Aqui apresentamos um método para coletar um grande volume de sangue de suínos usando canulação intracardíaca percutânea conectada a uma bomba de vácuo, como procedimento terminal.
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Artigo de método
Coleta de Sangue de Grande Volume de Suínos para Aplicações In Vitro : Uso de Canulação Intracardíaca e Bomba de Vácuo como Procedimento Terminal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A coleta de sangue de rotina é necessária em muitos estudos de pesquisa básica e aplicada. Vários métodos para coleta de sangue de suínos são bem descritos. Isso inclui o uso das veias auriculares para a coleta de pequenos volumes de sangue e as veias jugulares ou veia cava craniana para a coleta de volumes sanguíneos maiores. Alguns experimentos requerem grandes volumes de sangue de um animal individual de cada vez para análise ou uso em culturas de células primárias, o que pode ser melhor alcançado por meio de exsanguinação. O sangue coletado para cultura de células primárias deve ser processado de forma fresca e cuidadosa para manter a integridade celular. Descrevemos um método de coleta asséptica de sangue de suínos sob um plano cirúrgico de anestesia, usando um estilete de cateter intravascular de grande calibre inserido percutaneamente no coração e uma bomba de vácuo, que é eficiente, fornece um grande rendimento e minimiza a lise celular. Esta técnica é realizada uma vez em um animal, em um plano cirúrgico de anestesia, como um procedimento terminal, proporcionando risco mínimo de dor ou angústia.
Introdução
Os porcos têm sido usados em pesquisas em estudos que vão desde estudos cardiovasculares até cicatrização de feridas e toxicologia, bem como pesquisas agrícolas, imunologia e estudos de doenças1. O sangue coletado em pesquisas pode ser usado para estudar doenças, farmacologia, genética, pesquisa do sistema imunológico e descoberta de biomarcadores. A cultura celular é um dos procedimentos mais básicos feitos na pesquisa e permite que os pesquisadores estudem o comportamento e a função celular, bem como modelos de doenças e desenvolvimento de vacinas2. O cultivo de patógenos causadores de doenças, como o vírus da peste suína africana, é frequentemente feito em um meio de cultura predeterminado sob condições laboratoriais assépticas estritas. A propagação da doença pode ocorrer por invasão, disseminação ou fixação, que requerem células saudáveis e estáveis3. Os patógenos estudados podem ter um tropismo celular específico no qual podem ser propagados, e ter um grande volume de sangue produz maiores quantidades de células para usar.
Para obter um alto rendimento de células de um animal individual, para diferenciação celular, um grande volume de sangue deve ser coletado suavemente para manter a integridade celular antes da separação celular. Em suínos, o volume sanguíneo total pode ser calculado em 65 mL/kg 4,5. Em nossa experiência usando coleta de grande volume, cerca de metade do volume total de sangue de um animal pode ser recuperado. Portanto, em suínos adultos grandes, pesando até 600 libras (273 kg), é possível um rendimento de 6-8 L. Em suínos, grandes volumes de sangue podem ser coletados por via percutânea da veia cava craniana, veia jugular externa, veia safena por canulação ou coração 4,5,6. No entanto, a coleta de sangue intracardíaco com uma cânula de grande calibre permite que o maior volume de sangue seja coletado de forma eficiente com risco mínimo de lise celular. Como procedimento terminal, este deve ser realizado sob um plano cirúrgico de anestesia5. Este artigo descreve um método de uso de uma bomba de vácuo para coletar vários litros de sangue de suínos usando uma abordagem percutânea do coração com um estilete de cateter IV de grande calibre conectado a uma bomba de vácuo 7,8.
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Midwest Veterinary Services Inc. Como o método primário de eutanásia aprovado pela IACUC durante este procedimento é a exsanguinação, espera-se que alguns porcos tenham parada cardíaca devido à perda de sangue. Quando isso ocorre, um método de eutanásia secundária, como toracotomia bilateral, é realizado. Após a coleta do volume sanguíneo necessário, se houver batimentos cardíacos palpáveis, uma seringa com solução de eutanásia é anexada ao estilete e administrada por via intracardíaca como método primário de eutanásia, seguido por um método físico secundário. Os suínos são mantidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Agricultura em Pesquisa e Ensino, o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Lei de Bem-Estar Animal, conforme aplicável.
1. Preparação de materiais e animais (Tabela de Materiais e Figura 1A-C)
- Monte a tubulação em canudos de aço inoxidável e prenda a extremidade da mangueira à tubulação de bolha.
