Linfodenectomia mesentérica murina para interrupção seletiva da comunicação linfática com intestino específico de região

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico. Esse procedimento é adaptável para permitir a interrupção seletiva da comunicação linfática com o cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado.

Resumo

Imunovigilância versus tolerância ao antígeno é um equilíbrio delicado no microambiente intestinal, durante o qual o papel crítico do priming de células T circulantes nos linfonodos locais é bem conhecido. Após a preparação das células T, a literatura recente começou a demonstrar um papel único e não redundante das células T não circulantes que residem no linfonodo drenante de um órgão. Isso pode ser especialmente verdadeiro no intestino, onde a drenagem linfática é conhecida por ser altamente específica. No entanto, para realmente entender o impacto único dessas células locais em relação à redundância funcional sistêmica, a comunidade científica precisa de um procedimento bem descrito para isolar e perturbar seletivamente esses nós. Aqui está descrito um procedimento de sobrevivência para uma linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico. Esse procedimento é adaptável para permitir a interrupção seletiva da comunicação linfática com o cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado. Incluídas estão instruções detalhadas, auxílios visuais, dicas úteis para melhorar o sucesso e soluções de problemas para sobrevivência subótima. Linfonodos ressecados estão imediatamente prontos para processamento posterior a jusante, se desejado. Essa técnica é mais adequada para estudos que exigem a interrupção seletiva do drenagem linfático do cólon distal, cólon proximal e/ou intestino delgado.

Introdução

As células T são um dos principais tipos de células efetoras na imunidade adaptativa, com papéis descritos em diversas categorias de doenças, incluindo infecções, autoimunidade e ^{malignidade 1,2,3}. Um passo crítico para a funcionalidade das células T é o preparo trifásico pelas células apresentadoras de antígenos dentro dos órgãos linfáticos secundários, como os linfonodos^{locais 4}. Na medicina moderna, um pilar fundamental da resseção oncológica adequada em múltiplos sistemas de órgãos inclui algum grau de amostragem local ou resseção de linfonodos em ^bloco 5,6,7,8. Por exemplo, no câncer de cólon, as diretrizes consensuais recomendam que 12 linfonodos sejam removidos e examinados na resseção com intenção curativa devido à clara correlação com a melhora da sobrevivência^{a longo prazo 6,7}. No entanto, os linfonodos locais podem realmente ser ressecados impunemente? Estudos recentes em camundongos demonstraram que o linfonodo drenador de tumores contém um reservatório de precursores antitumorais das células T, que podem ser protegidas contra a diferenciação terminal e o cansaço das células T que ocorrem no microambiente^{tumoral 9,10,11}. Isso sugeriria que a remoção de uma população tão crítica poderia enfraquecer as capacidades contínuas de imunovigilância.

O padrão de drenagem da linfa intestinal em camundongos é conhecido por ser bastante especializado ao longo da cadeia do linfonodo mesentérico; por exemplo, o cólon proximal é quase exclusivamente drenado pela primeira estação linfonodária, o intestino delgado pela segunda/terceira estação, e o cólon distal predominantemente pela quarta estação^{linfonodária 12} (Figura 1, Figura Suplementar 1). Assim, a comunicação direta entre segmentos do intestino e os linfáticos pode ser interrompida com a ablação direcionada desses gânglios. Para bloquear o tráfego entre linfonodos e tecidos, agonistas receptores S1P, como FTY720, e bloqueio de integrina são comumente utilizados; No entanto, esses medicamentos inibem amplamente o tráfico e, portanto, não podem ser usados para investigar a contribuição de linfonodos específicos^13,14. No entanto, a capacidade da comunidade científica mais ampla de estudar o efeito local das interações imunes nos linfonodos intestinais é limitada pela ausência de uma resseção cirúrgica bem descrita para cada estação. Com essa lacuna em mente, foi desenvolvido um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina em cada estação do gânglio, descrito aqui. O objetivo geral deste procedimento é alcançar a excisão segura e confiável do(s) gânglio(s) linfático(s) mesentérico(s) em camundongos com alta sobrevivência pós-operatória e tolerância.

