Method Article

Papel Protetor Ósseo do Bupleurum em um Modelo de Rato de Osteoporose Pós-Menopausa

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neste estudo, usamos um modelo de rato ovariectomizado de osteoporose pós-menopausa para demonstrar que o líquido oral de Bupleurum (Chai hu) melhora a microestrutura óssea, suprimindo os fatores pró-inflamatórios e aumentando os anti-inflamatórios. Isso sugere que seu mecanismo anti-inflamatório atenua parcialmente a osteoporose induzida por deficiência de estrogênio.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo tem como objetivo investigar os efeitos da administração de Chai hu na osteoporose pós-menopausa em ratas ovariectomizadas (OVX). Ratas Sprague-Dawley com oito semanas de idade foram submetidas à ovariectomia bilateral usando a abordagem dorsal para estabelecer um modelo de osteoporose pós-menopausa. Diferentes doses de Chai hu líquido oral foram administradas por gavagem oral por 12 semanas consecutivas, seguidas de avaliações da microestrutura óssea e medidas dos níveis de citocinas inflamatórias. O tratamento com Chai hu em doses médias e altas inibiu parcialmente a perda óssea, reduziu a expressão de citocinas pró-inflamatórias e aumentou os níveis de citocinas anti-inflamatórias em ratos OVX. Houve uma redução significativa na gravidade da destruição óssea de doses baixas para altas, e foram observadas melhorias relacionadas à dose na reconstrução microestrutural óssea. Chai hu mitigou a perda óssea induzida por deficiência de estrogênio e a deterioração microestrutural, suprimindo assim a progressão da OP neste modelo OVX. Isso provavelmente resultou dos efeitos anti-inflamatórios das vias envolvidas.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A osteoporose (PO) é uma doença óssea metabólica comum caracterizada por diminuição da massa óssea, redução da resistência óssea e destruição da microarquitetura óssea1. A PO pode se manifestar como primária ou secundária, e a PO primária é classificada como PO pós-menopausa (POM), PO senil e PO idiopática (que geralmente ocorre em adolescentes). Entre eles, a PMOP tipo I ocorre principalmente em mulheres PM, onde há uma diminuição acentuada na densidade óssea após a menopausa devido à redução dos níveis circulantes de estrogênio2. É uma doença óssea metabólica sistêmica, que resulta em aumento da atividade dos osteoclastos e intensa diferenciação3. Além disso, a intensidade da reabsorção óssea é muito maior do que sua formação, resultando em diminuição da massa óssea, bem como aumento da fragilidade óssea e risco de fratura4.

Pesquisas atuais descobriram que muitas doenças inflamatórias crônicas, como osteoartrite e periodontite, estão associadas a perda óssea significativa, sugerindo que a inflamação pode estar intimamente relacionada à OP5. À medida que as mulheres PM envelhecem, além das alterações endócrinas, as funções fisiológicas e imunológicas diminuem e o corpo fica em estado de inflamação crônica por longos períodos de tempo. Muitos desses fatores promotores de inflamação e citocinas derivadas de células T desempenham papéis importantes na perda óssea. Portanto, a PMOP também é reconhecida como uma doença inflamatória crônica 6,7.

A medicina tradicional chinesa (MTC) tem uma longa história e rica experiência clínica na prevenção e tratamento da PMOP, com foco no manejo holístico e diagnóstico e tratamento individualizados, e pode regular os sistemas endócrino e imunológico ao mesmo tempo, o que é uma bênção para as mulheres na pós-menopausa8. Permite que uma grande proporção de mulheres tenha acesso a tratamento médico. Estudos farmacológicos modernos e ensaios clínicos mostraram que a MTC tem as vantagens de multidirecionamento, baixa toxicidade e efeitos colaterais, e é barata. O risco de complicações pode ser bastante reduzido no tratamento da MTC da PMOP9.

