Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo fornece um protocolo detalhado com as principais etapas para orientar a engenharia e a utilização do 3D Flipwell. Descrevemos e mostramos como montar as pilhas de inserções de co-cultura e utilizá-las para co-cultura de camadas estratificadas de bactérias intestinais, epitélios intestinais e macrófagos para modelar o ambiente da mucosa intestinal.

Abstract

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Para estudar os papéis do secretoma bacteriano na polarização das células imunes e na homeostase da mucosa intestinal, desenvolvemos um modelo de co-cultura tridimensional usando inserções disponíveis comercialmente em um formato empilhado consecutivo. Denominamos esse sistema de 3D Flipwells e co-cultivamos com sucesso bactérias, epiteliais do cólon e células imunes em camadas estratificadas para recapitular o microambiente da mucosa intestinal. Este sistema de co-cultura permite a semeadura de células epiteliais do cólon de um lado da membrana e monócitos não aderentes indiferenciados do outro, permitindo a progressão síncrona da polarização epitelial do cólon, formação de muco e diferenciação e polarização de monócitos-macrófagos dentro de uma única co-cultura sem a necessidade de descolamento e replaqueamento de macrófagos pré-diferenciados. Este sistema é fácil de construir e requer apenas alguns materiais e ferramentas prontamente disponíveis. Testamos sua utilidade analisando as respostas dos componentes da co-cultura à sepiapterina (SEP), o precursor endógeno do BH₄ (tetrahidrobiopterina) - um cofator da óxido nítrico sintase (NOS). Demonstramos que o tratamento com SEP de 3D Flipwell induziu a formação de biofilme por bactérias intestinais, produção de muco pelo epitélio do cólon e polarização pró-imunogênica de macrófagos. Isso indicou que o SEP desencadeou a ativação de um mecanismo de defesa da mucosa por meio de crosstalk entre diferentes componentes celulares. Mais experimentos são necessários para investigar o papel das comunicações mucosas que levam à reprogramação de células imunes e para avaliar a utilidade desse sistema de co-cultura para rastrear novas terapias imunomoduladoras.

Introduction

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A interferência do microbioma imunológico célula-intestino influencia muito a eficácia de diferentes tratamentos de doenças. Essa interferência é marcadamente modificada por estímulos externos, incluindo, mas não se limitando a, anormalidades metabólicas do hospedeiro, mudanças na dieta, manifestação da doença e tratamento farmacológico. Essas mudanças podem levar a um desequilíbrio na composição da microflora, uma condição denominada disbiose ^1,2,3.

Para entender melhor as interações entre micróbios e células imun....

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Protocol

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1. 3D engenharia Flipwell

Todo o trabalho deve ser feito dentro de um gabinete de cultura de células. Coloque todos os suprimentos dentro do gabinete.
Abra a tampa da placa de Petri e reserve. Abra a lâmina do bisturi de seu invólucro protetor e coloque-a na borda do fundo da placa de Petri. Garanta a esterilidade.
CUIDADO: É necessário um manuseio cuidadoso da lâmina do bisturi. Use luvas reforçadas com fibra resistentes a cortes para proteger as mãos, se necessário.
Abra a embalagem protetora estéril do inserto comercial de 12 poços. Garanta a esterilidade. Pegue um conjunto de pin....

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Results

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Para determinar a relevância biológica das co-culturas Flipwell de bactérias intestinais, epitélios do cólon e macrófagos, tratamos as co-culturas com sepiapterina (SEP), um modulador do metabolismo da arginina, para promover a produção de óxido nítrico ^9,10,11 em comparação com o DMSO controle. Determinamos os efeitos do tratamento com SEP em cada componente das co-culturas usando microscopia i.......

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Discussion

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Para recriar a arquitetura da mucosa intestinal in vitro, projetamos um sistema de co-cultura simples que compreende camadas estratificadas de bactérias intestinais, células epiteliais do cólon produtoras de muco e macrófagos. Este sistema de multi-co-cultura nos permitiu estudar os efeitos da diafonia entre o secretoma bacteriano, o epitélio intestinal e os macrófagos na indução da reprogramação imunogênica e dos mecanismos de defesa da mucosa.

Um do.......

