Artigo de método

Ensaio de diluição de FRET para análise de troca dinâmica entre conjuntos de proteínas

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 de setembro de 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve a purificação e marcação covalente da reflectina A1, bem como um ensaio de diluição de FRET para caracterizar a troca dinâmica da proteína reflectina entre os conjuntos de proteínas em função da idade.

Resumo

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Como o driver molecular para a iridescência sintonizável em cefalópodes, o comportamento da fase sintonizável da proteína reflectina A1 continua a ser um foco da engenharia de biomateriais. A modulação da concentração de sal e da densidade de carga líquida da proteína da reflectina A1 leva a proteína a formar conjuntos dinâmicos como intermediários para a separação de fases líquido-líquido. Os conjuntos de reflectina, embora limitados em tamanho pela extensão da neutralização da carga da repulsão catiônica e coulombiana da proteína, estão inicialmente em troca dinâmica com monômeros ou oligômeros da solução circundante. Um novo ensaio de diluição de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) foi usado, em conjunto com ensaios de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e concentração de proteínas, para caracterizar o fluxo bidirecional de proteína entre os conjuntos de reflectina A1 e uma fase diluída em função da idade de montagem. Este ensaio de diluição FRET distingue entre fluxo unidirecional e bidirecional de proteína para dentro e para fora de conjuntos de proteínas e, portanto, pode ser aplicado durante a formação do conjunto. A diferenciação entre conjuntos de proteínas dinâmicos e cineticamente interrompidos é crucial para entender suas origens biofísicas, e este novo ensaio de diluição de FRET pode ser adaptado para complementar as investigações biofísicas de outros conjuntos de proteínas.

Introdução

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A iridescência sintonizável em lulas loliginídeas é mediada por proteínas de reflectina em células de iridócitos 1,2,3. Os iridócitos contêm invaginações de membrana extensas e regulares que formam pilhas de lamelas de Bragg densas em proteínas, que refletem a luz de maneira dependente do ângulo e comprimento de onda 1,4,5,6. Uma cascata de sinal desencadeada por acetilcolina culmina na fosforilação de proteínas de reflectina catiônica 1,2,7, reduzindo a repulsão eletrostática intra e interproteica e conduzindo a condensação de reflectinas nas lamelas de Bragg de partículas de raio hidrodinâmico de 10-50 nm para um condensado líquido denso 3,8,9. A reflectina A1 in vitro forma conjuntos de raio de 10+ nm estáveis em tamanho cujos tamanhos são ajustados com precisão pela densidade de carga líquida da proteína 10,11,12, e esse comportamento coloidal sintonizável atraiu muito interesse da bioengenharia no projeto de materiais biofotônicos sintonizáveis baseados em reflectina 13,14,15,16,17,18 . Recentemente, foi demonstrado que o NaCl impulsiona a montagem da reflectina A1 e a LLPS (separação de fases líquido-líquido) aumentando entropicamente a contribuição energética do efeito hidrofóbico e rastreando as cargas repulsivas dos ligantes catiônicos alternados19.

Para condensados semelhantes a líquidos densos em proteínas, a troca dinâmica entre a fase densa e a fase diluída pode ser prontamente analisada usando FRAP (Recuperação de Fluorescência Após Fotobranqueamento) de gotículas inteiras20; É necessário um ensaio análogo para montagens de proteínas em escala nanométrica. Relatórios recentes de montagens de proteínas fisiologicamente relevantes como intermediários para LLPS19 , 21 , 22 sugeriram a necessidade de métodos equivalentes para interrogar a dinâmica de montagem e a troca dinâmica entre as montagens e a fase diluída coexistente. Os aglomerados de proteínas podem incluir colóides semelhantes a vidro cineticamente interrompidos produzidos por decomposição espinodal interrompida, conjuntos de equilíbrio dinâmico que trocam monômeros ou oligômeros da fase diluída e aglomerados metaestáveis 23,24,25,26,27. A dinâmica de montagem de proteínas dependente da idade é, portanto, fundamental para entender os processos físicos que impulsionam a formação de conjuntos de proteínas no contexto de um comportamento de fase mais complexo.

