Administração endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeo para induzir lesão pulmonar aguda em roedores

Resumo

Neste estudo, uma técnica não invasiva de instilação endotraqueal demonstrou desenvolver ALI em ratos usando um laringoscópio básico para garantir a entrega precisa de LPS aos pulmões. O LPS é injetado por meio de um tubo endotraqueal usando um laringoscópio. A magnitude da lesão pulmonar é avaliada em vários momentos.

Resumo

Lesão Pulmonar Aguda (LI) é uma condição inflamatória potencialmente fatal caracterizada por hipoxemia arterial, edema alveolar, integridade da barreira capilar epitelial-endotelial comprometida, seguida pela infiltração de células inflamatórias no tecido pulmonar, frequentemente progredindo para sua forma mais grave, Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA), que frequentemente culmina em insuficiência respiratória aguda. Os modelos de camundongos ALI, induzidos principalmente por lipopolissacarídeos (LPS), são uma ferramenta fundamental em pesquisas voltadas para entender os mecanismos da inflamação pulmonar e seus tratamentos. Modelos diretos e indiretos de lesão pulmonar em roedores oferecem vantagens e limitações distintas, especialmente em termos de taxa de sobrevivência, duração da fase de resolução inflamatória, riscos de trauma cirúrgico e infecção. No presente estudo, uma técnica não invasiva de instilação endotraqueal foi utilizada para desenvolver um modelo direto de ALI em ratos. Essa técnica garante a entrega focada de LPS ou material de teste nos pulmões pela via endotraqueal, com o auxílio de um laringoscópio básico. O procedimento começa com a anestesia do rato e sua posição em uma postura semi-reclinada. Em seguida, a solução de LPS é administrada próxima à abertura traqueal usando uma seringa presa a um tubo endotraqueal de rato. No momento do término do experimento, amostras pulmonares ou de lavagem são coletadas para avaliar parâmetros inflamatórios e arquitetura pulmonar. Essa técnica supera outros modelos em termos de velocidade, especificidade e confiabilidade, oferecendo direcionamento específico com dano mínimo aos tecidos, baixo risco de mortalidade e inflamação desprezível fora do local. Esse método é especialmente valioso em estudos pré-clínicos sobre ALI, SDRA e condições relacionadas como anafilaxia ou parada cardíaca. Comparativamente, esse método se integra mais com técnicas avançadas de imagem, como microscopia intravital, para monitorar a distribuição de medicamentos e a progressão da doença em tempo real.

Introdução

Lesão Pulmonar Aguda (LI) é uma condição inflamatória potencialmente fatal caracterizada por hipoxemia arterial, edema pulmonar, comprometimento da integridade da barreira endotelial-epitelial e infiltração massiva de células imunes nos^{pulmões 1}. A fisiopatologia da AL é complexa e envolve a interação e a interrupção de múltiplas vias sobrepostas e interagentes, como coagulação, lesão tecidular e inflamação pulmonar e sistêmica. A supressão rápida dessa resposta inflamatória é crucial para restaurar a homeostase dos tecidos. Se não for tratado, esse distúrbio que progride rapidamente frequentemente evolui para a Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA), uma condição mais grave definida por hipoxemia refratária. A patogênese da AL tem sido associada a lesão pulmonar e dano ou morte de células epiteliais alveolares e células endoteliais ^{microvasculares} 1,2,3,4.

A etiologia responsável pela ALI/SDRA envolve uma ampla gama de agentes infecciosos e não infecciosos, originados tanto de fontes diretas quanto indiretas de lesão pulmonar⁵. As causas diretas incluem^{pneumonia 6}, quase^{afogamento 7}, aspiração de conteúdo^{gástrico 8}, inalação de toxinas como gás^{cloro 9}, infecção^{bacteriana 10 e} infecção viral como SARS-CoV-2 11,12,13,14. Causas indiretas se originam de processos sistêmicos que exercem sua influência secundária nos pulmões, incluindo^{sepse 15}, trauma¹⁶,^{pancreatite 17}, overdose de drogas e transfusões^{de sangue 18}.