Esse procedimento foi testado e é facilmente realizado em camundongos juvenis e adultos em múltiplas cepas (ou seja, Balb/c, C57BL/6J, 129S4), mas é limitado pela necessidade de linfonodos acessíveis e facilmente identificáveis. Portanto, pode não ser adequado para combinar com modelos de camundongos ou genótipos com linfonodos menores que o usual ou imperceptíveis (por exemplo, camundongos deficientes em linfotoxina alfa)¹⁵. Além disso, camundongos mais velhos (>15 semanas) tendem a ter mais adiposidade visceral, tornando a identificação e o isolamento dos gânglios linfáticos mais difíceis, e embora isso não seja uma contraindicação, pode ser limitante para o sucesso e o procedimento. Além dessas limitações, a linfadenectomia mesentérica oferece uma perturbação altamente controlada e seletiva dos linfonodos. Esse procedimento seria mais adequado para esclarecer questões sobre o efeito local dos linfonodos e suas células imunes residentes associadas e interações em segmentos do intestino (por exemplo, cólon proximal, cólon distal, intestino delgado).

Figura 1: Marcos anatômicos das estações na cadeia mesentérica dos linfonodos. (A) Representação não rotulada e (B) rotulada de quatro principais estações de linfonodos mesentéricos in situ. A drenagem proximal do cólon ocorre predominantemente pela estação 1, o intestino delgado é predominantemente a estação 2/3 e o cólon distal é predominantemente a estação 4. (DC = cólon distal, ICV = vasos ileocólicos, PC = cólon proximal, CEC = ceco, IV/JV = vasos ileais/jejunais, SI = intestino delgado). Barras de escala: 1,5 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os procedimentos são realizados em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais de Yale. Para desenvolver esse procedimento, foram utilizados a cepa C57BL/6 de 8 a 12 semanas, camundongos do tipo selvagem e controles simulados com compatibilidade de idade/sexo/genótipo. Tanto ratos machos quanto fêmeas foram incluídos. O peso corporal variava de 18 a 25 g. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de instrumentos, animais e a sala de cirurgia

1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos. Certifique-se de que a superfície de operação e o cone do nariz anestésico estejam limpos com 70% de etanol.
2. Instale a máquina de vaporizador de anestesia inalada com um cone nasal e sucção para eliminar anestésicos em excesso. Monte uma superfície de operação com uma almofada de circulação de água morna para manter a temperatura corporal e os suprimentos do animal em um local conveniente e estéril.
   NOTA: Este procedimento não requer microscópio cirúrgico; No entanto, considere incluir esse instrumento para melhorar a visualização.
3. Induza anestesia administrando isoflurano inalado a 2%-3% com fluxo de oxigênio de 2 L/ min via cone nasal, a partir de uma máquina de vaporizador anestésico inalado (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
   1. Garanta o plano adequado de anestesia confirmando uma frequência respiratória de aproximadamente 30-40 respirações/min e a falta de resposta ao aperto na parte traseira do pé. Verifique periodicamente o plano de anestesia adequado e ajuste a vazão de isoflurano de acordo.
      NOTA: Alternativamente, um anestésico injetável também é apropriado.
4. Siga as diretrizes do instituto para analgesia adequada e anestesia local. Por exemplo, administrar um analgésico de ação prolongada, como 3,25 mg/kg de buprenorfina XR, por via subcutânea, e administrar até 0,04 mL/5g de peso corporal de solução de lidocaína de 1 mg/mL subcutâneamente na incisão planejada.
5. Prepare o animal para o procedimento posicionando-se em posição deitada, aplicando lubrificante ocular, arrancando ou cortando o pelo abdominal e esterilizando o abdômen com solução de povidona/iodo, seguida de 70% de etanol (Figura 2A).
6. Use luvas estéreis e aplique cortinas estéreis sobre o animal com uma janela para o campo operatório. Mantenha a esterilidade durante todo o procedimento.