Abordagens baseadas em FRET que analisam a interação entre conjuntos de proteínas marcadas com fluoróforos doadores e conjuntos de proteínas marcadas com fluoróforos aceptores têm sido usadas para caracterizar a dinâmica de clusters de proteínas metaestáveis21. Ao misturar esses clusters, o surgimento de FRET demonstra troca e transporte de proteína para os clusters21. No entanto, para algumas proteínas, como a reflectina A1, os aglomerados se formam e crescem continuamente ao longo da duração do experimento19. Para tais proteínas, é necessária uma abordagem que desconvolucione o transporte unidirecional de proteína em clusters, como pode ocorrer durante a formação contínua de clusters dinamicamente interrompidos, e o transporte bidirecional de proteína entre os conjuntos.

Uma abordagem de diluição de FRET realiza isso por meio da diluição de fluoróforo (Figura 1), na qual uma diminuição no FRET significa transporte bidirecional de proteína entre os conjuntos. Conjuntos de proteínas da proteína reflectina foram preparados contendo quantidades iguais de proteína marcada com fluoróforo aceitador ou fluoróforo doador. Esses conjuntos de reflectina co-marcados foram diluídos com uma solução contendo conjuntos de reflectina não marcados, e a troca dinâmica de proteína entre os conjuntos foi analisada em função da idade de montagem. Este método distingue a formação contínua de aglomerados de proteínas cineticamente interrompidos de agrupamentos dinâmicos, incluindo, mas não se limitando a agrupamentos metaestáveis, agrupamentos que crescem devido ao amadurecimento de Ostwald ou processos de engrossamento semelhantes, agrupamentos que crescem por fusão e agrupamentos que não são intermediários para LLPS. Ele não distingue apenas entre esses diferentes mecanismos de troca dinâmica, o que requer métodos ortogonais, como espalhamento dinâmico de luz, análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e ensaios de Bradford19 , 21 . Este protocolo descreve métodos para a purificação da reflectina A1 do tipo selvagem e do mutante A1-C232S contendo cisteína única, a marcação covalente de A1-C232S e a análise de diluição FRET.

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Protocolo

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Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação de proteínas e marcação covalente