O próprio Chai hu tem propriedades anti-inflamatórias10 e antidepressivas11, e pode regular a secreção hormonal no corpo12 , além de ajudar na boa saúde13. Chai hu é o principal ingrediente que desempenha um papel importante na fórmula do composto TCM, Xiaoyao Pills, que tem o efeito de acalmar as emoções, promover a digestão e a absorção no estômago e nos intestinos. Também é conhecido por repor o qi e a energia sanguínea, bem como regular os sintomas do ciclo menstrual e seu desconforto associado. O principal constituinte do Chai hu é a saponina Chai hu, que possui forte atividade anti-inflamatória, manifestada principalmente na inibição da expressão de citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 1β e IL-615. Além disso, aumenta a expressão da citocina anti-inflamatória, IL-10, aliviando assim a inflamação, como colite, endometrite e hepatite16.

Em comparação com os tratamentos OP padrão (incluindo o uso de bifosfonatos17, moduladores seletivos do receptor de estrogênio18 e denosumabe19), o Chai hu, como uma MTC comumente usada, tem a vantagem potencial de um mecanismo de ação multicomponente e multialvo. As terapias padrão geralmente visam vias metabólicas ósseas específicas20 (inibição da atividade dos osteoclastos), que podem estar associadas a certos efeitos colaterais, como desconforto gastrointestinal, aumento do risco de osteonecrose dos maxilares e sintomas semelhantes aos da gripe, bem como altos custos de medicamentos a longo prazo21.

Uma revisão da literatura relevante descobriu que o uso de Chai hu para intervir em ratos PM com PO pode ter efeitos terapêuticos de alívio22. Assim, com base em bioinformática e análise farmacológica, bem como simulação de docking molecular para prever locais de docking23, levantamos a hipótese de que Chai hu poderia intervir no processo inflamatório, modular o estado imunológico do corpo e restaurar a homeostase imune óssea. Estes favorecerão a estabilidade do estado de reconstrução óssea e alcançarão o efeito terapêutico desejado de aliviar a PO.

Este estudo empregou a administração de Chai hu líquido oral (concentração: 1 g/mL) durante 12 semanas consecutivas. O regime posológico foi desenhado com base em doses clinicamente comuns em estudos de MTC e farmacocinética24.

O objetivo geral deste método de administração é estabelecer um protocolo de dosagem estável e clinicamente relevante, avaliando sistematicamente o efeito de intervenção sustentada de Chai hu no modelo alvo (um modelo de rato de osteoporose pós-menopausa). Essa abordagem de administração garante que o medicamento mantenha a concentração plasmática eficaz durante todo o período experimental, fornecendo uma base de intervenção confiável para avaliações subsequentes (como indicadores do metabolismo ósseo e níveis de fatores inflamatórios). Além disso, ajuda a esclarecer o papel do Chai hu em doenças relacionadas, bem como sua relação dose-efeito, ao mesmo tempo em que oferece um paradigma de referência para a administração padronizada de medicamentos tradicionais chineses em pesquisas experimentais.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais foram conduzidos de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (8ª edição) e foram especificamente aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade Médica de Youjiang para Nacionalidades (Aprovação nº 2024071001).

1. Analisando a farmacologia da rede

NOTA: A ciberfarmacologia é uma abordagem que combina biologia de sistemas, biologia computacional e farmacologia e visa compreender o mecanismo de ação dos fármacos e das interações fármaco-fármacas por meio da análise de redes biomoleculares25.