Figura2: Imagens representativas das principais etapas procedimentais na linfadenectomia mesentérica. (A) Janela abdominal arrancada e esterilizada. (B) Incisão de 0,5 cm através da pele e linha alba. (C) Exposição da cadeia linfática mesentérica orientando o íleo direito, o cólon proximal esquerdo e o ceco inferior. O primeiro linfonodo mesentérico está localizado ao longo da artéria ileocólica (seta branca). (D) Linfonodo mesentérico excisado (flecha desbotada). Barras de escama: 0,5 cm. (E) Linfonodo mesentérico ex vivo (seta branca; 2,5 mm x 3 mm). Carrapatos = 1 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Preparação para linfadenectomia mesentérica

1. Faça uma incisão de 0,5 a 1 cm na linha média através da pele. Dissecar a pele de forma direta da parede abdominal e identificar a linha alba. Faça uma incisão de 0,5 a 1 cm através da linha alba para acessar a cavidade peritoneal (Figura 4B).
   NOTA: Para melhorar o acesso aos linfonodos da estação 2/3/4, considere estender a incisão cefálada, mas não para ultrapassar o processo xifoide cartilaginoso.
2. Injete 1 mL de soro fisiológico estéril à temperatura corporal na cavidade peritoneal por meio de uma agulha de ponta romba e umedeça as cortinas estéreis em preparação para o posicionamento intestinal. Use cotonetes estéreis e umedecidos com ponta de algodão para identificar e eviscerar o ceco através da incisão.
   1. Evite usar instrumentos cortantes para manipular o intestino, pois isso pode causar lesões. Umedecida periodicamente as cortinas e o intestino para evitar que os danos ressecem.
      NOTA: O ceco murino geralmente reside no quadrante inferior esquerdo do abdômen, mas pode ser alojado em qualquer quadrante.
3. Esclareça a(s) estação(s) dos gânglios linfáticos mesentéricos(es) alvo para resseção e siga as instruções específicas abaixo (ou seja, 3.1-3.4). Veja a Figura 1A,B para marcos anatômicos e identificação.

3. Dissecação e excisão das estações dos gânglios linfáticos mesentéricos

1. Primeira estação linfonodária (drenagem proximal do cólon; Figura suplementar 1A,B').
   1. Oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas umedecidas com o ceco inferior, o cólon proximal por cima e o íleo terminal em direção à direita do cirurgião (lado esquerdo do animal; Figura 1A, Figura 2C).
   2. Identifique a cadeia linfonodal mesentérica, que percorre longitudinalmente o cólon. Usando pinças de ponta fina e angular, dissece de forma direta a primeira estação linfonodali, afastando-a dos vasos ileocólicos, colocando pinças fechadas no espaço entre essas estruturas e permitindo que as pinças se abram suavemente.
      1. Remova a pinça e repita essa manobra 2-3 vezes ou até que um plano suficiente seja criado para excisão segura. Evite danos aos principais vasos sanguíneos do cólon (Figuras 3A,B).
         NOTA: Se houver sangramento significativo, aborte o procedimento e eutanásia humanitária do animal (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
   3. OPCIONAL: Para diminuir o risco teórico de colaterais para os linfonodos próximos, realize uma ligadura opcional com suturas simples interrompidas ao longo da cadeia linfático (um 1 mm distal e um 1 mm proximal à primeira estação linfonodária) usando ponta preta monofilamento de nylon 9-0 e pinças de ponta fina para acionar a agulha (Figura 3C,D).
   4. Retraa suavemente a cauda da estação linfática ligada e, usando tesoura de ponta fina, excise a estação linfonodali-alvo da cefala à cauda (Figura 3E).
      NOTA: Frequentemente, camundongos possuem um pequeno, mas visível, vaso alimentar da artéria ileocólica para a parte posterior do linfonodo. O sangramento desse vaso pode ser controlado por uma pressão suave com um cotonete com ponta de algodão até que a hemostasia seja alcançada.