  1. Transformação
    1. Clone os genes C232S da reflectina A1 e da reflectina A1 (GenBank KF661517.1) nos plasmídeos pj411.
    2. Transfecto de células Rosetta 2 (DE3) com plasmídeos usando tratamento de choque térmico28.
    3. Placa transfectada de células em ágar contendo 50 μg/ml de canamicina.
    4. Selecione uma colônia isolada e adicione a 5 mL de TB (caldo fantástico) contendo 50 μg / mL de canamicina e incube a 37 ° C em um agitador a 250 rpm durante a noite.
    5. Isole os plasmídeos usando o protocolo do kit de isolamento de plasmídeo para sequenciamento.
  2. Expressão de proteínas, lise e purificação de corpos de inclusão
    1. Adicione 5 mL de cultura a 1 L LB (caldo de lisogenia) com 50 μg / mL de canamicina e incube a 37 ° C enquanto agita. A um A600 de 0,6-0,7, induzir a expressão adicionando IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo) a uma concentração final de 5 mM.
    2. Após 16 h, as células do pellet foram centrifugadas a 12.000 x g por 10 min. Decantar o sobrenadante e congelar os pellets em um freezer a -80 ° C.
    3. Lise as células e purifique os corpos de inclusão usando o reagente de purificação do corpo de inclusão de acordo com o protocolo do fabricante, incluindo 20 min de tratamento com 1 μL (25-29 unidades) de benzonase e 3-5 KU de lisozima por mL de reagente de purificação do corpo de inclusão após a ressuspensão inicial do pellet celular. Os corpos de inclusão purificados aparecerão como pellets marrom-escuros.
  3. FPLC (Cromatografia Líquida de Proteína Rápida)
    1. Prepare 2 L de ureia 8 M: solução de ácido acético a 5% v/v (tampão A) e 1 L de cloridrato de guanidínio 8 M: solução de ácido acético a 5% v/v (tampão B). Filtrar ambos utilizando um filtro de balão de vácuo de 0,22 μm.
      CUIDADO: Evite a inalação, o contato dos olhos e da pele com cloridrato de guanidínio e use EPI (Equipamento de Proteção Individual) adequado ao manusear. Descarte em um recipiente de lixo dedicado.
    2. Ressuspenda os pellets do corpo de inclusão em solução de ácido acético 8 M de ureia: 5% agitando vigorosamente com uma barra de agitação magnética. A solução parecerá turva. Centrifugue o pré-frio ao °C, centrifugue em 18.000 x g a 4 °C por 70 min, e recolha o sobrenadante para FPLC. O sobrenadante aparecerá marrom e transparente.
    3. Usando uma taxa de fluxo de 2 mL / min para todas as etapas a seguir, equilibre 10 mL da coluna de troca catiônica com 5 volumes de coluna (CVs) de 95% de tampão A, 5% de tampão B e carregue a amostra. Lave a amostra não ligada com 5 CVs e, em seguida, execute o gradiente de etapa: 5 CVs de 94% de Buffer A/6% de Buffer B e, em seguida, 5 CVs de 10% de Buffer B. A reflectina A1 elui a 10% de Buffer B.
    4. Avaliar a pureza das frações correspondentes à etapa inicial, mudar para 10% de buffer B por SDS-PAGE e pool, se semelhante. Pré-arrefecer uma centrífuga a 4 °C e concentrar as fracções até um volume final de 4-5 ml utilizando um concentrador de rotação MWCO de 15 ml a 10 kDa.
  4. HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
    1. Prepare 2 L de água a 18 mΩ com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% e 2 L de acetonitrila com TFA a 0,1%. Filtrar ambos utilizando um filtro de balão de vácuo de 0,22 μm.
      CUIDADO: O TFA é um ácido fumegante forte. Manuseie em um exaustor, usando EPI apropriado, e transfira apenas com vidro. Evite inalação, contato ocular e pele com acetonitrila e use EPI adequado ao manusear. Descarte em um recipiente de lixo dedicado.
    2. Usando uma taxa de fluxo de 1 mL / min para todas as etapas seguintes, equilibre a coluna C4 com 5 CVs de 85% de água a 18 mΩ, 0,1% de TFA e 15% de acetonitrila, 0,1% de TFA.
    3. Comece a fluir e injete a amostra. Fluxo 2 CVs, então comece o gradiente constante para 80% de acetonitrila, 0,1% de TFA em 5 CVs. A reflectina A1 normalmente elui a 73% de acetonitrila.
    4. Frações de congelamento da casca que contêm proteína reflectina em tubos de 5 mL usando um banho de etanol e gelo seco. Liofilizar e armazenar a -80 °C. A proteína aparecerá como finas folhas brancas.
  5. Preparação de estoque de proteína não rotulada
