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Artigo de método

Engenharia 3D Flipwell para o desenvolvimento de sistemas assíncronos para terapias toxicológicas e imunomoduladoras em células bacterianas, intestinais e imunológicas

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DOI:

10.3791/68701

⸱

17 de outubro de 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Neste artigo

Resumo

Este artigo fornece um protocolo detalhado com as principais etapas para orientar a engenharia e a utilização do 3D Flipwell. Descrevemos e mostramos como montar as pilhas de inserções de co-cultura e utilizá-las para co-cultura de camadas estratificadas de bactérias intestinais, epitélios intestinais e macrófagos para modelar o ambiente da mucosa intestinal.

Resumo

Para estudar os papéis do secretoma bacteriano na polarização das células imunes e na homeostase da mucosa intestinal, desenvolvemos um modelo de co-cultura tridimensional usando inserções disponíveis comercialmente em um formato empilhado consecutivo. Denominamos esse sistema de 3D Flipwells e co-cultivamos com sucesso bactérias, epiteliais do cólon e células imunes em camadas estratificadas para recapitular o microambiente da mucosa intestinal. Este sistema de co-cultura permite a semeadura de células epiteliais do cólon de um lado da membrana e monócitos não aderentes indiferenciados do outro, permitindo a progressão síncrona da polarização epitelial do cólon, formação de muco e diferenciação e polarização de monócitos-macrófagos dentro de uma única co-cultura sem a necessidade de descolamento e replaqueamento de macrófagos pré-diferenciados. Este sistema é fácil de construir e requer apenas alguns materiais e ferramentas prontamente disponíveis. Testamos sua utilidade analisando as respostas dos componentes da co-cultura à sepiapterina (SEP), o precursor endógeno do BH4 (tetrahidrobiopterina) - um cofator da óxido nítrico sintase (NOS). Demonstramos que o tratamento com SEP de 3D Flipwell induziu a formação de biofilme por bactérias intestinais, produção de muco pelo epitélio do cólon e polarização pró-imunogênica de macrófagos. Isso indicou que o SEP desencadeou a ativação de um mecanismo de defesa da mucosa por meio de crosstalk entre diferentes componentes celulares. Mais experimentos são necessários para investigar o papel das comunicações mucosas que levam à reprogramação de células imunes e para avaliar a utilidade desse sistema de co-cultura para rastrear novas terapias imunomoduladoras.

Introdução

A interferência do microbioma imunológico célula-intestino influencia muito a eficácia de diferentes tratamentos de doenças. Essa interferência é marcadamente modificada por estímulos externos, incluindo, mas não se limitando a, anormalidades metabólicas do hospedeiro, mudanças na dieta, manifestação da doença e tratamento farmacológico. Essas mudanças podem levar a um desequilíbrio na composição da microflora, uma condição denominada disbiose 1,2,3.

Para entender melhor as interações entre micróbios e células imunes do hospedeiro no intestino, sistemas elaborados de co-cultura foram desenvolvidos por diferentes grupos na tentativa de recapitular o ambiente da mucosa intestinal. Desde o sistema gut-on-chip desenvolvido por Kim et al.4 até uma montagem mais complexa usando um substrato absorvente especializado5, esses sistemas de co-cultura não são simples de construir e são incapazes de reter todo o espectro de componentes secretados devido à sua absorção pelo substrato de co-cultura. Noel et al. desenvolveram assim um sistema alternativo de co-cultura para modelar a mucosa intestinal que é relativamente mais fácil de fabricar6. Este novo sistema utiliza um único inserto de cultura com células epiteliais do cólon semeadas em um lado da membrana e macrófagos pré-diferenciados no outro lado6. No entanto, a semeadura de macrófagos pré-diferenciados requer sua pré-diferenciação em outro lugar e sua dissociação e replaqueamento em uma co-cultura, afetando potencialmente sua integridade celular e viabilidade.

Ao incorporar melhorias a esses sistemas anteriores, desenvolvemos um novo sistema de co-cultura tridimensional (3D) multicamadas que chamamos de sistema 3D Flipwell 7,8. Este sistema é composto por inserções de cultura de células empilhadas consecutivamente, permitindo a progressão síncrona da polarização epitelial do cólon, formação de muco, diferenciação de macrófagos e polarização dentro de uma única co-cultura. Este sistema nos permite examinar as mudanças no ambiente da mucosa intestinal e as interações entre bactérias intestinais, células epiteliais e células imunológicas. Além disso, esse sistema pode ser usado para examinar os efeitos de estímulos externos, incluindo metabólitos bacterianos, toxinas, nutrientes dietéticos e produtos farmacêuticos, na mucosa intestinal e no resto do corpo 7,8.

Ao utilizar o novo sistema de inserção de co-cultura, examinamos as respostas de diferentes componentes celulares à sepiapterina (SEP), o precursor endógeno do BH4 (tetrahidrobiopterina) - um cofator da óxido nítrico sintase (NOS). Mostramos anteriormente que o SEP exerce atividades pró-imunogênicas no microambiente do tumor de mama, reprogramando macrófagos associados ao tumor para um tipo pró-imunogênico 9,10,11,12. Demonstramos que o SEP induz eventos síncronos de formação de biofilme por bactérias intestinais, produção de muco pelo epitélio do cólon e polarização pró-imunogênica de macrófagos em co-culturas, indicando ativação de um mecanismo de defesa da mucosa7. Essas descobertas apóiam a utilidade desse novo sistema de co-cultura na modelagem do microambiente da mucosa intestinal7.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer instruções passo a passo para a construção desta nova co-cultura de bactérias intestinais, epitélios intestinais, muco e células imunes para modelar o ambiente da mucosa intestinal. Também demonstramos como podemos visualizar a diafonia de células co-cultivadas sob a influência de um estímulo externo, por exemplo, tratamento com SEP. Mais pesquisas utilizando esse sistema de cocultura são necessárias para determinar os componentes celulares secretados que facilitam as interações entre diferentes células na cocultura, bem como para testar a utilidade desse modelo de cocultura para triagem de alto rendimento de novas terapias. Além disso, para atingir a condição fisiológica do ambiente da mucosa intestinal, esse sistema de co-cultura exigiria modificações adicionais. Por exemplo, para co-cultivar células aeróbicas de mamíferos com bactérias anaeróbicas, essas bactérias precisariam ser cultivadas separadamente em meios anaeróbicos que removem o oxigênio ou sobrepostas com parafina líquida que impede a entrada de oxigênio, conforme relatado em outro lugar. Essa utilidade avançada e aplicação desse sistema de co-cultura justificariam uma investigação mais aprofundada.