Figura3: Imagens e comentários anotados da linfadenectomia mesentérica (primeira estação). (A) A orientação adequada do intestino expõe a primeira estação mesentérica do linfonodo (seta branca). (B) Um plano é criado entre a artéria ileocólica (seta azul) e o nó. (C) A ligadura por sutura dos vasos de alimentação que entram no ápice do linfonodo (seta azul) é realizada excluindo os vasos ileocólicos ao sair do espaço entre essas estruturas (seta branca). (D) É realizada a ligadura por sutura da base do linfonodo, novamente observando e evitando os ramos distais da artéria ileocólica. (E) O gânglio é excisado ao longo do plano tecidual previamente criado, mantendo-se alto em direção ao linfonodo e deixando as ligaduras de sutura (setas pretas). (F) Hemostasia confirmada, observam-se ramos distais da artéria ileocólica para garantir o fluxo sanguíneo adequado, e o espaço vazio (seta desbotada) onde o nódulo existia anteriormente é observado como livre de resíduos. Barras de escala: 0,5 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Segunda estação linfonodal (drenagem do intestino delgado no meio distal)
   1. Eviscere suavemente o intestino delgado também. Oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas umedecidas, com o ceco inferior, o cólon proximal por cima e o intestino delgado em direção ao direito do cirurgião (lado esquerdo do animal; Figura 1A).
   2. Identifique a cadeia linfonodal mesentérica, que percorre longitudinalmente o cólon. A segunda estação começa na confluência dos vasos ileais/jejunais (Figura 1B).
      1. Usando pinças de ponta fina e angulares, dissece de forma direta a segunda estação linfático afastada dos vasos do cólon, colocando pinças fechadas no espaço entre essas estruturas e permitindo que as pinças se abram suavemente.
      2. Remova a pinça e repita essa manobra 2-3 vezes ou até que um plano suficiente seja criado para excisão segura. Evite danos aos principais vasos sanguíneos do cólon. Além disso, preste atenção especial aos vasos ileais e jejunais, que seriam prejudiciais se feridos.
         NOTA: Se houver sangramento significativo, aborte o procedimento e faça a eutanasia humanitária do animal.
   3. OPCIONAL: Para diminuir o risco teórico de colaterais para os linfonodos próximos, realize uma laqueadura opcional com suturas simples interrompidas ao longo da cadeia linfático (uma distal de 1 mm e outra de 1 mm proximal à segunda estação linfonodária) usando ponta de nylon monofilamento preta 9-0 e pinças de ponta fina para acionar a agulha (Figura Suplementar 2A).
   4. Retraa suavemente a estação linfática ligada caudad e, usando tesoura de ponta fina, excise a estação linfonodali-alvo de cefálade para cauda (Figura Suplementar 2B).
      NOTA: Frequentemente, camundongos possuem um pequeno, mas visível, vaso alimentar da artéria ileocólica para a parte posterior do linfonodo. O sangramento desse vaso pode ser controlado por uma pressão suave com um cotonete com ponta de algodão até que a hemostasia seja alcançada.
3. Segunda e terceira estação linfânica (prox-drenagem do intestino delgado no meio distal; Figura Suplementar 1C,D'
   1. Eviscere suavemente todo o intestino delgado até o ponto de amarração posterior (ligamento de Treitz). Oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas umedecidas, com o ceco inferior, o cólon proximal por cima e o intestino delgado em direção ao direito do cirurgião (lado esquerdo do animal; Figura 1A).
   2. Identifique a cadeia linfonodal mesentérica, que percorre longitudinalmente o cólon. A segunda estação começa na confluência dos vasos ileais/jejunais (Figura 1B).