- Prenda o tubo à garrafa de rolo usando uma rolha de borracha com dois canudos de metal irregulares e uma garrafa de vidro.
NOTA: O vidro inibe o colapso do recipiente criado pela bomba de vácuo, mas qualquer material que não desmorone sob pressão pode ser usado. - Instilar assepticamente 10 mL de heparina sódica (1.000 USP/mL) através do tubo de sucção e do estilete do cateter para evitar a coagulação. Adicione assepticamente 50 mL de heparina sódica (1.000 USP/mL) em cada frasco de rolo para atingir uma concentração final de 50 UI/mL em cada litro de sangue e evitar a coagulação do sangue durante a coleta. Certifique-se de que a bomba de vácuo esteja ajustada para não mais do que 7 libras de tração para evitar danos às células.
2. Anestesia e posicionamento do animal
- Pese o animal no máximo 24 horas antes do procedimento para calcular a dose necessária dos medicamentos combinados de anestesia.
- Injete Telazol (3,0-5,0 mg / kg), cetamina (8-12 mg / kg) e xilazina (4,0-6,0 mg / kg) por via intramuscular no pescoço ou em outra barriga muscular grande (por exemplo, músculos epaxiais), usando um conjunto de extensão de 30 polegadas e agulha de 18 G x 1,5 "para induzir anestesia profunda.
NOTA: Em suínos grandes, o volume máximo recomendado de injeção IM é de 10 mL, portanto, pode ser necessário mudar de local a cada 10 mL de administração9. Embora tenhamos escolhido este coquetel, este procedimento pode ser realizado sob qualquer protocolo de anestesia aprovado pela IACUC que produza um plano cirúrgico de anestesia. - Uma vez confirmado que o animal está em um plano cirúrgico de anestesia (~ 5-8 min), sem reflexo palpebral, tônus da mandíbula frouxa e sem resposta a estímulos de dor, coloque o porco em uma mesa elevatória, chão ou outra superfície plana, em decúbito lateral direito.
- Prenda o cabelo no tórax localizado sobre o coração, se necessário, próximo ao quarto e quinto espaço intercostal, logo caudal à ponta do cotovelo.
- Se disponível, use um ultrassom (Figura 2A) para identificar o ventrículo esquerdo. Se não estiver disponível, o ventrículo esquerdo está localizado mais próximo do quarto ou quinto espaço intercostal medial ao ponto de impulso máximo8.
- Esfregue assepticamente a área com esponjas de gaze de 4 polegadas x 4 polegadas embebidas em clorexidina a 2% e esponjas de gaze de 4 polegadas x 4 polegadas embebidas em álcool isopropílico a 70%. Prepare a pele esfregando de forma circular, começando no ponto de injeção e girando para fora, por um mínimo de 3x, alternando entre os dois desinfetantes.
3. Coleta de sangue intracardíaco
- Verifique se o animal permaneceu em um plano cirúrgico de anestesia, verificando o reflexo palpebral, o tônus da mandíbula e o reflexo podal.
NOTA: Verifique a profundidade do anestésico, bem como as frequências cardíaca e respiratória, durante todo o procedimento para garantir que o animal permaneça em um plano cirúrgico de anestesia. - Remova o estilete do cateter IV. Coloque o estilete sobre o ventrículo esquerdo e avance-o perpendicularmente à pele para inserir o estilete no ventrículo esquerdo (Figura 2B). Quando o sangue começar a pulsar para fora do estilete, conecte-o ao conector da extremidade da mangueira do tubo de bolhas que está conectado ao frasco de rolos e, em seguida, ligue a bomba de vácuo (Figura 1A e Figura 2C).
- Confirme se o sangue flui em um fluxo constante. À medida que o sangue é puxado para dentro do frasco de rolo, gire suavemente o frasco para permitir a mistura do sangue com o anticoagulante para evitar a formação de coágulos.
- Depois que 1 L de sangue for coletado, use hemostáticos para prender o tubo de bolhas perto do frasco de rolo. Desconecte a rolha de borracha e aplique-a na próxima garrafa de rolo. Remova o hemostático e deixe o sangue fluir livremente enquanto gira suavemente o frasco de rolo.
- Continue este processo até que o sangue necessário seja coletado. Depois de concluído, clamp a tubulação para evitar derramamento excessivo de sangue e desligue a bomba.