    1. Prepare 4 L de tampão de ácido acético pH 4, 25 mM (ácido acético 21,05 mM, acetato de sódio trihidratado 3,95 mM) usando ácido acético glacial e acetato de sódio trihidratado. Ajuste o pH, se necessário, com HCl 4 M ou NaOH 4 M. Filtre usando um filtro de vácuo de 0,22 μm.
      CUIDADO: Manuseie ácidos/bases fortes usando EPI apropriado. Nunca adicione água a ácidos ou bases fortes concentrados.
    2. Descongele o tubo contendo proteína reflectina liofilizada e, com o tubo em banho de gelo, resolubilize com tampão de ácido acético pH 4, 25 mM. Uma solução de proteína completamente resolubilizada parecerá incolor, sem turbidez ou precipitado visível.
      1. Usando um de diálise de corte de peso molecular de 10 kDa, dialisar a proteína reflectina resolubilizada em 1000x o volume de amostra de pH 4, tampão de ácido acético 25 mM pré-resfriado a 4 ° C usando duas mudanças de 12 h a 4 ° C.
    3. Diluir a amostra com um tampão de ácido acético de pH 4,25 mM para obter uma concentração final de proteínas de 100 μM e um volume final de pelo menos 150 μL. Com um espectrómetro UV-VIS, medir a absorvância a 280 nm e utilizar o coeficiente de absorção molar29 da reflectina A1 (123,685 M-1 cm-1) para determinar a concentração de proteínas.
    4. Transfira o estoque de proteína reflectina para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL e armazene a 4 ° C por até 7 dias. Imediatamente antes dos experimentos, centrifugue o estoque de proteína de reflectina a 4 ° C em uma microcentrífuga pré-resfriada a 18.000 x g por 15 min. Prepare o estoque de refletina A1 C232S da mesma forma usando o coeficiente de absorção molar de 123.540 M-1 cm-1.
  6. Marcação de proteínas
    1. Prepare separadamente 10 mg / mL de estoques de FMTS (fluoresceína-metantiossulfonato) e SRMT (metantiossulfonato de sulforrodamina) adicionando 1 mL de dimetil-sulfóxido seco (DMSO) a um frasco contendo 10 mg de mistura de sonda fluorescente e pipeta.
      CUIDADO: Evite a inalação, o contato dos olhos e da pele com reagentes de metantiossulfonato.
    2. Adicione 7,7 μL do estoque de FMTS de 10 mg / mL ou 10,4 μL do estoque SRMT de 10 mg / mL a um tampão de ácido acético de pH 4, 25 mM a um volume final de 150 μL e concentração final de 500 μM FMTS ou SRMT. A solução parecerá turva. Alíquota e congelar o restante dos estoques de sondas fluorescentes a -80 °C.
    3. Combine com 150 μL de estoque de proteína reflectina 100 μM e misture bem a pipeta. A concentração final da proteína é de 50 μM e a concentração final da sonda fluorescente é de 500 μM. A turbidez da solução diminuirá.
    4. Embrulhe em papel alumínio e incube na vertical com agitação orbital suave à temperatura ambiente por 4 h e depois durante a noite a 4 ° C. A turbidez da solução não deve mudar.
    5. Se houver algum precipitado, ressuspenda com uma mistura vigorosa de pipetas. A solução será turva. Concentre a reflectina usando um filtro centrífugo MWCO de 10.000 kDa para um volume alvo de 100 μL e uma concentração de 150 μM.
    6. Utilizar o mesmo método de HPLC e liofilização da purificação das proteínas para remover a sonda fluorescente não ligada e armazenar as proteínas a - 80 °C envoltas em papel alumínio. Resolubilize a proteína marcada usando o mesmo método para a proteína não marcada. Determine o grau de rotulagem.
      NOTA: A proteína reflectina marcada com fluorescência resolubilizada aparecerá verde-amarelada (C199-F) ou vermelho escuro (C199-R) sem turbidez ou precipitação.
  7. Preparação de estoque de proteína co-rotulada
    1. Adicione 27 μL de estoque de proteína A1 de 100 μM a uma microcentrífuga de 0,5 mL de tampa de pressão.
    2. Adicione 1,5 μL de reflectina A1-C232S marcada com fluoresceína (referida como C199-F para denotar a posição de aminoácido da fluoresceína) ao mesmo tubo.
    3. Adicione 1,5 μL de reflectina A1-C232S marcada com sulforrodamina (referida como C199-R para denotar a posição do aminoácido da fluoresceína) ao mesmo tubo. As concentrações finais são 90 μM A1, 5 μM C199-F e 5 μM C199-R.
    4. Embrulhe em papel alumínio e guarde a 4 °C por até 7 dias.