      1. Usando pinças de ponta fina em ângulo, dissece de forma direta o segundo e o terceiro gânglio linfático, afastando-os dos vasos do cólon, colocando pinças fechadas no espaço entre essas estruturas e permitindo que as pinças se abram suavemente.
      2. Remova a pinça e repita essa manobra 2-3 vezes ou até que um plano suficiente seja criado para excisão segura. Evite danos aos principais vasos sanguíneos do cólon. Além disso, preste atenção especial aos vasos ileais e jejunais, que seriam prejudiciais se feridos.
         NOTA: Se houver sangramento significativo, aborte o procedimento e faça a eutanasia humanitária do animal.
   3. OPCIONAL: Para diminuir o risco teórico de colaterais para os linfonodos próximos, realize uma laqueadura opcional com suturas simples interrompidas ao longo da cadeia linfática (geralmente uma distal de 1 mm, duas laterais de 1 mm e uma de 1 mm proximal às estações do segundo/terceiro gânglio linfático) usando ponta preta monofilament de nylon 9-0 e pinças de ponta fina para acionar a agulha (Figura Suplementar 3B, C).
      1. Note os tratos linfáticos aferentes, que estão apenas superficialmente em relação aos feixes vasculares ileal/jejunal (Figura Suplementar 3B). Tenha cuidado para garantir que a laqueação de pontos seja profunda para os linfáticos e superficial para as principais estruturas vasculares, pois danos aos feixes vasculares ileais/jejunais seriam prejudiciais.
   4. Retraa suavemente as estações linfáticas ligadas da cefálade e, usando tesouras finas ou extra-finas, retire as estações linfáticos alvo da cauda à cefalada.
      NOTA: Antes de prosseguir, certifique-se de que o intestino delgado permaneça rosado e bem perfuso. A ligadura incidental dos vasos ileais/jejunais resultará em intestino delgado isquêmico.
4. Quarta estação linfonodária (drenagem distal do cólon; Figura Suplementar 1E,F')
   1. Eviscere suavemente todo o intestino delgado até o ponto de amarração posterior (ligamento de Treitz). Oriente o intestino exteriorizado sobre cortinas umedecidas, com o ceco inferior, o cólon proximal por cima e o intestino delgado em direção ao direito do cirurgião (lado esquerdo do animal; Figura 1A).
   2. Identifique a cadeia linfonodal mesentérica, que percorre longitudinalmente o cólon. A quarta estação está localizada logo na medial do cólon distal e lateralmente na terceira estação (Figura 1B, Figura 4A).
      1. Usando pinças de ponta fina em ângulo ou tesouras de ponta extra-fina, dissece de forma direta a quarta estação linfonodal, afastando-a dos vasos do cólon e do adiposo ao redor, colocando pinças/tesouras fechadas no espaço entre essas estruturas e permitindo que as pinças se abram suavemente.
      2. Remova a pinça/tesoura e repita essa manobra 2-3 vezes ou até que um plano suficiente seja criado para excisão segura. Evite danos aos principais vasos sanguíneos do cólon.
         NOTA: Se houver sangramento significativo, aborte o procedimento e faça a eutanasia humanitária do animal.
   3. OPCIONAL: Para diminuir o risco teórico de colaterais para os linfonodos próximos, realize uma laqueadura opcional com suturas simples e interrompidas em cada linfonodo identificável (geralmente um a 1 mm do nódulo) usando nylon monofilamento preto 9-0 e pinças de ponta fina para acionar a agulha (Figura 4B - D).
   4. Retrair suavemente as estações linfáticas ligadas cefálades e, usando tesouras de ponta extra-fina, excisar a estação linfântica alvo da cauda para a cefálade (Figuras 4D, E).