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Protocolo

1. 3D engenharia Flipwell

  1. Todo o trabalho deve ser feito dentro de um gabinete de cultura de células. Coloque todos os suprimentos dentro do gabinete.
  2. Abra a tampa da placa de Petri e reserve. Abra a lâmina do bisturi de seu invólucro protetor e coloque-a na borda do fundo da placa de Petri. Garanta a esterilidade.
    CUIDADO: É necessário um manuseio cuidadoso da lâmina do bisturi. Use luvas reforçadas com fibra resistentes a cortes para proteger as mãos, se necessário.
  3. Abra a embalagem protetora estéril do inserto comercial de 12 poços. Garanta a esterilidade. Pegue um conjunto de pinças estéreis. Pegue suavemente a inserção e remova-a da embalagem.
  4. Segure a inserção de forma que a parte inferior fique voltada para cima. Com a outra mão, pegue a lâmina de bisturi estéril e leve-a até a inserção.
  5. Usando um movimento em forma de C, perfure a membrana na borda e deslize suavemente a lâmina do bisturi ao redor da parte inferior da inserção, ficando perto da parede de plástico.
  6. Corte a membrana PET e use o segundo conjunto de pinças para remover a membrana. Descarte a membrana.
  7. Use a lâmina do bisturi para raspar qualquer aparas de membrana branca para limpar a borda e a borda da inserção. Coloque cuidadosamente o inserto recém-preparado de volta em sua embalagem estéril original.
  8. Em seguida, pegue o tubo adesivo de silicone e corte a ponta do bico com a lâmina do bisturi para fazer uma abertura. Esta abertura deve ter 3 mm de largura.
  9. Teste o tamanho do cordão espremendo a cola na toalha de papel. O cordão deve ter 2-3 mm de espessura. Ajuste o bico se o cordão for inferior a 2 mm e for difícil de espremer para fora do tubo.
    1. Outra maneira de aplicar e espalhar o cordão de cola é usar uma ponta de pipeta de 200 μL com a ponta cortada. Apare 3-4 mm com uma tesoura e use uma espátula para espalhar a cola ao redor da borda da inserção.
  10. Retire a tampa protetora da segunda inserção e reserve. Pegue uma pinça estéril, pegue a segunda inserção de sua embalagem com a membrana voltada para cima.
  11. Espalhe suavemente um cordão fino de silicone de 2-3 mm ao redor da parte inferior da inserção, tomando cuidado para não tocar na membrana.
  12. Pegue o segundo conjunto de pinças estéreis e levante cuidadosamente a primeira inserção (sem a membrana) de sua embalagem protetora.
  13. Junte as duas inserções de baixo para baixo para que os aros inferiores se alinhem. O excesso de cola pode ser forçado para fora da junta. Deixe a cola secar. Pode ser cortado após a cola estar completamente seca (24-72 h). Isso é opcional.
    NOTA: A pilha final do Flipwell Co-culture Insert (FCI) deve ter apenas uma membrana PET no meio. É melhor ter as alças em forma de L das inserções comerciais posicionadas de forma que fiquem a 180° de distância uma da outra (às 3 e 6 horas). Siga as recomendações do fabricante da cola de silicone para o tempo de secagem, que pode ser de 24 a 72 h, dependendo da marca. Para a maioria das colas à base de silicone, é preferível um tempo de secagem de 72 h. A cola também pode ser seca por apenas 24 h com esterilização UV.
  14. Quando a pilha FCI estiver colada, coloque-a dentro da embalagem estéril original para secar ou dentro de uma placa de Petri funda. Use a tampa das placas de Petri especificadas para cobrir o conjunto da pilha.
  15. Para esterilizar os conjuntos de pilha, abra a tampa da placa de Petri. Use uma pinça estéril para entregar a pilha FCI na borda da borda da placa de Petri profunda especificada.
  16. Feche o caixilho de vidro do gabinete BSC. Ligue a luz UV. Afaste-se do gabinete por segurança e esterilize cada lado da membrana por 30 min-1 h. Desligue a luz UV quando cada ciclo de esterilização estiver concluído.
  17. Coloque a tampa da placa de Petri (conforme especificado) sobre a placa de Petri com as pilhas de inserção e reserve.

2. Teste de vazamento antes do revestimento de colágeno

  1. Remova a tampa da placa de Petri. Adicione 500 μL de PBS estéril ou água deionizada estéril.
    NOTA: Para auxílio visual, o DMEM foi usado para auxiliar na visualização da integridade das pilhas FCI.
  2. Cubra a placa de Petri. Deixe descansar durante a noite. Verifique a integridade da FCI pela manhã. Descarte os FCIs se for detectado vazamento. Faça novas pilhas de pastilhas conforme necessário.
  3. Aspire o líquido (PBS ou água) usado para o teste. Cubra a placa de Petri com uma tampa.
  4. Deixe as pilhas secarem (1-2 h) dentro do BSC. Armazene os FCIs em um BSC até que estejam prontos para uso ou prossiga para revesti-los com colágeno para semear as células aderentes.

3. Revestimento de colágeno da membrana Flipwell

  1. Preparar um material de trabalho da solução de colagénio diluindo a solução de colagénio fornecida a 3 mg/ml até uma diluição de 1:30 a 100 μg/ml. Adicione 33 μL de solução de colágeno fabricada comercialmente a 1 mL de água deionizada estéril em um tubo de microcentrífuga. Misture por vórtice.
    NOTA: Para um volume maior, aumente a escala e use um tubo cônico de 15 mL, dependendo do número de pilhas de inserção a serem revestidas em ambos os lados da membrana. Faça isso fresco a cada vez. Não reutilize o material de trabalho.
  2. Abra a tampa da placa de Petri. Deixe o Flipwell pendurado na borda da placa de Petri. Adicione cuidadosamente 200 μL de solução de colágeno a um lado da pilha de inserções.
  3. Deixe descansar por 1 h. Aspire a solução de colágeno. Adicione 200 μL de PBS estéril. Aspirar PBS.
  4. Cubra a placa de Petri com a tampa e deixe a membrana secar por 60 min dentro do gabinete. Quando a membrana estiver seca, pegue a pinça / pinça estéril e vire o Flipwell para o lado oposto e deixe-o pendurado na borda da placa de Petri.
  5. Adicione 200 μL de solução de colágeno no lado não revestido (agora superior) da membrana. Deixe descansar por 1 h.
  6. Aspire a solução de colágeno. Adicione 200 μL de PBS estéril. Aspirar PBS. Cubra a placa de Petri com uma tampa e deixe a membrana secar por 60 min dentro do gabinete. Deixe a pilha FCI secar durante a noite ou semear no mesmo dia.
    NOTA: A integridade do revestimento de colágeno não foi testada em condições de armazenamento prolongado. Uma vez que os Flipwells são pré-revestidos, eles devem ser usados dentro de 24 horas.