  1. Rastreie compostos ativos com boa biodisponibilidade oral (OB) e semelhança com drogas (DL) usando ferramentas como o Banco de Dados e Análise de Farmacologia de Sistemas de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Defina o OB em ≥30% e o DL em ≥0,1826. Pesquise Chai hu e clique em Detalhes da erva e baixe todos os dados compostos. Nomeie o arquivo baixado Chaihu.
  2. Obtenha o nome de destino do ingrediente principal colando o ID MOL do ingrediente principal no banco de dados TCMSP. Cole na pesquisa em lote TCMSP e selecione Previsão de destino e clique em Enviar.
  3. Abra o banco de dados UniProtsh, copie a coluna Nome do Alvo para a pesquisa e encontre o nome da proteína em negrito, que é exatamente o mesmo que o nome da proteína alvo colada. Depois de encontrar o nome da proteína correspondente, colete os nomes dos genes correspondentes na coluna após ele.
  4. Filtre os genes relacionados à osteoporose no banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org) de acordo com a pontuação de relevância ≥ 1 e obtenha todos os (5741) genes27.
    NOTA: As razões para a seleção de genes com uma pontuação de relevância ≥ 1 do banco de dados GeneCards são as seguintes: Uma pontuação ≥ 1 indica que o gene tem associações documentadas com a doença-alvo, distinguindo-o claramente dos genes sem associações relatadas (pontuação = 0). Esse limite garante a retenção de genes com relevância credível para a doença, evitando a interferência excessiva de genes não relacionados. Um limiar mais baixo (<1) pode incluir genes sem associações validadas, aumentando assim os falsos positivos.
  5. Obtenha os genes que se cruzam após combinar conjuntos de genes relacionados a doenças com alvos de drogas para interseção. Com base nas interações entre alvos de doenças e ingredientes ativos de medicamentos, construa uma rede de interseção de medicamentos tradicionais chineses-ingrediente ativo-alvo-doença usando o software Cytoscape.
  6. Obtenha informações de interação proteína-proteína (PPI) por meio do banco de dados String (https://cn.string-db.org/) e construa uma rede PPI. Abra o Cytoscape (https://www.cytoscape.org), carregue o arquivo TSV baixado na rede de carregamento, selecione Calcular > TOP10 ou TOP20 e clique em Enviar.
  7. Crie duas tabelas para importar para o Cytoscape. Crie um arquivo de planilha eletrônica chamado Rede. Na coluna A, insira os mesmos IDs MOL (CH1, CH2...) que foram substituídos pela abreviatura da medicina tradicional chinesa. Rotule a coluna B como ID do MOL e classifique-a em ordem crescente por IDs do MOL. Rotule a coluna C como símbolo. Copie IDs de componentes (MOL IDs) e nomes de genes de arquivos relacionados a Chaihu nas colunas B e C, respectivamente. Em seguida, exclua a Coluna B e renomeie a Coluna A como MOL ID.
  8. Estenda a tabela até o final do texto. Na coluna Símbolo, insira os IDs MOL (CH1, CH2...), substituídos pela abreviatura da medicina tradicional chinesa. Na coluna MOL ID, insira a abreviatura da medicina tradicional chinesa: CH. Com as etapas acima, a suplementação de informações e a construção da rede Medicina Tradicional Chinesa - Componente - Alvo é concluída.
  9. Em seguida, faça o segundo formulário, o arquivo TYPE. Crie uma nova planilha e nomeie-a como TYPE. Rotule a coluna A como Termo e a coluna B como TIPO. Copie o nome do gene para a coluna de termos e atribua-lhe o atributo do gene na coluna de tipo (o objetivo é procurar o gene; todos os nomes dos genes serão selecionados, para que seja fácil de operar). Insira os ingredientes na coluna Termo e dê ao ingrediente o atributo drug1.
  10. Importe para o software Cytoscape. Importar rede para carregar o arquivo de rede e importar tabela para carregar o arquivo de tipo. Na caixa de pesquisa, digite gene, pressione Enter, para que todos os genes sejam selecionados, puxe os genes selecionados para a esquerda e clique em Layout > Attribute() > Selecionado (escolha redondo ou quadrado entre parênteses).
  11. Combine os resultados da análise de farmacologia de rede com dados experimentais para identificar os principais compostos e mecanismos moleculares de ação do medicamento.

2. Acoplamento molecular

NOTA: O docking molecular é uma técnica computacional para prever o modo de ligação ideal e a afinidade entre uma pequena molécula (ligante) e uma proteína ou biomolécula alvo28.