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Disclosures

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Os autores declaram não haver conflito de interesses. Os autores se isentam de todas as garantias, expressas ou implícitas, em toda a extensão permitida por lei. Sob nenhuma circunstância os autores serão responsabilizados, seja sob qualquer estatuto, contrato, ato ilícito ou qualquer outra teoria legal, por quaisquer danos especiais, incidentais, indiretos, punitivos, múltiplos ou conseqüentes decorrentes ou relacionados ao uso de ferramentas na construção dos Flipwells, o uso de reagentes BSL, linhagens celulares, culturas bacterianas, o uso do sistema Flipwell em ambiente anaeróbico em uma câmara anaeróbica. Esta limitação de responsabilidade inclui, mas não se limita a, qualquer forma não especificada de uso da Flipwell não explicitamente descrita neste documento.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O autor principal expressa sincera gratidão à Dra. Saori Furuta por suas excelentes habilidades de orientação, orientação e apoio contínuos em longas distâncias e design de projeto habilidoso e contínuo que promove oportunidades fantásticas de aprendizado. Os autores também agradecem à Dra. Vandana Sharma pela experiência e orientação em microbiologia e ao Dr. Veani R. Fernando pela preparação de macrófagos THP-1. Além disso, os autores agradecem aos Drs. Andrew Kleinhenz e William T. Gunning, da Instalação de Microscopia Eletrônica, e Cassandra Zamora e Kristin Kirschbaum, do Centro de Instrumentação da Universidade de Toledo, por s....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4% de PFA (veja a receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Pipeta sorológica de 10 ml	Corning	4488
Placa TC de 12 poços, Costar	Corning	3513
Tubos cônicos de 15 ml, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 & micro; L dicas	USA Scientific	1111-1700
Inserts de 24 poços - Inserts de cultura para chapas de 24 poços, PET 0.4 e micro; m	BrandTech Scientific	782710
Flipwells 3D prontos, esterilizados por UV	Laboratório de fabricação
4% de PFA (veja receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Estoque de 50 mM de Sepiapteria (SEP, veja a receita em Reagentes e Solução)	Carreira Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Tubos cônicos de 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Pipeta sorológica de 5 ml	Corning	4487
70-95% de etanol (álcool etílico)	Laboratórios de Descontaminação	04-355-151
Papel alumínio	Fisher Scientific	01-213-100
Agulhas de alimentação animal, calibre 20 1,5" comprimento, uso único	Fisher Scientific	01-208-87
Buffer de Diluição de Anticorpos (veja a receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Câmara Celular Attofluor	ThermoFisher Scientific	A7816
Fita de autoclave	Fisher Scientific	15-901-111
Cepas de Bacillus subtilis wt (3A1T) em estoque de glicerol ()	Centro de Estoque Genético Bacillus (https:// bgsc. org/
Luvas BioGrip Pink Nitrile sem pó sem látex	Manufatura de Alta Qualidade	P2810
Buffer de Bloqueio (veja a receita em Reagentes e Soluções - 10% Soro Normal de Cabra em PBS)	Descrito no texto
Buffer de Bloqueio (veja receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Microscópio de campo claro (Nikon ou equivalente) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Células Caco-2	ATCC	HTB-37
Incubadora de cultura celular, 37 e graus; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Centrífuga (Eppendorf, Centrífuga 5804/5804 R ou equivalente	Eppendorf	22622501
Tubos centrífugas de 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Inserções de cultura para placa de 12 poços, PET, 0,4 e micro; m, estéril	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2em1, BIO-CERT	782730
Meio de montagem DAPI VectaShield	Laboratórios Vector	H-1000
Fundo profundo de placa de Petri, placa de Petri empilhável de poliestireno de 100 x 25 mm, estéril & nbsp;	USA Scientific	8609-0625
XP de auxílio de pipeta Drummond	Drummond	4-000-101
Centrífuga Eppendorf 5804 com rotor de balde oscilante para tubos cônicos de 50 ml	Eppendorf	22622501
Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x sets	VWR	82027-438
Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x conjuntos, Pinças de Amostra	VWR	82027-438
Frasco de vidro 500 ml	Corning	4980-500
Hemacitômetro (Neubauer com lâminas de cobertura)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
Células HT-29-MTX-E12	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (opcional)	Fisher Scientific	4021761EA
Luvas à base de Kevlar ou outras luvas resistentes a cortes (opcional)	Loja de ferragens ou Amazon
Fita de laboratório ou fita de transporte	Fisher Scientific & nbsp;	159015R