4. Construção de inserto bacteriano para culturas bacterianas

  1. Coloque dois conjuntos de pinças estéreis e as inserções de 24 poços dentro do BSC. Abra cuidadosamente as inserções e deixe-as dentro de sua embalagem estéril.
  2. Com uma pinça estéril, retire a inserção de sua embalagem estéril. Com o segundo conjunto de pinças/pinças, quebre os pequenos pés de plástico na parte inferior da inserção.
  3. Teste o inserto de 24 poços encaixando-o dentro de uma das pilhas FCI estéreis ou insertos originais de 12 poços.
  4. Se a inserção não estiver deslizando para dentro do poço, use uma pinça novamente para quebrar mais material plástico do aro onde o aro e os pés se encontram.
  5. Teste o ajuste novamente até que o inserto de 24 poços seja capaz de deslizar dentro do poço de inserto de 12 poços. Coloque o inserto dentro de sua embalagem estéril ou dentro de uma placa de Petri estéril.
  6. Esterilize UV ou etanol o inserto (opcional). Cubra a embalagem novamente ou cubra com a tampa da placa de Petri até a hora de usar.

5. Construção da agulha

  1. Traga as ferramentas e todos os suprimentos dentro de um BSC. Segure uma agulha cuidadosamente com o alicate de ponta.
  2. Meça a localização de cada dobra na agulha usando uma régua. Com o segundo conjunto de alicates de ponta, segure a agulha no local selecionado e dobre a agulha.
  3. Crie a segunda dobra. Para torcer a agulha, segure a agulha com um alicate na base e na curva em forma de U e gire na direção oposta para criar uma torção de 4-5 mm. Esta etapa é fundamental para inserir facilmente a agulha dentro do Flipwell para a remoção da bolha de ar.
  4. Fixe a agulha em uma seringa estéril de 3 ou 5 mm. Esterilize a agulha e a base da seringa em 20 mL de etanol a 70% -95% dentro de um tubo cônico de 50 mL.
  5. Puxe o etanol pela agulha e pela seringa para garantir que a agulha e a base da seringa estejam esterilizadas.
  6. Retire a seringa e a agulha do tubo cónico com etanol e deixe secar ao ar sobre uma placa de Petri. Purgue a agulha com ar para secar e deixe-a secar por alguns minutos.

6. Semeando as linhas celulares epiteliais do cólon Caco-2: HT29-MTX-E12

  1. Comece a cultivar as linhas celulares Caco-2 e HT29-MTX 2-3 semanas antes do experimento em placas separadas revestidas com TC de 100 mm em seus respectivos meios de crescimento.
    1. Para meios HT-29-MTX, use 440 mL de DMEM com alta glicose (4,5 g/L) e 1% (v:v) de meio Glutamax com 50 mL de FBS inativado por calor a 10% (v:v), 5 mL de 1% (v:v) de Pen Strep e 5 mL de concentração final de HEPES 10 mM.
    2. Para meios Caco-2, use 440 mL de DMEM com glicose alta (4,5 g/L) e meio Glutamax a 1% (v:v) com 50 mL de FBS inativado por calor a 10% (v:v), 5 mL de Pen Strep a 1% (v:v) e 5 mL de aminoácidos não essenciais.
      NOTA: Determine a densidade de semeadura para a linha celular Caco-2 usando poços de placa de 12 poços revestidos com cultura de tecidos. Calcule o número de dias para 100% de confluência, dependendo da densidade inicial de semeadura. Fornecemos uma densidade de semeadura como diretriz; no entanto, isso varia de acordo com a formulação da mídia de crescimento, o fornecedor e o FBS usado. Esta etapa é fundamental para garantir uma monocamada para o lado epitelial intestinal do Flipwell após as células THP-1 serem plaqueadas e os tratamentos bacterianos/SEP serem realizados.
  2. Para passar as células Caco-2 e HT-29, aspire os meios de cultura. Lave com 10 mL de PBS.
  3. Tripsinize as células adicionando 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25%. Incubar 5-10 min a 37 °C com 5% de CO2.
  4. Adicione 7 mL do meio de crescimento adequado à célula às placas. Transfira as células para tubos cônicos estéreis separados de 15 mL.
  5. Pellet por centrifugação por 5 min a 500 x g à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento celular.
  6. Ressuspenda o pellet em 1 mL de meio HT-29 pré-aquecido à base de DMEM. Conte as células com um hemacitómetro ou um contador de células.
  7. Combine os dois tipos de células Caco-2:HT-29 com uma proporção de 9:1 em um novo tubo cônico de 15 mL ou 50 mL, dependendo do número de células necessárias para o número desejado de Flipwells.
  8. Use Flipwells pré-revestidos com colágeno para as etapas abaixo. Pendure as pilhas de FCI pré-revestidas com colágeno na borda da placa de Petri profunda.
  9. Semear 500 μL de 7,5 x 10,4 células porcm2 (2,6 x 10,5 células/inserção de 12 poços) por lado apical de Flipwell. Calcule as contagens iniciais de células com base no número de pilhas que estão sendo usadas. Isso incluirá os dois tipos de células na proporção de 9:1.
  10. Cubra os conjuntos com uma tampa de placa de Petri. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite até que as células se fixem. As células começam a produzir muco em torno de 7 a 10 dias em cultura. Mude de mídia a cada dois dias para manter as culturas.
    NOTA: O total de dias em cultura com tratamentos precisa ser calculado com antecedência. A densidade de inversão e semeadura inicial dependerá dessa duração.

7. Invertendo o Flipwell 3D em preparação para semear células THP-1

  1. Quando as células Caco-2: HT-29 se ligarem e começarem a proliferar (a confluência exata precisa ser estimada com base no meio / FBS usado e na duração da cultura), mas não estiverem em 100% de confluência, vire o Flipwell para semear células THP-1 do outro lado da membrana.
    NOTA: As células THP-1 precisam ter sido expandidas em uma cultura separada até este ponto, e o número exato de células necessárias será estimado com base no número de pilhas de FCI usadas.
  2. Abra a tampa da placa de Petri e aspire o meio DMEM do lado apical (epitelial intestinal) da pilha FCI.
  3. Usando uma pinça estéril, pegue o Flipwell cuidadosamente pelo gancho e gire 180°. Com o segundo conjunto de pinças estéreis, agarre a pilha FCI pelo outro gancho que agora está voltado para cima.
  4. Abaixe o conjunto de volta na placa de Petri e pendure o gancho sobre a borda da placa de Petri. Se não estiver pronto para semear as células THP-1, adicione meio suficiente à placa de Petri profunda para elevar o nível do meio e apenas para o topo da membrana.
    NOTA: O Flipwell deve estar estável nesta posição, e a semeadura com células THP-1 e adição de mídia deve ser considerada imediatamente. Essas etapas são feitas rapidamente. As células THP-1 precisam ser contadas e prontas para serem plaqueadas. As células THP1 foram semeadas primeiro para pesar a pilha de FCI para maior estabilidade e peso final. O meio DMEM foi então adicionado à placa de Petri profunda para trazer o nível do meio até a parte inferior da membrana. A agulha feita sob medida foi então usada para remover a bolha de ar, o que estabilizou ainda mais a pilha de FCI e permitiu os ajustes finais de volume.
  5. Use a agulha para remover a bolha de ar conforme descrito na etapa a seguir.