  1. Preparação de receptores e ligantes
    1. Fonte do receptor (proteína): Obtenha o arquivo PDB das proteínas-alvo do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). Pesquise 3Q4B (exemplo de receptor de IL-6), clique em Baixar arquivos > formato PDB.
    2. Remova moléculas de água cristalográficas clicando em Editar > Excluir > Água, íons estranhos e ligantes não essenciais (reter cofatores críticos como íons metálicos) clicando em Editar > Excluir > Heteroátomos. Adicione átomos de hidrogênio ausentes clicando em Editar > Hidrogênios > Adicionar. Salvar como proteína.pdbqt. clicando em Editar > Cargas > Calcular Gasteiger e, em seguida, em Grade > Macromolécula > Escolher > Salvar como PDBQT.
    3. Fonte de ligante (molécula pequena): Baixe a estrutura do ligante do PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Pesquise Saikosaponin A (CID:6443568), clique em 3D Conformer > Baixar SDF.
    4. Use o software Open Babel para converter o arquivo Saikosaponin A no formato SDF em um arquivo de formato PDB com conformações tridimensionais de baixa energia e nomeie-o como saikosaponinA.
  2. Configuração do parâmetro de encaixe (ferramentas do AutoDock)
    1. Arquivos de receptor de carga e ligante. Importe o arquivo de molécula pequena saicosaponina A e salve-o como um arquivo PDBQT. Em seguida, carregue o receptor e o ligante: clique em Docking > Macromolecule > Open, selecione IL6_receptor.pdbqt; em seguida, clique em Acoplamento > Ligante > Abrir, selecione saikosaponinA.pdbqt.
    2. Configure a caixa de grade: Clique em Grade > Caixa de grade, ajuste o tamanho da caixa para abranger totalmente o site ativo (use o botão de controle no painel esquerdo para ajustar) e salve as configurações atuais clicando em Arquivo > Fechar Salvando Atual e nomeie o arquivo grid.gpf.
    3. Configurar o programa em execução do AutoGrid: Clique em Executar AutoGrid, selecione o arquivo grid.gpf e clique em Iniciar. Em seguida, configure os parâmetros de encaixe: Em sequência, no menu Encaixe, clique em Macromolécula e selecione o arquivo de proteína IL6_receptor.pdbqt; clique em Ligante e selecione o arquivo de molécula pequena saicosaponina A.pdbqt; definir o Algoritmo Genético e confirmá-lo; ajuste os parâmetros de encaixe e confirme-os. Por fim, em Saída, selecione o algoritmo Lamarckian (4,2), nomeie o arquivo dock.dpf e salve-o.
    4. Execute o AutoGrid e salve os resultados: Clique em Executar AutoDock, selecione o arquivo dock.dpf e inicie a simulação. Após a conclusão, clique em Gravar Complexo, nomeie a estrutura complexa e salve-a no formato PDBQT.
  3. Análise de resultados usando PyMOL
    1. Converta o arquivo de formato PDBQT obtido na etapa anterior de encaixe molecular para o formato PDB usando o software Open Babel. Em seguida, importe o arquivo de formato PDB para o software PyMOL para operações de visualização subsequentes.
    2. Localize o ligante e separe-o individualmente: Depois de selecionar o ligante, altere sua cor clicando em Sele e, em seguida, escolhendo uma Cor de Cor. Na coluna Sele, clique em Extrair objeto em Ação para extrair o ligante como um novo objeto independente.
    3. Medição da distância da ligação de hidrogênio: Na coluna sele, clique em Ação, encontre Contatos polares e clique em Para outros átomos no objeto; As ligações de hidrogênio serão exibidas como linhas amarelas. Clique na opção Medição na coluna Assistente, clique em Átomos em ambas as extremidades da ligação de hidrogênio em sequência e clique em Concluído para concluir a medição.
  4. Exportar a imagem: clique em Exportar imagem como PNG em Arquivo. Se a renderização de alta definição for necessária, insira ray 300 (pixels ajustáveis) e pressione Enter.

