como as observadas entre CVN e D-manose. O protocolo descrito aqui combina métodos de RMN baseados em ligantes e proteínas, permitindo uma caracterização mais abrangente da interface de interação.

As etapas críticas do protocolo incluem a preparação cuidadosa da amostra com ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Agradecimentos

Agradecemos ao Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) pelo uso dos espectrômetros de RMN. Somos gratos à Dra. Carole Bewley por compartilhar conosco as atribuições de deslocamento químico da CVN em complexo com Manα1-2Manα. Agradecemos também às agências de fomento FAPERJ e CNPq.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Glicose 13CLaboratório Isotópico de Cambrige.CLM-481
Cloreto de amônio 15NLaboratório Isotópico de Cambrige.NLM-467
Cloreto de cálcioSigma-AldrichC4901
Coquetel inibe a proteaseSigma-Aldrich4693159001
D2OLaboratório Isotópico de Cambrige.DLM-4
D-manoseSigma-AldrichM2069-5G
Cloreto de magnésioSigma-AldrichM8266
NMRPipeLink para o tutorial do software: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Cloreto de potássio (K2HPO4)Sigma-AldrichPág. 3786
Cloreto de potássio (KCl)Sigma-AldrichPág. 3911
Cloreto de potássio (KH2PO4)Sigma-AldrichPág. 0662
Tubo ShigemiBrukerZ1Z10684A
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS9625
Fosfato de sódio (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Fosfato de sódio (NaH2PO4)Sigma-AldrichS97263
Espectrômetro Bruker 600 MHzBruker
Espectrômetro Bruker 800 MHzBruker
TiaminaSigma-AldrichT1270
Sonda TXI de ressonância triplaBruker
TriptonaSigma-Aldrich93657
Extrato de leveduraSigma-AldrichY1625

Referências

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

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