8. Remoção de bolhas de ar

  1. Pré-esterilize a agulha e a seringa em etanol e seque ao ar antes de usar (consulte a etapa 5). Mergulhe o êmbolo da seringa.
  2. Segure a pilha FCI pelo braço com uma pinça estéril. Abaixe cuidadosamente a agulha dentro e sob o conjunto de inserção e coloque com muito cuidado a ponta macia da agulha de gavagem até a bolha de ar.
  3. Com cuidado e muito lentamente, puxe o êmbolo da seringa para cima e observe a bolha de ar desaparecer lentamente. Pare quando a bolha de ar tiver cerca de 2 mm de diâmetro, o que é suficiente para reter uma boa cobertura de DMEM para as células epiteliais do cólon.
  4. Remova cuidadosamente a agulha e a seringa do Flipwell. Prossiga para o outro conjunto de pastilhas na placa de Petri profunda.

9. Semeadura THP-1 e tratamento com PMA

  1. Faça o meio THP1 com 420 mL de meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 50 mL de FBS inativado por calor a 10% (v:v), 5 mL de Glutamax 1% (v:v), 5 mL de HEPES (concentração final de 10 mM), 11 mL de glicose (concentração final de 4,5 g/L) e 5 mL de Pen-Strep (1% v:v).
    NOTA: As células THP-1 precisam ser cultivadas em meio de cultura à base de RPMI por vários dias antes de serem semeadas nas pastilhas. Faça cálculos de contagem de células antes da propagação e aumente a escala com base no número de pilhas de FCI a serem usadas.
  2. Prepare a suspensão celular com base no volume de 500 μL e a 0,5 x 106 células por 500 μL de meio THP-1. Se o PMA precisar ser usado para diferenciação e polarização, adicione-o ao meio RPMI a 100 ng/μL.
    1. Para fazer PMA, reconstitua 5 mg de acetato de miristato de forbol (PMA) em 1 mL de DMSO para fazer 5 mg / mL de solução estoque. Misture por vórtice. Alíquota em tubos de microcentrífuga a 20 μL cada e armazenar a -20 °C.
    2. Para usar o PMA, faça um estoque de trabalho a 50 μg / mL diluindo 1 μL de estoque de 5 mg / mL em 99 μL (1:100) de meio de crescimento completo. Adicione 1 μL de material de trabalho a 500 μL de mídia ou 20 μL de material de trabalho a 10 mL de mídia.
  3. Centrifugue as células THP-1 a 94 x g por 5 min em RT para granular. Ressuspenda em 5-10 mL de mídia RPMI. Conte as células THP-1 com qualquer método de contagem preferido.
  4. Centrifugue novamente a 94 x g por 5 min em RT. Ressuspenda a 0,5 x 106 células por 500 μL de meio THP-1.
  5. Adicione 500 μL de suspensão de células THP-1 ao lado apical da pilha de insertos de cocultura. Ajuste o meio HT-29 para as células epiteliais do cólon adicionando meio à placa de Petri do poço profundo.
  6. Remova a bolha de ar com uma agulha de gavagem conforme a etapa 8, se necessário. Cultive ambos os tipos de células na incubadora de cultura de células a 37 ° C, 5% de CO2, 100% de umidade até que as células THP-1 se liguem (durante a noite) e proliferem por 1-2 dias.
  7. Prepare-se para fazer tratamentos com SEP ou outros medicamentos ou prepare-se para inserções bacterianas (consulte a etapa 4). Comece a cultivar bactérias 1 dia antes da próxima troca de pilha FCI.

10. Segundo Flipwell Flip e remoção de bolhas de ar para SEP e inserções bacterianas

  1. Abra a tampa da placa de Petri. Aspire o meio RPMI do lado apical. Segure o Flipwell pelo braço com uma pinça estéril e levante a pilha.
  2. Gire a pilha de cabeça para baixo. Usando o segundo conjunto de pinças, segure o conjunto da pilha no braço disponível.
  3. Abaixe a pilha em uma nova placa de Petri de poço profundo estéril e pendure sobre a borda. Adicione 500 μL de mídia DMEM ao lado epitelial / intestino agora épico.
  4. Adicione mídia RPMI suficiente à placa de Petri profunda até que a mídia esteja apenas no topo da membrana. O volume de RPMI foi estimado em cerca de 40-55 mL, mas mudará dependendo do número de pilhas de FCI usadas por placa de Petri profunda.
  5. Remova a bolha de ar usando a etapa 8, deixando a bolha de 2-3 mm. Ajuste a mídia RPMI, se necessário. Cubra o prato.
  6. Cultura até que as células epiteliais do cólon comecem a produzir muco. Mude a mídia parcialmente a cada dois dias.
    NOTA: Se as células epiteliais do cólon foram cultivadas por tempo suficiente e já produziram muco, elas podem prosseguir para a inserção bacteriana ou tratamentos. Não permita que a mídia no compartimento inferior fique abaixo da parte inferior da membrana do inserto. Adicione mais mídia DMEM para manter o nível de mídia na membrana. O método ideal para trocar o meio é remover metade do meio do compartimento basolateral e deixar um pequeno volume de meio no compartimento apical para evitar a infiltração de ar.
  7. Para os tratamentos SEP, adicione SEP à concentração final de 100 μM nos poços neste momento, se a cultura bacteriana não for usada. Se a cultura bacteriana e a inserção forem usadas, adicione SEP à cultura bacteriana. Para a cultura bacteriana, consulte a etapa 11.
    1. Para fazer SEP, adicione 100 mg de L-Sepiapterina a 84,3 mL de DMSO e misture por vórtice. Alíquota em tubos de microcentrífuga a 100 μL cada. Conservar a -20 °C. Use alíquotas SEP a 1 μL por mídia de 500 μL por conjunto de insertos (concentração final de 100 μM).