3. Análise de micro-CT

  1. Injete ratos SD fêmeas (32 semanas de idade, 320-350 g) por via intraperitoneal com pentobarbital sódico (40 mg / kg) para anestesia profunda, confirmada pela ausência de reflexo da córnea (sem piscar ao toque do cotonete) e reflexo da dor (sem contração dos membros posteriores ao pinçamento do fórceps).
    1. Realize a cirurgia de isolamento dos membros posteriores. Eutanasiar os ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico na dose 3-5 vezes a dose de anestésico cirúrgico (40 mg/kg), colocá-los em decúbito dorsal e fazer uma incisão transversal de 3 cm, 1 cm acima da sínfise púbica ao longo do ligamento inguinal. Dissecar sem rodeios o espaço entre os músculos grácil e sartório para expor a artéria femoral (estrutura tubular pulsátil). Ligue ambas as extremidades da artéria femoral usando suturas 4-0, deixando uma seção não ligada no meio, antes de truncar o vaso com tesoura oftálmica e seccioná-lo.
    2. Gire o membro inferior internamente para deslocar a cabeça femoral do acetábulo e corte a cápsula articular e o ligamento redondo, preservando a integridade da cabeça femoral. Mergulhe o membro posterior intacto em solução salina pré-resfriada e, em seguida, fixe em solução de formaldeído a 4% por 24-48 h.
  2. Configuração de imagem: Entregue o fêmur fixo à instalação para microtomografia computadorizada. Ligue o dispositivo Micro-CT e selecione o programa predefinido Small Animal Bone Scanning . Use os seguintes parâmetros de varredura: Tensão de raios X = 90 kV, Corrente de raios X = 80 μA, Campo de visão (FOV) = 36 mm, Tamanho do pixel = 72,0 μm, Rotação = 360°, Duração da varredura = 14 min.
  3. Coloque o fêmur da perna esquerda do rato fixo no porta-amostras, fixe a epífise femoral a ser fotografada, ligue o dispositivo e aguarde a conclusão do autoteste da máquina. Inicie uma varredura de visualização (varredura rápida de baixa resolução) para confirmar se a amostra está centralizada e, em seguida, ajuste a região de interesse para cobrir todo o fêmur.
  4. Quando a digitalização e a fotografia estiverem concluídas, a fonte de luz de raios-X será desligada automaticamente. Neste momento, o valor da radiação dentro da máquina excede o padrão e é absolutamente proibido retirar a amostra sem equipamento de proteção.
  5. Análise de imagem: Analise os parâmetros ósseos (densidade mineral óssea [DMO], número trabecular) usando o software integrado do scanner. Salve e exporte imagens reconstruídas para avaliação posterior.

4. PCR quantitativo em tempo real para extração de RNA de tecido ósseo de rato

  1. Remova os músculos aderentes e a fáscia do fêmur direito. Corte 100-200 mg de tecido ósseo em pedaços pequenos. Adicione 2-3 esferas de moagem e 500 μL de tampão de extração de RNA. Homogeneizar com um triturador de lenços de papel a 70 Hz durante 5 min a 4 °C.
  2. Separação de fases: Após a centrifugação, a solução se separa em uma fase aquosa superior (contém RNA) e um precipitado escuro inferior (contém proteínas, DNA e polissacarídeos). Transfira cuidadosamente 500 μL do sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL sem RNase.
  3. Processar a solução superior obtida do isolamento para extração de RNA total de acordo com as instruções do fabricante.
  4. Depois de adicionar isopropanol à solução de lise, inverta suavemente o tubo para misturar a solução e deixe-o repousar em temperatura ambiente por 10 min. Execute uma verificação visual neste ponto; se forem observados precipitados de RNA floculante branco (aderidos à parede do tubo), isso indica que o RNA foi efetivamente precipitado.
  5. Use uma ponta de pipeta de 200 μL para aspirar o líquido residual. Reter o pellet de RNA branco no fundo/parede do tubo. Ressuspenda o RNA em 50-100 μL de água livre de RNase e armazene a -80 °C.
  6. Misture 2 μL de molde de RNA, 10 μL de master mix, 2 μL de DNase e 5 μL de água livre de nuclease em um tubo livre de nuclease. Misture delicadamente pipetando.
  7. Incubar a 37 °C durante 2 min para remover a contaminação do ADN genómico. Incubar a 55 °C durante 15 min. No final da reação, incubar a 85 °C durante 5 min para abortar a reação.
  8. Configure o sistema de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real colocando o DNA transcrito inversamente no gelo. Pré-misture todos os componentes: 10 μL de qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox), 0,4 μL de Forward Primer e Reverse Primer e 8,2 μL de água livre de RNase, divida e adicione 1μL de DNA, manipule no gelo e proteja da luz.
  9. Execute o programa qPCR da seguinte forma: Pré-desnaturação a 95 °C por 5 min, 1 ciclo seguido de desnaturação a 95 °C por 10 s por 40 ciclos. Realize recozimento, extensão, aquisição de fluorescência a 60 °C por 30 s por 40 ciclos no canal SYBR Green. Obtenha uma curva de fusão para temperatura de 65-95 °C com incremento de 0,5 °C/passo e 5 s/passo. Os primers utilizados são fornecidos na Tabela 1.