2. Séries temporais FRET

  1. Preparação de tampões e filtragem
    1. Prepare 500 mL de tampão de ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico (MOPS) 25 mM. Ajustar o pH da solução para 7 adicionando lentamente 4 M de hidróxido de sódio. Filtre 10 mL usando uma seringa de 10 mL e um filtro de seringa de 0,22 μm.
  2. Proteína de centrifugação
    1. Microcentrífuga de mesa pré-resfriada a 4 °C. Centrífuga não rotulada e co-rotulada reflectina A1 estoques a 18.000 x g por 15 min a 4 ° C.
  3. Preparando assemblies A1 rotulados
    1. Para preparar três réplicas, pipete 9,6 μL de tampão MOPS (pH 7, 25 mM) em três tubos de microcentrífuga de 0,5 mL com tampa de pressão.
    2. Adicione 0,4 μL de estoque de proteína marcada a cada tubo que já contém 9,6 μL de tampão MOPS a uma concentração final de proteína de 4 μM. Pipete lentamente a mistura duas vezes aspirando e dispensando todo o volume da amostra.
    3. Embrulhe imediatamente em papel alumínio e coloque na incubadora a 25 °C. Esta e todas as soluções de montagens a seguir não têm turbidez aparente ou precipitação antes ou depois da incubação.
  4. Preparando assemblies A1 não rotulados
    1. Para preparar três réplicas, pipete 38,4 μL de tampão MOPS em três tubos de microcentrífuga de 0,5 mL com tampa de encaixe.
    2. Adicione 1,6 μL de estoque de proteína reflectina A1 a cada tubo que já contém 38,4 μL de tampão MOPS a uma concentração final de proteína de 4 μM. Pipete lentamente misture duas vezes aspirando e dispensando todo o volume da amostra.
    3. Embrulhe imediatamente em papel alumínio e coloque na incubadora a 25 °C.
  5. Temporização e combinação de assemblies A1 co-rotulados e não rotulados
    1. Ordene a preparação dos conjuntos da seguinte forma: prepare simultânea e separadamente conjuntos de uma reflectina experimental co-rotulada e uma reflectina experimental não rotulada. Repita as etapas 2.3 e 2.4.
    2. Misture adicionando 40 μL de montagem experimental A1 não marcada a 10 μL do respectivo experimental co-marcado e pipete suavemente a mistura aspirando e dispensando todo o volume duas vezes. As medições serão realizadas 24 h após esta etapa.
    3. O tempo entre a montagem da reflectina A1 por diluição em tampão MOPS (pH 7, 25 mM) e a mistura de conjuntos rotulados e não rotulados é a idade de montagem. As idades das montagens utilizadas para esses dados foram 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min e 1620 min.
  6. Controles
    1. Controle positivo
      1. A partir dos estoques de proteína A1 e marcados, prepare 20 μL de estoque de proteína que é 80 μM A1 e 20 μM de estoque de proteína co-marcado.
      2. Adicione 38,4 μL de tampão MOPS a tubos de microcentrífuga de 0,5 mL e, em seguida, adicione 1,6 μL de proteína marcada com 80 μM A1 / 20 μM e pipete misture duas vezes aspirando lentamente e dispensando todo o volume. Cubra imediatamente com papel alumínio e coloque na incubadora a 25 °C. Repita para um total de 9 amostras.
    2. Controlo negativo
      1. Adicione 0,4 μL de estoque rotulado a um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL com tampa de encaixe que já contém 9,6 μL de tampão MOPS. Pipetar lentamente a mistura duas vezes, aspirando e dispensando todo o volume da amostra.
      2. Adicione 40 μL de tampão MOPS e pipete misture duas vezes, aspirando e dispensando todo o volume da amostra. Cubra imediatamente com papel alumínio e coloque na incubadora a 25 °C. Repita para um total de 9 amostras.
  7. Cubeta e tampão em branco
    1. Defina o fluorímetro para excitar em 488 nm e registre espectros contínuos de 520-700 nm.
    2. Encha uma cubeta de quartzo limpo com 50 μL de tampão MOPS (pH 7, 25 mM) e meça.
    3. Remova o buffer.
  8. Procedimento experimental
    NOTA: Todos os experimentos devem ser registrados 24 h após a mistura de conjuntos de reflectina A1 co-rotulados e não rotulados. Pipetar suavemente 50 μL da solução experimental para a cubeta e medir.
    1. Remova a amostra, enxágue com tampão de ácido acético 500 μL e, em seguida, com 500 μL de água filtrada a 18 mΩ a 0,22 μm. Execute o buffer em branco.
  9. Controles
    1. Meça em 1440 min, 1960 min e 3060 min após preparar os controles (correspondendo às idades de montagem de 0 min, 520 min e 1620 min). Essas medições concluem a parte experimental do protocolo.

3. Análise dos dados

  1. Subtraia os espectros do buffer em branco dos espectros experimentais.
  2. Determine a proporção de Em588 / Em520.
  3. Para cada réplica, determinar a média e o desvio-padrão de cada grupo de três réplicas. Parcela Em588/Em520 em função da idade de montagem.

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Resultados

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Após diluir os conjuntos de reflectina A1 contendo proteína marcada com fluoróforo doador e proteína aceptora marcada com fluoróforo com conjuntos de reflectina A1 não marcados, foi observada uma diminuição inicial na emissão de FRET a 588 nm em relação aos conjuntos não diluídos (Figura 2A). A FRET para conjuntos de 0 min de idade foi semelhante ao controle positivo, e o FRET para conjuntos de 1620 min de idade (o tempo entre a formação do conjunto e a mistura de conjuntos de reflectina não...