11. Iniciando a cultura bacteriana (opcional)

  1. Para estudar o efeito dos metabólitos bacterianos nas células imunológicas, muco e epitélio do cólon, adicione uma inserção bacteriana ao lado apical do conjunto da inserção. Para a construção de insertos bacterianos, siga o passo 4. Cultivamos Bacillus subtilis no dia anterior ao uso da inserção bacteriana.
  2. Faça e autoclave o Miller LB 2 dias antes do uso da inserção bacteriana. Para fazer LB, combine 6,25 g de Miller LB com 250 mL de água deionizada em um frasco de vidro de 500 mL. Cubra com papel alumínio. Autoclave, resfrie até RT. Pode armazenar LB estéril a 4 °C ou RT.
  3. Comece a cultivar bactérias Bacillus subtilis a partir do estoque de glicerol no dia anterior ao uso da inserção bacteriana.
  4. Para iniciar a cultura bacteriana, inocular 10 mL de Miller LB com Bacillus subtilis de um estoque de glicerol congelado dentro de um tubo cônico estéril de 50 mL. Não deixe o estoque de glicerol descongelar.
  5. Usando uma ponta estéril de 200 μL, pegue uma pequena quantidade de bactérias do estoque de glicerol. Ejete a ponta em 10 mL de LB no tubo cônico estéril de 50 mL.
  6. Se estiver usando SEP, inicie o tratamento com 20 μL de estoque de SEP (a concentração final deve ser de 100 μM). Adicione diretamente à cultura bacteriana de 10 mL na cultura inicial de tubo cônico de 50 mL.
  7. Cultura de Bacillus subtilis durante 8 h em estufa agitada a 220 rpm e 37 °C. Adicione o segundo tratamento de SEP no final do dia - adicione 20 μL de SEP à concentração final de 100 μM aos 10 mL de LB com bactérias.
  8. Cultura durante a noite a 220 rpm, 37 °C. Adicione o terceiro tratamento de 20 μL de SEP a 10 mL de LB com Bacillus subtilis na manhã seguinte e continue agitando até que esteja pronto para fazer as inserções bacterianas.

12. Adição de inserto bacteriano ao Flipwell (opcional)

  1. Execute a construção da inserção bacteriana conforme descrito na etapa 4. Realize a cultura bacteriana conforme descrito na etapa 11.
    NOTA: Se um gabinete de cultura de células separado estiver disponível, isso funcionará melhor. Caso contrário, divida a área de trabalho dentro de um gabinete de cultura de células ao meio. Mantenha as culturas bacterianas e celulares separadas. As culturas de células não devem ser devolvidas à incubadora de cultura de células. O BSC precisará ser esterilizado e exposto aos raios UV por 24 horas ou mais após a realização deste método.
  2. Use dois pares de pinças estéreis para as etapas abaixo. Todas as etapas abaixo devem ser feitas no BSC.
  3. Com uma pinça, retire a inserção estéril de 24 poços pré-fabricada de sua embalagem. Coloque o inserto dentro de uma placa de Petri estéril e cubra a tampa.
  4. Repita para o número de inserções bacterianas necessárias. Transfira a placa de Petri com os Flipwells da incubadora para o BSC e reserve no lado oposto da placa com inserções bacterianas.
  5. Retire 300 μL do meio DMEM do lado apical (superior) do Flipwell para permitir a inserção bacteriana. Deixe cerca de 200 μL no lado superior da pilha FCI. Coloque a tampa da placa de Petri sobre os conjuntos de inserção.
  6. Adicione 50-100 μL de cultura de B.subtilis às inserções bacterianas de 24 poços. Tome cuidado para não derramar ou contaminar a parede externa e a borda da inserção bacteriana. OD600 pode ser tomado para monitorar a fase de crescimento da cultura.
  7. Com uma pinça estéril, levante o inserto bacteriano com cultura e insira-o cuidadosamente dentro do lado superior do Flipwell. Gire o braço e pendure-o na borda da pilha FCI. Segure a pilha com o segundo conjunto de pinças estéreis.
  8. Repita para o restante das pilhas FCI. Cubra a placa de Petri e descanse dentro do BSC 3 h. Não traga para dentro da incubadora.
  9. Após 3 h, use uma pinça estéril para remover a inserção bacteriana do Flipwell. Repita para o restante dos conjuntos de inserções. Descarte as inserções bacterianas.
    NOTA: Descarte bactérias e inserções bacterianas de acordo com as políticas de descarte de resíduos de risco biológico da instituição e as diretrizes de segurança e saúde. Os componentes bacterianos ou a própria bactéria não foram examinados.
  10. Para analisar as alterações nos compartimentos da mucosa, epitelial e celular imune, proceda à lavagem das membranas e à preparação para a imagem.
  11. Aspire o meio DMEM do tampo Flipwell. Lavar com 500 μL de PBS estéril. Usando uma pinça, levante a pilha FCI da placa de Petri e transfira-a para uma nova placa de Petri.
  12. Vire o Flipwell e pendure-o sobre a borda da placa de Petri. Lave a membrana com 500 μL de PBS estéril.
  13. Se for necessário armazenamento, armazene as pilhas FCI a curto prazo (30 minutos durante a noite) em PBS estéril dentro de um tubo cônico de 50 mL.
    NOTA: É importante determinar qual método de imagem será usado em seguida e se a membrana será cortada ao meio para microscopia eletrônica e marcação de anticorpos fluorescentes.

13. Desmontando o Flipwell para microscopia eletrônica de varredura (SEM)

NOTA: Para examinar as alterações morfológicas nas células epiteliais do cólon e macrófagos após tratamentos SEP / bacteriano, fixamos as membranas em um tampão de fixação e, em seguida, desmontamos os Flipwells para microscopia eletrônica de varredura (MEV). O PFA foi usado como fixador; no entanto, o glutaraldeído também pode ser usado. É importante consultar o Núcleo de Microscopia sobre seu tampão de fixação preferido, etapas específicas de desidratação e as concentrações iniciais do tampão de fixação. As membranas podem ser armazenadas no tampão de fixação se o armazenamento for necessário. O trabalho pode ser feito fora do BSC. Se o núcleo de imagem estiver colando a membrana, ela pode ser cortada ao meio e posicionada para obter imagens de ambos os lados separadamente.

  1. Usando um marcador à prova de solvente, rotule os lados de plástico da pilha FCI com um símbolo que codifica o tipo de célula usado. Como alternativa, rotule a membrana diretamente com um ponto, uma marca de seleção ou um x para rotular o tipo de célula usada.
  2. Coloque o Flipwell dentro de um tubo cônico de 50 mL sem desmontagem. Adicione 4% de PFA suficiente para submergir a pilha. Mantenha 4% de PFA durante a noite.
    1. Para fazer 4% de PFA (sem metanol), dissolva 40 g de paraformaldeído em 800 mL de 1x PBS. Para fazer PFA a 0,4%, dissolva 4 g de paraformaldeído em 800 mL de 1x PBS ou dilua 4% de PFA 1:10 com 1x PBS adicionando 100 mL de PFA a 4% a 900 mL de 1x PBS.
  3. Troque PFA por 0,4% para armazenamento mais longo. Consulte o Núcleo de Microscopia para obter a duração do armazenamento e os buffers.
  4. Para desmontar o Flipwell, segure-o com as duas mãos e torça cada parte colada da pilha. A pilha será desmontada em duas partes: uma parte terá a membrana e a outra será a inserção sem a membrana. Descarte o inserto sem a membrana.
  5. Gire o inserto com a membrana e coloque-o no chão com a membrana voltada para cima. Pode rotular a membrana com um pequeno ponto ou x na borda da membrana para saber qual lado tem qual tipo de célula.
  6. Segure a inserção pela parede com uma pinça. Corte cuidadosamente a membrana com uma lâmina de bisturi e coloque-a dentro de um tubo de 1,7 mL ou um pequeno frasco de vidro com 500 μL-1 mL de solução de PFA a 0,4%-4%.
  7. Submeta-se ao núcleo de microscopia para as etapas de desidratação e imagem. As etapas de desidratação são descritas em Beamer et al7.
  8. Descarte o PFA ou outros fixadores de acordo com as políticas de descarte de resíduos perigosos prescritas pela organização e as diretrizes de saúde e segurança.