Figura 4: Imagens e comentários anotados da linfadenectomia mesentérica (quarta estação). (A) A orientação intestinal correta expõe a quarta estação linfonodária mesentérica (setas brancas) medial ao cólon distal e lateral à terceira estação. (B,C) Após a dissecação obtusa da estação do gânglio, é realizada a ligadura por sutura (seta preta) em cada nódulo identificável, garantindo a inclusão de todos os vasos alimentares dos gânglios linfáticos (setas azuis). (D) O gânglio é excisado ao longo do plano do tecido previamente criado, mantendo-se alto em direção aos linfonodos e deixando ligações de sutura (setas pretas). (E) Após a excisão da estação do nó (setas brancas), a hemostaste é confirmada, as ligaduras de sutura são visíveis (setas pretas) e o espaço vazio (setas desbotadas) onde o nó existia anteriormente é observado como livre de nó residual. Barras de escala: 0,2 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Conclusão da linfadenectomia mesentérica

1. Observe os ramos distais dos vasos ileocólicos, ileais e/ou jejunais para garantir que o suprimento sanguíneo esteja intacto. O intestino bem perfundido é brilhante e rosado, com pulsações visíveis.
   1. Usando cotonetes com ponta de algodão, retorne o conteúdo abdominal para a cavidade peritoneal. Tenha cuidado para remover quaisquer fragmentos de algodão, fiapo, tecido ou sutura dos intestinos antes do retorno, pois isso pode resultar em inflamação cirúrgica adicional.
   2. Certifique-se de que o intestino não esteja torcido em seu mesenterio, confirmando que o intestino permanece brilhante/rosa (perfuso) em vez de opaco/cinza/roxo (isquêmico).
2. Injete 1 mL de soro fisiológico estéril à temperatura corporal no abdômen pouco antes do fechamento para preencher a perda/evaporação insensível de líquidos. Feche o abdômen em duas camadas (parede abdominal e pele) com sutura de polipropileno monofilamento 6-0 em modo contínuo.
3. Aplique cola cirúrgica estéril na ferida.
   NOTA: Alternativamente, pontos interrompidos ou clipes de ferida podem ser usados para fechamento da pele.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Realoque o animal para uma gaiola limpa, que fica metade em cima e metade fora de uma base de água morna com acesso a comida e água de forma improvisada.
2. Permita que o animal se recupere da anestesia e monitore atentamente sinais de sofrimento. Se os animais não se recuperarem rapidamente da anestesia com comportamentos apropriados (ou seja, aumento da frequência respiratória, auto-endireitamento, deslocação, tosa), eutanasie o animal de forma humana.
3. Quando todos os animais estiverem recuperados da anestesia, devolva as gaiolas à unidade de cuidados com acesso a água, alimento, cama e materiais de enriquecimento ad libium.
4. Avalie os camundongos pós-operatório a cada 12 horas durante 3 dias para sinais de dor ou sofrimento (ou seja, postura curvada, diminuição da atividade, diminuição do engajamento, ruim da tosa). Eutanasiem de forma humana camundongos que demonstram sinais de sofrimento.
5. Se estiver usando sutura permanente (como polipropileno monofilamento 6-0), examine as incisões no dia 10 pós-operatório e remova qualquer material restante do ponto de sutura.

6. Manuseio dos linfonodos

1. Realize imediatamente um teste de flutuabilidade colocando o tecido excisado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com soro salino tamponado fosfatado (PBS) de 500 μL. Confirme a excisão do gânglio linfático observando o afundamento do tecido no PBS versus o adiposo ressecado inadvertidamente, que flutuará (Figura 5A).
   NOTA: A(s) estação(s) de linfonodos excisados estão imediatamente prontas para entrar em processamento posterior a jusante.
2. Para técnicas de células vivas, coloque(s) estação(s) de linfonodos excisados em meios de cultura celular (por exemplo, DMEM, RPMI) ou PBS sobre gelo. Para histologia planejada, coloque(s) estação(s) linfânica(s) excisada(s) em fixador (por exemplo, formalina tamponada neutra com 10%, paraformaldeído a 4%).