Exaustor de fluxo laminar Série 1300 A2 BSC Classe II	ThermoFisher Scientific	1375
Exaustor de fluxo laminar com luz UV SterilGARD	A Companhia Baker	SG403A-HE
Marcadores à prova de solvente	VWR	52877-310 ou 95042-566
Mídia para células Caco-2 (DMEM à base de alta glicose, veja receita em Reagentes e Soluções)	descrito em Texto
Mídia para células HT-29 (DMEM Alta Glicose, veja a receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Mídia para células THP-1 (RPMI, veja a receita em Reagentes e Soluções)	Descrito no texto
Tubo de microcentrífuga, 1,7 ml, estéril & nbsp;	Alkali Scientific	C3017-ST
Tubos microcentrífugas	Thermo Fisher	3451
Mídia Miller LB (veja receita em Reagentes e Soluções)	Sigma-Aldrich	L3522
Alicate de bico fino, 2x séries	Loja de ferragens ou Amazon
Luvas Aurelia Amazing sem pó de nitrilo sem látex	Ciência Média	92885
Tampas para placa de Petri, estilo estéril da placa de Petri Falcon 100x15 mm	Corning Inc	351029
Acetato de miristato de forbol (PMA) (100 ng/μ l, veja receita em Reagentes e Soluções) e nbsp;	InvivoGen	Tlrl-pma
Pontas de pipeta (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l) PurePoint ou equivalente	Alkali Scientific & nbsp;	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Filme plástico	Mercearia
Solução de colagenose de trabalho Purecol (100 & micro; g/mL)	BioMatrix Avançada	5005-100ML
Tampa redonda #1 1 oz (Corning Float Glass ou Fisherbrand)	Corning ou Fisherbrand	50143822 ou 12-546-2 25CIR-2
Lâminas de bisturi, estéreis, descartáveis	Mopec ou Pena #10	AJ136 ou 2975#10
Sepiapterina (setembro, 100 & micro; M, veja a receita em Reagentes e Solução)	Carreira Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Incubadora de agitação ajustada para 220 rpm 37° C	Eppendorf New Brunswick Scientific	M12990080
Cola de silicone Loctite Silicone Transparente IDH ou 3M Selante de silicone Grau Marinho Transparente com ponta de nariz	Loctite ou 3M	1745658 ou PN08019
Pipeta de canal único Eppendorf Research Plus, 200 & micro; l	Eppendorf
Pipetas de canal único (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l)	Eppendorf	2231001122
Espectrofotômetro NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Água estéril deionizada
Serina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésio	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Seringa 3 ml ou 5 ml com ponta Luer-Lok	BD	309585 ou 309603
Células THP-1	ATCC	TIB-202
Pipetas de transferência, estéreis	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Solução azul de tripan	VWR	97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Limpa Kimwipes Professional com Poliescudo Anti-Estatísticas LintGuard	Kimberly-Clark	34120
Anticorpos Primários:
Anti-humano CD163	Abcam	156769
Anti-humano CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 mg
Anti-humano CD80, E3Q9V	Tecnologias de Sinalização Celular	15416
CK20 anti-humanos;	Tecnologias de Vida	PA5-82875
MUC2 anti-humano (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
Anticorpos secundários:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (para CD80 e CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (para MUC2 e CD68 ou CD163)	ThermoFisher	A11005
Reagentes e Soluções:
Caco-2 Médio:
DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inativado por calor	Sigma	F2242-500ML
Aminoácidos não essenciais 1% para meio Caco-2	Thermo Fisher Scientific	11140076
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
HT-29-MTX Média
DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) inativado por calor	Sigma	F2242-500ML
HEPES (concentração final de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
THP-1 Médio:
Soro fetal bovino inativado por calor (FBS) (10% v:v)	Sigma	F2242-500ML
Glicose (concentração final de 4,5 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax 1% (v:v) Concentração final de 2 mM	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (concentração final de 10 mM)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
Instituto Memorial Roswell Park (RPMI)-1640 médio	Thermo Fisher Scientific	11875119
Piruvato de sódio (1 mM de concentração final)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Purecol (diluição a 1:30 100 & micro; G/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 & micro; g/ml	BioMatrix Avançada	5005-100ML
Água estéril desionizada
L-Sepiapterana (50 mM):
L-Sepiapterana (SEP)	Carreira Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Phorbol (PMA, 5 mg/mL)	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1% albumina sérica bovina	Sigma-Aldrich	5470
DMSO	Sigma	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	L3522
Soro normal da mesma espécie do anticorpo secundário	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

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