14. Método de gotículas grandes para desmontar o Flipwell para microscopia confocal

NOTA: Um novo método foi criado para corar e criar imagens das membranas. A pilha de insertos de co-cultura foi mantida intacta com as etapas iniciais de fixação, permeabilização e bloqueio feitas dentro de um tubo cônico de 50 mL. A marcação imunofluorescente e a microscopia confocal foram usadas para obter imagens de ambos os lados da membrana. O recém-denominado método de placa de 12 poços foi usado para as etapas de incubação durante a noite, e um método de gotículas grandes foi usado para manchar o fundo do inserto desmontado. A pilha Z confocal foi usada para obter imagens de ambos os lados com a membrana. As membranas manchadas foram imprensadas entre duas lamínulas circulares de vidro, e o conjunto imprensado foi colocado no meio entre dois anéis de metal da câmara redonda feita comercialmente para a imagem. O microscópio confocal de varredura a laser multifóton foi usado com software de imagem comercial.

  1. Para lavar a membrana, coloque a pilha de inserção de co-cultura diretamente em um tubo cônico de 50 mL e adicione 15 mL de PBS estéril ou lave cada lado separadamente (descrito abaixo).
  2. Aspire o DMEM e adicione 300 μL de PBS estéril ao lado apical. Aspire PBS e remova cuidadosamente a pilha da placa de Petri.
  3. Vire o Flipwell e adicione 300 μL de PBS ao RPMI agora voltado para cima da pilha FCI. Aspire o PBS.
  4. Usando um marcador resistente a solventes, rotule o lado superior e inferior da pilha para saber qual lado tem qual tipo de célula.
  5. Coloque o Flipwell dentro de um tubo cônico estéril de 50 mL. Adicione 15 mL de PFA estéril a 4% como tampão de fixação inicial por 10 min. Se for necessária incubação durante a noite, troque por 15 mL de PFA a 0,4% em PBS, cubra e deixe durante a noite.
  6. Para prosseguir com a imunocoloração, faça um espaço de bancada para o método de gotículas grandes.
    Rasgue pedaços de filme plástico de 10 x 14 polegadas e cole-os na bancada nos cantos para criar uma superfície lisa.
  7. Usando uma pipeta de 200 μL, crie uma gota grande com 200 μL de PBS. Gire o conjunto de pastilhas para separar as pastilhas.
  8. Usando um marcador resistente a solventes, coloque um pequeno ponto próximo à borda de um lado da membrana para saber qual tipo de célula é usada para coloração e imagem.
  9. Remova qualquer junta de silicone residual da parte inferior da inserção se a inserção com a membrana ainda tiver cola residual. Isso é feito para garantir que a pastilha permaneça na vertical nas etapas abaixo.
  10. Posicione cuidadosamente a pilha FCI (com células THP-1) em cima da grande gota de 200 μL de PBS. Adicione 200 μL de tampão de permeabilização na parte superior com células epiteliais do cólon e mantenha por 10 min.
    1. Para preparar o tampão de permeabilização, use 0,1% v / v Triton-X100 em PBS.
  11. Aspire e adicione 200 μL de PBS. Repita esta lavagem 2x. Crie uma nova gota com 250 μL de tampão de bloqueio.
    1. Para fazer tampão de bloqueio, adicione 250 μL de soro de cabra normal em 5 mL de PBS 1x (soro final de 5%). Adicione 15 μL de Triton-X100 (0,3% v:v final). Misture bem e armazene a 4 °C por 1-2 dias.
  12. Coloque a inserção em cima do buffer de bloqueio. Bloqueie por 30 min em temperatura ambiente. Aspire PBS do lado apical e adicione 200 μL de tampão de bloqueio ao topo da inserção. Ambos os lados da membrana estão agora prontos para a coloração de anticorpos durante a noite.

15. Coloração imunofluorescente (IF)

NOTA: A coloração é feita durante a noite usando um método de placa de 12 poços ou em bancada usando um método de gotículas grandes.

  1. Preparar os anticorpos necessários para a coloração de ambos os lados da membrana durante a noite a 4 °C ou na bancada à RT. Diluir todos os anticorpos 1:100 em BSA a 1% em PBS. Como alternativa, siga as recomendações do fabricante e otimize a coloração para determinar as concentrações ideais e o tampão de diluição de anticorpos.
  2. Método de gotículas grandes
    1. Crie um retângulo grande usando um filme plástico em cima da bancada e prenda os cantos com fita adesiva. Pipetar 200 μL de anticorpo diluído em cima do plástico para criar uma gota grande. Coloque a membrana de inserção para baixo em cima da gota grande.
    2. Adicione 200 μL de Ab primário ao topo da pastilha. Incubar em RT por 2 h.
  3. Método de placa de 12 poços
    1. Se estiver usando um método de placa de 12 poços durante a noite, adicione 300 μL de anticorpo primário na parte superior do inserto.
    2. Adicione 300 μL de anticorpo primário ao poço da placa de 12 poços. Coloque o inserto dentro do poço da placa de 12 poços em cima da gota. Cubra o prato com uma tampa e coloque-o a 4 °C durante a noite.
  4. Quando a coloração estiver concluída, lave os dois lados da membrana com PBS. Usando uma pipeta e uma ponta de 200 μL, enxágue cuidadosamente a parte inferior do inserto 3x com 200 μL de PBS. Para a parte superior da inserção, lave adicionando 200 μL de PBS na parte superior, aspirando e repetindo a lavagem 3x.
  5. Prepare todos os anticorpos secundários (consulte a Tabela de Materiais para os anticorpos específicos usados) de acordo com as recomendações do fabricante ou diluição de 1:1000 em 1% BSA em PBS ou outro. A coloração secundária de anticorpos precisa ser feita no escuro; Use uma caixa de papelão ou uma gaveta de um armário para criar um ambiente sem luz.
  6. Usando um método de gotículas grandes ou um método de placa de 12 poços, prepare uma nova placa estéril. Incubar por 2 h em RT em ambiente escuro. Lavar como descrito no ponto 15.4.