O objetivo principal desse método é estabelecer um modelo reprodutível e não invasivo de ALI em roedores por meio da administração endotraqueal de endotoxina. A justificativa para o desenvolvimento dessa técnica decorre das limitações dos métodos convencionais de administração. A técnica foi demonstrada com o objetivo de alcançar entrega direta e precisa aos alvéolos pulmonares, minimizando a exposição sistêmica e tornando-se uma abordagem promissora para futuras terapias pulmonares direcionadas. A instilação intranasal apresenta vários desafios, alguns dos quais podem impactar significativamente os resultados dos estudos, como a má direcionamento para regiões profundas dos pulmões e a variabilidade respiratória entre animais¹⁹. Outros fatores, como volume de dose limitado e possível irritação nasal, são menos críticos, mas ainda podem afetar a consistência. Em comparação, a administração endotraqueal proporciona uma entrega mais precisa e direta ao trato respiratório inferior, garantindo melhor direcionamento pulmonar e uniformidade dosística com mínima variabilidade entre os animais, tornando essa via mais eficaz e confiável para exposição pulmonar²⁰. A via da inalação é clinicamente relevante devido à sua natureza não invasiva, mas também está associada a certas limitações em pesquisas pré-clínicas, como perda de droga nas vias aéreas superiores e redução da eficácia no direcionamento das regiões distais dos pulmões. Essas limitações tornam-se mais evidentes em modelos graves, incluindo ferimentos com duplo impacto ou modelos geneticamente modificados envolvendo camundongos knock-in ou knock-out. Em contraste, a administração endotraqueal garante maior consistência para a administração direta do medicamento ao trato respiratório inferior, minimizando a perda e permitindo um direcionamento eficaz em modelos pré-clínicos complexos^{também 21}. Outra via relevante de administração utilizada em pesquisas pré-clínicas é a administração intratraqueal invasiva. Embora seja eficaz, está associado ao risco de estresse cirúrgico, infecção, variação na leitura e a necessidade de manutenção da temperatura²². Em contraste, o método endotraqueal oferece uma alternativa não invasiva confiável, tornando-o ideal para estudos que envolvem avaliações repetidas durante períodos prolongados de observação.

Esse método pode ser aplicado em modelos animais além da ALI, incluindo asma, fibrose pulmonar, DPOC, pneumonia e doenças pulmonares infecciosas. Também é relevante em áreas de pesquisa pré-clínica, como anafilaxia, parada cardíaca e arritmias cardíacas. Notavelmente, o método endotraqueal já está estabelecido na prática clínica para a administração de certos medicamentos, dependendo da urgência e do cenário^clínico 23,24,25.

Protocolo

Todas as diretrizes institucionais e da CPCSEA foram seguidas para o cuidado e uso dos animais. Os animais foram monitorados continuamente após o procedimento para garantir seu bem-estar e para cumprir as diretrizes éticas do CSIR - Instituto Indiano de Medicina Integrativa, Jammu, sob a aprovação do Comitê de Ética Animal Institucional (IAEC) número 468/87/8/2025. Este protocolo descreve a instilação endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeos (LPS) usando o método de entrega visual direta, como demonstrado anteriormente, com algumas melhorias metodológicas introduzidas no estudo^atual 26,27,28. A técnica é otimizada para induzir a ALI de forma controlada e consistente, garantindo resultados experimentais robustos enquanto mantém altos padrões de cuidado animal. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para anestesia e LPS

1. Medição de peso animal e cálculo da dose de LPS
   1. Pese cada animal usando uma balança calibrada para calcular a dose precisa de LPS. Selecionem ratos Wistar pesando entre 140-160 g para o estudo.
   2. Prepare a solução de LPS diluindo o LPS liofilizado de Escherichia coli em soro salino tampão de fosfato estéril (PBS) para alcançar a concentração desejada. É utilizada solução de LPS recém-preparada (5 μg/g de peso corporal)^29,30.
2. Indução da anestesia e tempo crítico
   1. Anestesie os animais por meio de injeção intraperitoneal de um coquetel cetamina-xilazina recém-preparado (cetamina: 75 mg/kg e xilazina: 10 mg/kg) usando 1 mL de seringa. Após a injeção, deixe aproximadamente 2 a 5 minutos para a anestesia fazer efeito, sem incomodar os animais.
   2. Confirme anestesia adequada garantindo a ausência de movimentos espontâneos e o reflexo negativo de pinçar no dedo do pé. O LPS é administrado por instilação endotraqueal de 5 a 8 minutos após a indução da anestesia. No dia do término do experimento, realize procedimentos como traqueotomia e toracotomia 4-7 minutos após a indução da anestesia.
      NOTA: A profundidade anestésica adequada é fundamental para o sucesso da instalação endotraqueal. A sobre-anestesiação pode suprimir o reflexo de vômito, enquanto a subanestesiação pode causar sofrimento ou movimento durante o procedimento. Use LPS recém-preparado para manter a consistência entre os experimentos. Monitore os animais de perto durante e após o procedimento para garantir o bem-estar adequado.