5. Preparação animal

  1. Obter 48 ratas nulíparas fêmeas (grau SPF, com 8 semanas de idade, peso corporal 200-220 g).
  2. Antes dos procedimentos experimentais, aclimatar todos os ratos com um período de quarentena de 7 dias em uma instalação de isolamento de grau SPF e alojar em um ambiente de laboratório controlado por FPS (temperatura: 22-24 °C, umidade: 45%-55%).

6. Preparação do medicamento de teste

  1. Obtenha o líquido oral Chai hu (Aprovação Nacional de Produto Médico da China nº Z41021539). A formulação contém Chai hu (fonte do norte) como ingrediente ativo, com excipientes, incluindo agente aromatizante, sacarose e propilenoglicol. Cada frasco para injetáveis de 10 ml contém um extrato equivalente a 10 g de erva bruta.

7. Preparação do modelo de rata ovariectomizada

  1. Preparo pré-operatório: Ratos rápidos por 12 h com acesso ad libitum à água. Realize a esterilização do instrumento autoclavagem de todas as ferramentas cirúrgicas.
  2. Anestesia e preparação: Administrar pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal (40 mg/kg). Verifique a profundidade da anestesia avaliando a ausência do reflexo da córnea (sem piscar ao toque da córnea com cotonete) e a ausência do reflexo de pinçamento do dedo do pé (sem retração do membro posterior no pinçamento). Após 15-20 min, raspe o local da cirurgia, desinfete com iodo e cubra com um campo fenestrado. Aplique pomada ocular de vitamina A (contendo 15.000 UI / g) durante a operação para evitar que os olhos do animal sequem (Tabela 2).
  3. Modelo de rato ovariectomizado: Realize a cirurgia em uma sala de cirurgia estéril dedicada. Todo o pessoal usava aventais de isolamento completos. Limpe a bancada e o equipamento ao redor com etanol a 75% (Tabela 2) antes da cirurgia e acenda as lâmpadas ultravioleta por pelo menos 30 minutos para eliminar micróbios no ar e nas superfícies.
    1. Faça uma incisão de 1 cm na pele dorsal, disseque sem rodeios o tecido subcutâneo, aperte a camada muscular e faça uma incisão de 1 cm. Localize a almofada de gordura e exteriorize-a para identificar o ovário (de cor vermelha brilhante). Ligue a trompa de Falópio com sutura 4-0, excise o tecido ovariano e coloque-o em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo paraformaldeído a 4% (Tabela 2).
  4. Fechamento e desinfecção da ferida: Polvilhe pó de penicilina na ferida antes da sutura. Suturar a camada muscular com sutura não absorvível nº 6 e fechar a pele com sutura nº 2. Desinfete a incisão fechada com iodo e aplique penicilina tópica em pó.
  5. Cuidados pós-operatórios: Coloque os ratos em gaiolas frescas com garrafas de água morna e toalhas para manter a temperatura corporal. Animais rápidos (água permitida) por 24 h após a cirurgia para evitar obstrução intestinal. Aplique o pó de penicilina no local da incisão diariamente por 3 dias consecutivos.
    1. Injete lidocaína (concentração de 1% a 2%, máximo de 5 mg/kg) ao redor da incisão cirúrgica para reduzir a dor pós-operatória imediata. Forneça analgesia contínua por 3-5 dias, reduzindo a dose gradualmente com base na gravidade da dor para evitar a descontinuação abrupta.
    2. Mantenha o animal em posição lateral ou de cabeça para baixo antes de acordar para evitar queda de língua e obstrução das vias aéreas; permitem um posicionamento autônomo e confortável após acordar. Isole os animais pós-operatórios dos demais até a recuperação total para evitar brigas ou infecções cruzadas (Figura 1).