16: Preparação para imagens confocais

  1. Se a membrana ainda não tiver sido rotulada conforme descrito na etapa 14, rotule-a para saber a localização do tipo de célula. Coloque uma pequena marca (ponto, x, cheque, etc.) com um marcador resistente a solventes em qualquer local (de preferência borda).
  2. Remova cuidadosamente as lamínulas redondas do recipiente de armazenamento e coloque-as com cuidado na superfície da bancada.
  3. Diluir o DAPI em PBS na diluição de 1:100. Para dispensar DAPI com o dispensador de gotículas, adicione 1-3 gotas no meio da lamínula. Caso contrário, pipete 1-3 gotículas de DAPI no meio da lamínula.
  4. Segure a inserção com uma pinça. Corte cuidadosamente a membrana com uma lâmina de bisturi em movimentos circulares em toda a volta da borda / borda inferior. Não deixe a membrana cair sobre a bancada. Coloque a inserção de plástico na bancada e segure a membrana com uma pinça enquanto corta as fibras finais com a lâmina do bisturi.
  5. Coloque o inserto na parte superior do DAPI. Dispense 1-3 gotículas de DAPI (diluição 1:100) no topo da membrana para que ambos os lados da membrana tenham DAPI.
  6. Levante a lamínula da segunda rodada com os dedos (use EPIs). Não use fórceps, pois a lamínula é muito frágil.
  7. Alinhe a segunda lamínula sobre a primeira lamínula e abaixe-a cuidadosamente sobre a membrana.
  8. Usando um marcador resistente a solventes, rotule cuidadosamente o lado da lamínula, se necessário, para codificar o tipo/orientação da célula (opcional). Se a membrana foi marcada, pule esta etapa.
  9. Dependendo do número de lamínulas a serem fotografadas e do número de anéis de metal disponíveis, monte as lamínulas entre os anéis de metal feitos comercialmente para manter as lamínulas redondas juntas para geração de imagens ou armazene-as no escuro até a geração de imagens.
  10. Para obter imagens, monte a lamínula com a membrana entre os anéis de metal da câmara celular e coloque-a no suporte do microscópio confocal. Entre em contato com o núcleo de microscopia confocal antes de ver qual suporte pode ser necessário para obter imagens das lamínulas redondas.
  11. Quando estiver pronto para a imagem, embrulhe cada sanduíche em uma folha de alumínio e leve-o para a instalação.
  12. Usando o recurso Z-stack, escaneie cada lado da membrana individualmente usando o comprimento de onda adequado, dependendo dos fluoróforos usados. Vire e imagine o segundo lado. Para guardar as lamínulas, mantenha-as no escuro a 4 °C.

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Resultados

Para determinar a relevância biológica das co-culturas Flipwell de bactérias intestinais, epitélios do cólon e macrófagos, tratamos as co-culturas com sepiapterina (SEP), um modulador do metabolismo da arginina, para promover a produção de óxido nítrico 9,10,11 em comparação com o DMSO controle. Determinamos os efeitos do tratamento com SEP em cada componente das co-culturas usando microscopia i...

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Discussão

Para recriar a arquitetura da mucosa intestinal in vitro, projetamos um sistema de co-cultura simples que compreende camadas estratificadas de bactérias intestinais, células epiteliais do cólon produtoras de muco e macrófagos. Este sistema de multi-co-cultura nos permitiu estudar os efeitos da diafonia entre o secretoma bacteriano, o epitélio intestinal e os macrófagos na indução da reprogramação imunogênica e dos mecanismos de defesa da mucosa.

Um do...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses. Os autores se isentam de todas as garantias, expressas ou implícitas, em toda a extensão permitida por lei. Sob nenhuma circunstância os autores serão responsabilizados, seja sob qualquer estatuto, contrato, ato ilícito ou qualquer outra teoria legal, por quaisquer danos especiais, incidentais, indiretos, punitivos, múltiplos ou conseqüentes decorrentes ou relacionados ao uso de ferramentas na construção dos Flipwells, o uso de reagentes BSL, linhagens celulares, culturas bacterianas, o uso do sistema Flipwell em ambiente anaeróbico em uma câmara anaeróbica. Esta limitação de responsabilidade inclui, mas não se limita a, qualquer forma não especificada de uso da Flipwell não explicitamente descrita neste documento.