- Remova o conector do tubo do estilete do cateter e conecte a seringa de pentobarbital sódico ao estilete. Puxe a seringa para garantir que um flash de sangue esteja presente e, em seguida, injete a solução de eutanásia. Confirme a morte pela ausência de batimentos cardíacos, respiração, tônus muscular e reflexos. Assim que a morte for confirmada, remova a agulha do coração e coloque em um recipiente para objetos cortantes.
- Descarte o tubo de bolhas em um recipiente de lixo biológico. Remova o sangue grosseiro dos itens de aço inoxidável restantes (por exemplo, canudos de aço inoxidável, conectores de extremidade de mangueira) usando uma escova de tubo e, em seguida, autoclave para uso futuro.
- Coloque as rolhas de borracha, canudos, conectores de extremidade de mangueira e hemostáticos limpos em uma nova bolsa de autoclave e esterilize antes do próximo uso.
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Resultados
Antes da coleta de sangue, as porcas foram pré-selecionadas para Mycoplasma hyopneumoniae, adenovírus suíno, parvovírus suíno, coronavírus suínos (gastroenterite transmissível, diarreia epidêmica suína), encefalomielite hemoaglutinante suína, síndrome reprodutiva e respiratória suína, influenza grupo A, circovírus 1 e 2 e vírus Seneca A. Repetimos esse procedimento várias vezes em porcas cruzadas Yorkshire fêmeas pesando 300-600 libras. A coleta de sangue rendeu entre 3 L dos su...
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Discussão
O procedimento aqui descreve um conjunto de cateter-estilete para bomba de vácuo para coletar um grande volume de sangue do coração de porcas. Devido ao potencial de dor e angústia, este procedimento só deve ser realizado em animais que estão em um plano cirúrgico de anestesia. A imobilidade da anestesia permite que esse procedimento seja aprendido por iniciantes e dominado rapidamente. Várias veias podem ser usadas para coletar sangue de animais. As vias mais comuns e acessíveis são as ...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer particularmente ao Plum Island Animal Disease Center Animal Resource Branch, tanto à Animal Health Techs quanto à Animal Care pela excelente assistência técnica. O financiamento para o projeto na organização de pesquisa contratada foi fornecido pelo USDA, ARS, Unidade de Recursos Animais da NBAF.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bomba de Diafragma Modelo Lab de 1/8 HP – 115 vac, 60 psi máximo e nbsp; | Centro de Suprimentos da Base & nbsp; | 80058845 | |
| 10 G x 6 pol com cateter sobre agulha | Covetrus North American Veterinary Supplies & nbsp; | 024616 | |
| Seringa de 50 mL, Luer lock | Fisher Scientific & nbsp; | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 ultrassom gel azul & nbsp; | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 001.02109.2 | |
| Tubo de bolhas de argil, não condutor (& frac14; ") | Fisher Scientific & nbsp; | NC2282605 (Catálogo de fornecedores # 8888280412) | |
| Clorexidina Q Esfoliação 2% | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 562.30804.3 | |
| Garrafas de rolo descartáveis Corning. | Fisher Scientific & nbsp; | 06-413 | |
| Corning PYREX de boca estreita, vidro de grande resistência, frasco Erlenmeyer ou similar, criando sucção | Fisher Scientific & nbsp; | 10-040F | |
| Escova de tubos de ensaio de nylon Eisco & nbsp; | Fisher Scientific & nbsp; | S13962 | |
| Tampas de borracha Fisherbrand de dois furos | Fisher Scientific & nbsp; | Depende do tamanho e do nbsp; | |
| Ketamina (10 mg/mL) e nbsp; | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 275.22100.3 | |
| MLL para a extremidade da mangueira de 6 mm (aço inoxidável) & nbsp; | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL para a extremidade da mangueira de 8mm (aço inoxidável) & nbsp; | Cadence Science | 6549IND | |
| Esponja de gaze MVet não tecida 4 x 4 compensados | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 000.30156.2 | |
| MVet álcool isopropílico 70% | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 000.50054.3 | |
| Pinça hemostática MVet Kelly reta 5,5" | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 000.36800.2 | |
| Heparina de sódio (1000 U/mL) | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 191.46701.3 | |
| Pentobarbital de sódio (390 mg/mL) | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 749.20000.3 | |
| Canudos de aço inoxidável | Lobby de Hobbies & nbsp; | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 275.40000.3 | |
| Xilazina (100 mg/mL) | Suprimentos Veterinários do Meio-Oeste | 310.01150.3 |
Referências
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Reimpressões e permissões