8. Agrupamento experimental e administração de medicamentos

  1. Alocação de grupo: Divida um total de 40 ratos SD em cinco grupos (n = 8 por grupo), a saber, controle normal, controle de modelo, Chai hu de baixa concentração, Chai hu de concentração média e Chai hu de alta concentração.
  2. Para o grupo de dose média (5 mL / kg), selecione a dosagem com base nas diretrizes encontradas em 29,30. Siga uma proporção de gradiente de concentração de 1:2:4 para o grupo de baixa concentração: 2,5 mL/kg, grupo de concentração média: 5 mL/kg e grupo de alta concentração: 10 mL/kg.
  3. Administração do medicamento: Use gavagem oral e administre o medicamento uma vez ao dia. Para o grupo controle normal e o grupo controle modelo (animais submetidos à ovariectomia bilateral), realizar gavagem oral com igual quantidade de solução salina. Inicie o tratamento na semana 1 após a cirurgia e continue por 12 semanas.

9. Análise pós-experimento e coleta de dados

  1. Realizar as seguintes análises em cinco grupos de animais: micro-CT da estrutura óssea e determinação da expressão de mRNA de citocinas inflamatórias em tecidos femorais de ratos.
  2. Coletar dados que incluem imagens visualizadas da microestrutura trabecular femoral; parâmetros ósseos quantitativos (incluindo densidade mineral óssea, fração de volume ósseo, desvio padrão da espessura trabecular, espaçamento trabecular, número trabecular e densidade de conectividade); e níveis relativos de expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, IL-17) e citocinas anti-inflamatórias (IL-4, IL-10) nos tecidos femorais.
  3. Realize análises de dados usando o software GraphPad Prism 10.1.2 por análise de variância (ANOVA) unidirecional. A significância estatística para as diferenças de médias intergrupos foi definida como p < 0,05. Comparações múltiplas post-hoc foram executadas usando o teste de Tukey.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Função GO e análise de enriquecimento da via KEGG

Contamos com a análise de enriquecimento GO e KEGG em bioinformática para prever o potencial mecanismo de ação de Chai Hu no PMOP. A análise de enriquecimento GO de genes-alvo que se cruzam com os ingredientes ativos de Chai hu para doenças rendeu 2138 entradas significativas, e os dez principais resultados significativos estão listados para cada grupo (Figura 2D)....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A PMOP é um distúrbio sistêmico do metabolismo ósseo que ocorre frequentemente em mulheres PM e é causada pela falta de estrogênio que resulta em uma ruptura do equilíbrio osteoblasto-osteoclasto, levando a uma reabsorção óssea aumentada dos osteoclastos e diminuição da produção óssea de osteoblastos31. Um número crescente de estudos tem mostrado que os níveis de fatores inflamatórios no organismo também afetam a diferenciação entre osteoclastos e osteoblastos, e ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Científica e Desenvolvimento Tecnológico da Cidade de Baise e pelo Projeto de Aprimoramento de Habilidades Básicas de Pesquisa Científica de Professores de Jovens e Meia-Idade das Universidades de Guangxi de 2025 (Projeto nº: 2025KY0549). Os autores agradecem ao Dr. Dev Sooranna, do Imperial College London e YMUN, pela edição do manuscrito. ZY e LYR contribuíram igualmente para este trabalho.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Injeção de cloreto de sódio a 0,9% HuarenfarmacêuticaH1712059
1 e vezes; PBS Thermofisher10010023
75% de álcool NanjingreagenteC069156931
95% de etanolNanjingreagenteC0691520075
Etanol anidroMacklinE809056
Bupleurum chinense Farmácia Henan Baiquan Co.Z41021539
solução de descalcificação solarbioE1171
pomada de eritromicina Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Baiyunshan Hejigong Fábrica FarmacêuticaH44023088
Álcool isopropílicoJinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
penicilina V cápsulas de potássioSichuan FarmacêuticaH20103156
poliformaldeído (CH2O)nBeyotimePág. 0099
desinfetante de iodopovidona Guangdong Hengjian Farmacêutica Co.H44023924
Kit de PCR de fluorescência em tempo realYeasen Biotecnologia11201ES03
Kit de extração de RNAMonadbiotechMI20201S
Kit de transcrição reversa de RNAYuGongBiotechEG15123S
Pentobarbital de sódio Biotecnologia Co. de Shanghai Jixiang.JX082085
Trizol Thermofisher15596026CN

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