Agradecimentos

O autor principal expressa sincera gratidão à Dra. Saori Furuta por suas excelentes habilidades de orientação, orientação e apoio contínuos em longas distâncias e design de projeto habilidoso e contínuo que promove oportunidades fantásticas de aprendizado. Os autores também agradecem à Dra. Vandana Sharma pela experiência e orientação em microbiologia e ao Dr. Veani R. Fernando pela preparação de macrófagos THP-1.  Além disso, os autores agradecem aos Drs. Andrew Kleinhenz e William T. Gunning, da Instalação de Microscopia Eletrônica, e Cassandra Zamora e Kristin Kirschbaum, do Centro de Instrumentação da Universidade de Toledo, por sugestões construtivas para imagens eletromagnéticas. Este trabalho foi apoiado pelo fundo inicial do Campus de Ciências da Saúde da Universidade de Toledo, Faculdade de Medicina e Ciências da Vida, Departamento de Biologia do Câncer para SF; Subsídio de Pesquisa de Câncer de Ohio (Projeto #: 5017) para S.F; Prêmio da Sociedade de Pesquisa Médica (Fundação Toledo, # 206298) para SF; Bolsa de Pesquisa da American Cancer Society (RSG-18-238-01-CSM) para S.F; e Bolsa de Pesquisa do Instituto Nacional do Câncer (R01CA248304) para SF.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% de PFA (veja a receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Pipeta sorológica de 10 mlCorning4488
Placa TC de 12 poços,   CostarCorning3513
Tubos cônicos de 15 ml, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & micro; L dicas USA Scientific1111-1700
Inserts de 24 poços - Inserts de cultura para chapas de 24 poços, PET 0.4 e micro; m BrandTech Scientific782710
Flipwells 3D prontos, esterilizados por UV  Laboratório de fabricação
4% de PFA (veja receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Estoque de 50 mM de Sepiapteria (SEP, veja a receita em Reagentes e Solução)Carreira Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Tubos cônicos de 50 mlGreiner Bio-One227261
Pipeta sorológica de 5 mlCorning4487
70-95% de etanol (álcool etílico)Laboratórios de Descontaminação04-355-151
Papel alumínioFisher Scientific01-213-100
Agulhas de alimentação animal, calibre 20 1,5" comprimento, uso único  Fisher Scientific01-208-87
Buffer de Diluição de Anticorpos (veja a receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Câmara Celular Attofluor  ThermoFisher ScientificA7816
Fita de autoclaveFisher Scientific15-901-111
Cepas de Bacillus subtilis wt (3A1T) em estoque de glicerol ()Centro de Estoque Genético Bacillus (https:// bgsc. org/
Luvas BioGrip Pink Nitrile sem pó sem látexManufatura de Alta QualidadeP2810
Buffer de Bloqueio (veja a receita em Reagentes e Soluções - 10% Soro Normal de Cabra em PBS)Descrito no texto
Buffer de Bloqueio (veja receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Microscópio de campo claro (Nikon ou equivalente) Eclipse Ts2NikonTS2
Células Caco-2ATCCHTB-37
Incubadora de cultura celular, 37 e graus; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Centrífuga (Eppendorf, Centrífuga 5804/5804 R ou equivalenteEppendorf22622501
Tubos centrífugas de 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Inserções de cultura para placa de 12 poços, PET, 0,4 e micro; m, estérilBrandTech Scientific, BRAND Insert 2em1, BIO-CERT782730
Meio de montagem DAPI VectaShieldLaboratórios VectorH-1000
Fundo profundo de placa de Petri, placa de Petri empilhável de poliestireno de 100 x 25 mm, estéril & nbsp;USA Scientific8609-0625
XP de auxílio de pipeta DrummondDrummond 4-000-101
Centrífuga Eppendorf 5804 com rotor de balde oscilante para tubos cônicos de 50 mlEppendorf22622501
Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x setsVWR82027-438
Pinça, aço inoxidável, autoclave estéril, 2x conjuntos, Pinças de AmostraVWR82027-438
Frasco de vidro 500 mlCorning 4980-500
Hemacitômetro (Neubauer com lâminas de cobertura)Thermo Fisher Scientific50-312-90
Células HT-29-MTX-E12Millipore Sigma12040401
ImmunoPen (opcional)Fisher Scientific4021761EA
Luvas à base de Kevlar ou outras luvas resistentes a cortes (opcional)Loja de ferragens ou Amazon
Fita de laboratório ou fita de transporteFisher Scientific & nbsp;159015R
Exaustor de fluxo laminar Série 1300 A2 BSC Classe IIThermoFisher Scientific1375
Exaustor de fluxo laminar com luz UV SterilGARDA Companhia BakerSG403A-HE
Marcadores à prova de solventeVWR52877-310 ou 95042-566
Mídia para células Caco-2 (DMEM à base de alta glicose, veja receita em Reagentes e Soluções)descrito em   Texto
Mídia para células HT-29 (DMEM Alta Glicose, veja a receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Mídia para células THP-1 (RPMI, veja a receita em Reagentes e Soluções)Descrito no texto
Tubo de microcentrífuga, 1,7 ml, estéril & nbsp;Alkali ScientificC3017-ST
Tubos microcentrífugasThermo Fisher3451
Mídia Miller LB (veja receita em Reagentes e Soluções)Sigma-Aldrich  L3522
Alicate de bico fino, 2x sériesLoja de ferragens ou Amazon
Luvas Aurelia Amazing sem pó de nitrilo sem látexCiência Média92885
Tampas para placa de Petri, estilo estéril da placa de Petri Falcon 100x15 mmCorning Inc351029
Acetato de miristato de forbol (PMA) (100 ng/μ l, veja receita em Reagentes e Soluções) e nbsp;InvivoGenTlrl-pma
Pontas de pipeta (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l) PurePoint ou equivalenteAlkali Scientific & nbsp;ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Filme plásticoMercearia
Solução de colagenose de trabalho Purecol (100 & micro; g/mL)BioMatrix Avançada5005-100ML
Tampa redonda #1 1 oz (Corning Float Glass ou Fisherbrand)Corning ou Fisherbrand50143822 ou 12-546-2 25CIR-2
Lâminas de bisturi, estéreis, descartáveis  Mopec ou Pena #10AJ136 ou 2975#10
Sepiapterina (setembro, 100 & micro; M, veja a receita em Reagentes e Solução)Carreira Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Incubadora de agitação ajustada para 220 rpm 37° CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Cola de silicone Loctite Silicone Transparente IDH ou 3M Selante de silicone Grau Marinho Transparente com ponta de narizLoctite ou 3M1745658 ou PN08019
Pipeta de canal único Eppendorf Research Plus, 200 & micro; lEppendorf
Pipetas de canal único (10 & micro; 1, 200 & micro; 1000 & micro; l)Eppendorf2231001122
Espectrofotômetro NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Água estéril deionizada    
Serina tamponada com fosfato estéril (PBS) sem cálcio ou magnésioFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Seringa 3 ml ou 5 ml com ponta Luer-LokBD309585 ou 309603
Células THP-1ATCCTIB-202
Pipetas de transferência, estéreisFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Solução azul de tripanVWR97063-702
Tripsina-EDTA 0,25%Thermo Fisher Scientific25200-056
Limpa Kimwipes Professional com Poliescudo Anti-Estatísticas LintGuardKimberly-Clark34120
Anticorpos Primários:  
Anti-humano CD163Abcam156769
Anti-humano CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Anti-humano CD80, E3Q9VTecnologias de Sinalização Celular15416
CK20  anti-humanos;Tecnologias de VidaPA5-82875
MUC2 anti-humano (996/1)ThermoFisherMA5-12345
Anticorpos secundários:
Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG (para CD80 e CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (para MUC2 e CD68 ou CD163)ThermoFisherA11005
Reagentes e Soluções:   
Caco-2 Médio:
DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inativado por calorSigmaF2242-500ML
Aminoácidos não essenciais 1% para meio Caco-2Thermo Fisher Scientific11140076
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Média
DMEM com glicose alta (4,5g/L) e 1% (v:v) de GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) inativado por calorSigmaF2242-500ML
HEPES (concentração final de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Médio:
Soro fetal bovino inativado por calor (FBS) (10% v:v)Sigma F2242-500ML
Glicose (concentração final de 4,5 g/L)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  Concentração final de 2 mMThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (concentração final de 10 mM)Thermo Fisher Scientific15630080
Estreptocócio da caneta 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Instituto Memorial Roswell Park (RPMI)-1640 médioThermo Fisher Scientific11875119
Piruvato de sódio (1 mM de concentração final)Thermo Fisher Scientific11360070
Purecol (diluição a 1:30 100 & micro; G/ml):
Purecol 3 mg/ml 1:30 a 100 & micro; g/ml BioMatrix Avançada5005-100ML
Água estéril desionizada
L-Sepiapterana (50 mM):
L-Sepiapterana (SEP)Carreira Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Phorbol (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% albumina sérica bovina  Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Soro normal da mesma espécie do anticorpo secundárioSigma NS02L-1ML
ParaformaldeídoSigma-Aldrich441244

Referências

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  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
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  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
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