2. Instilação endotraqueal de LPS

1. Avaliação da adequação anestésica: Após a administração do cocktail anestésico, avalie a profundidade da anestesia aplicando um estímulo suave de pinça na pata. Após a confirmação do estado anestesiado, prossiga com o protocolo de instilação. Posicione o rato em uma posição semi-reclinada, suspenso por incisivos em uma plataforma sólida de suporte.
2. Visualização traqueal: Abra a boca do animal anestesiado, segure suavemente a língua usando pinças e insira cuidadosamente o laringoscópio, alinhando-o com precisão para visualizar de forma ótima a abertura traqueal. Certifique-se de que a luz esteja devidamente direcionada para iluminar a região laríngea, facilitando o acesso livre.
3. Manipulação da língua: Use pinças curvas com extremidades rombas para segurar delicadamente a língua e retraí-la suavemente para cima e lateralmente.
   NOTA: Utilize lupas portáteis para melhorar a clareza da anatomia laríngea e garantir o alinhamento meticuloso do aparelho de instalação para maior precisão.
4. Administração de LPS: Extrair 100 μL de solução de LPS na seringa e conectá-la a um tubo endotraqueal de rato de 16 G; administrar a solução de LPS próxima à abertura traqueal. Imediatamente após a instilação, oclua suavemente as narinas por 2 a 4 segundos usando pinças de extremidade romba para promover a aspiração da solução de LPS para os pulmões através da traqueia. Monitore continuamente a entrega usando um laringoscópio habilitado por fonte de luz para confirmar a administração precisa e completa.
5. Monitoramento pós-procedimental: Reposicione cuidadosamente a língua para sua orientação anatômica normal após a entrega bem-sucedida do LPS. Transfira o animal para a gaiola e monitore de perto qualquer sinal de comprometimento respiratório ou engasgamento por pelo menos 1 minuto.
6. Considerações principais
   1. Acuidade visual: Garantir o alinhamento ideal do laringoscópio para entrega precisa do LPS. Use ferramentas de ampliação para aumentar a precisão e a eficácia.
   2. Segure a língua com cuidado e segure-a contra a mandíbula inferior ou a borda da boca para estabilizá-la.

3. Coleta de amostras

1. Realize lavagem broncoalveolar (BAL) conforme descrito em estudos anteriores, com pequenas^{modificações} 31,32,33. Após a traqueotomia, infunde suavemente 2 mL de PBS frio nos pulmões e retire o líquido.
2. Centrifuge o fluido coletado a 5000 x g por 5 minutos a 4 °C e use o sobrenadante para detectar marcadores inflamatórios. Colete os pulmões para exame histopatológico ou homogeneize para a atividade da mieloperoxidase (MPO). Mantenha as amostras no gelo durante o processo de coleta para preservar a integridade da amostra.

Resultados

O modelo foi validado medindo marcadores inflamatórios, incluindo níveis de IL-1β, atividade de MPO, teor total de proteínas e histopatologia em 24 h e 120 h após a instilação de LPS. O estudo incluiu três grupos experimentais: um grupo controle (não tratado) e dois grupos submetidos à instilação de LPS, com um eutanasiado às 24 horas e o outro às 120 horas (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).

Comparado ao grupo controle, o grup...

Discussão

O método de instalação endotraqueal oferece uma abordagem não invasiva, reproduzível e direcionada para a administração pulmonar, evitando efetivamente a necessidade de intervenção cirúrgica. Esse método reduz significativamente os riscos associados a traumas cirúrgicos, como danos tecidulares, ao mesmo tempo em que minimiza o potencial de infecções pós-operatórias e danos não intencionais aos órgãos que podem surgir de procedimentos invasivos. Ao administrar agentes diretamente aos pulm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prisma 8	Graphpad	https://www.graphpad.com/features
Reagente de Bradford	Himédia, Índia	ML106-500 ML
DL-Dithiotreitol	Himédia, Índia & nbsp;	RM525-25G
Eosina & nbsp;	Loba Chemie, Índia	3660
Ácido Tetraacético Tetra Diamina de Etileno (EDTA)	Loba Chemie, Índia	6381926
Pinças & nbsp;		-
Formalin 10%	Sigma Aldrich, EUA & nbsp;	HT501320
Hematoxilina	SDFCL	74108G05
HEPES	Himédia, Índia	MB016
Peróxido de hidrogênio	Avra, Índia	7722841
Cetamina	Neon Laboratories Ltd, Índia	-
Laringoscópio	Medical Sources Co., Ltd., China & nbsp;	MS-LA500FV & nbsp;
Lipopolissacarídeo de Escherichia coli O55:B5	Sigma Aldrich, EUA	L2880
o-Di-Di-dihidrocloredro	Sigma Aldrich, EUA	D3252-5G
Soro Tampão de Fosfato (PBS) e nbsp;	Invitrogen, EUA	3002
Dihidrogênio ortófosfato de potássio	Himédia, Índia	IN26185530500
Coquetel inibidor de proteína	Sigma Aldrich	P8340
Rat IL-1 & beta; Kit ELISA	Thermofisher, EUA	BMS630
Cloreto de sódio	Himédia, Índia	TC046M
Fluoreto de sódio	Himédia, Índia	GRM7502
Ortovanadato de sódio	Sigma Aldrich, EUA	S6508
Pirofosfato de sódio	Merck, EUA	MA3M722243
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, EUA	339741
Triton X-100	Thermofisher, EUA	T8787
Xylazine	Indian Immunologicals Ltd, Índia	-