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Discussão

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Um ponto comum de perda de proteína durante a purificação é a ressuspensão incompleta dos pellets do corpo de inclusão para todas as etapas do protocolo de purificação do corpo de inclusão e a ressuspensão final dos corpos de inclusão purificados em ácido acético 8 M ureia 5% v/v. A resolubilização do corpo de inclusão pode levar até 24 h de agitação vigorosa com uma pequena barra de agitação magnética em um tubo cônico de 40 mL. Para evitar perda significativa de proteína para os filtro...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesquisa foi apoiada pelo Instituto de Biotecnologias Colaborativas por meio de subsídios W911NF-19-2-0026 e W911NF-23-1-0330 do Escritório de Pesquisa do Exército dos EUA. O conteúdo das informações não reflete necessariamente a posição ou a política do Governo, e nenhum endosso oficial deve ser inferido.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10 μ Micropipeta com capacidade L
2 μ Micropipeta com capacidade L
2-[(5-fluoresceinil)aminocarbonil]etilometanossulfonatoSanta Cruz BiotecnologiasSC-216155CAS  351330-42-2
20 μ Micropipeta com capacidade L
200 μ Micropipeta com capacidade L
Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico, ácido 4-morfolina-propanossulfônicoSigma-AldrichM1254CAS 1132-61-2
Ácido acéticoSigma-AldrichRolamento A6283CAS 64-19-7
AcetonitriloSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Ágar em póCarolina Biológica842133CAS 9002-18-0
Folha de alumínio
Filtro ultracentrífugo Amicon, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC501008Capacidade de 0,5 ml
Filtro ultracentrífugo Amicon, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC901008Capacidade de 15 ml
Balança analítica
BenzonaseMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
Reagente de extração de proteína BugBusterMillipore Sigma70584-3
Espectrômetro de Fluorescência Cary EclipseCary-Eclipse
Cary Eclipse Software
Tubos de centrífuga de 50 ml da CorningMillipore-SigmaCLS430829
Seringas descartáveis, Luer-Lok 10 mLCole-ParmerUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichD8418CAS 67-68-5
Gelo seco
Sistema FPLC de bomba dupla
Sistema de HPLC de bomba dupla
EtanolMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Rotor de centrífuga de chão com capacidade para frascos de 500 ml
Centrífuga de chão
Congelador, -80° C
Hotte
Cloridrato de guanidinaThermo CientíficoAAA135430B50-01-1
Coluna de cromatografia de troca catiônica HiTrap SP HPCytiva17115101
Ácido clorídricoSigma-AldrichRolamento 258148-25MLCAS 7647-01-0
Incubadora
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranosídeoSigma-AldrichI6758-1G
Sulfato de canamicinaSigma-AldrichK1637CAS 25389-94-0
Liofilizador
LisozimaThermo Científico90082
Barra de agitação magnética
Placa de agitação magnética
Micro eletrodo de pH S7Metler Toledo51343160
Microcentrífuga com controle de temperatura
Filtro de seringa Millex PVDFMilliporeSLGVR33RS0,22 μ m, 33mm de diâmetro.
Filtro Milli-Q MillipakMillipore SigmaMPGP002A1
Sistema de purificação de água Milli-Q UltraPureMillipore Sigma
NaClThermo CientíficoAA12314A9CAS 7647-14-5
Frascos de centrífuga Nalgene, estilo 3120Millipore-SigmaB1283-4EAPara peletizar bactérias
Laboratório orbital agitador com incubadora
Computador pessoal
Placas de PetriSigma-AldrichPág. P5731-500EA
Plasmídeo PJ411DNA 2.0
Proteína LoBind  Tubos cônicosEppendorfEP30108302Capacidade de 5 ml
Proteína LoBind  Tubos de microcentrífugaEppendorfEP022431102Capacidade de 0,5 ml
Balão Erlenmeyer com defletor de pirex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS44501Para incubação de culturas bacterianas
Copos Pyrex Griffin 2.000 mLMillipore-SigmaCLS10002LPara toda a preparação de tampão e solução 
Frascos redondos de armazenamento de mídia Pyrex 1.000 mlMillipore-SigmaCLS13951LPara armazenamento de todo o tampão e preparação da solução, use com filtros de frasco a vácuo
Qiaprep Spin Miniprep KitQiagen27104
Refrigerador
Células competentes Rosetta 2 (DE3)Novagen71397-3
de diálise Slide-a-lyzer 10K MWCOThermo CientíficoPI66383Capacidade de 0,5 ml
Acetato de sódio trihidratadoSigma-AldrichS8625CAS 6131-90-4
Hidróxido de sódioSigma-AldrichRolamento 567530-250GMCAS 1310-73-2
Filtro superior de garrafa de vácuo SteritopMillipore SigmaS2GPT05RE0,22 μ M Filtro estéril
Sub-microcubeta, capacidade de 50 uLCélulas Starna16.40F-Q-10/Z15
metanotiossulfonato de sulforrodaminaSanta Cruz BiotecnologiasSC-220172CAS  386229-71-6
Ácido trifluoroacéticoSigma-Aldrich106232-25GCAS 407-25-0
TriptonaSpectrum Chemical T1333
UreiaThermo CientíficoAAA123600ECAS 57-13-6
Espectrômetro UV-VIS
Extrato de leveduraGibco211929

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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