Resultados

Para confirmar a precisão desse procedimento, foram realizadas linfadenectomias mesentéricas em onze irmãos de ninhada C57BL/6J de 4 a 6 semanas, com idade e sexo e genótipo. Os tempos dos procedimentos variaram de 5 a 15 minutos por mouse. Todos os camundongos toleraram bem o procedimento, com 100% de sobrevivência perioperatória. Amostras excisadas foram colocadas no PBS sobre gelo. Todas as amostras afundaram imediatamente, confirmando baixo teor de adiposo. Amostras excisadas (e quat...

Discussão

Aqui está descrito um procedimento de sobrevivência para linfadenectomia mesentérica murina segura e bem tolerada em cada uma das quatro estações de linfonodos. A principal limitação desse procedimento é a relação indireta entre a exposição e a progressão dos linfonodos ao longo da cadeia mesentérica. A primeira estação linfonodária fica facilmente e prontamente exposta em sua totalidade. A segunda estação linfonodária é frequentemente visível, e a exposição às estações^{2 a 4} p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Circuito anestésico	Qualquer		Ou anestésico injetável
Citômetro de fluxo BD LSRII (ou equivalente)	BD em Biociências		Equipado com o software FACS Diva (para citometria de fluxo) e nbsp;
Buprenorfina XR	Qualquer		Para analgesia
Mídia de cultura celular	Qualquer		(para técnicas de células vivas; ou seja, DMEM ou RPMI)
DAPI	Biolenda	422801	Concentração de trabalho: 15 ug/mL
Etanol (70% em água)	Qualquer		Para limpeza
CD45.2 (104) conjugado com FITC anti-mouse	Biolenda	109806	Concentração de trabalho: 5 ug/mL
Pinça: Pinças de ponta fina e angular	Roboz	RS-5058	Material: Dumoxel; Padrão #5, ângulo de 45 graus; Tamanho da ponta 0,1 x 0,06mm
Pinça: Pinças de ponta fina	Roboz	RS-4960	Material: Dumostar; Padrão #1; Tamanho da ponta: 0,20 x 0,12mm
Pinça: Pinças de ponta fina	Roboz	RS-4966	Material: Dumostar, ponta de Biologie; Padrão #3; Tamanho da ponta: 0,08 x 0,04mm
Lidocaína	Qualquer		Para analgesia
Agulha metálica de gavage	Qualquer		Agulha reutilizável reutilizável de gavage oral reta calibre 20/22, aço inoxidável.
Condutores de agulha	Roboz	RS-6410	Suporte de agulhas Castroviejo; Reto
OPCIONAL:      Luzes LED duplas/duplas de microscópio de pescoço de ganso	Qualquer
OPCIONAL: Corante azul Evans	Sigma	E2129-10G	Para rastreamento linfático opcional.
OPCIONAL: Microscópio de operação	Leica	MZ9.5	Microscópio operador de cabeça estéreo Leica Mz9.5
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Qualquer
Solução de povidona/iodo	Qualquer		Para preparação/esterilização da pele
Tesoura: Tesoura de ponta extra fina	Roboz	RS-5605	McPherson-Vannas; Aresta de corte de 3mm; curva (para os nós da estação 3/4)
Tesoura: Tesoura de ponta fina	Roboz	RS-5650SC	Tesouras Surecut Castroviejo (para nós da estação 1/2/3)
Tesoura: Tesoura média	Roboz	RS-5676	Noyes; Borda de corte de 13mm; Direto
Cola cirúrgica	Qualquer		Cola de tecido 3M Vetbond
Sutura: 6-0 monofilamento azul polipropilenex	Qualquer
Sutura: sutura de nylon monofilamento preto 9-0	Qualquer		(opcional) Também pode usar o 8-0 um pouco maior Tamanho do sutura.
Fixador tecidular	Qualquer		(para histologia planejada; ou seja, formalina tamponada com 10% neutro ou 4% paraformaldeído)
Bolsa térmica de circulação de água morna	Qualquer