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Edição de genoma aprimorada por meio de técnica de eletroporação in vivo baseada em entrega de ácidos nucléicos ovidutais para geração de camundongos knockout

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DOI:

10.3791/68704

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26 de agosto de 2025

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

Neste artigo

Resumo

A eficiência do método de Edição Aprimorada do Genoma via Entrega de Ácidos Nucléicos Ovidutais (I-GONAD) é comparável à microinjeção tradicional, que requer coleta de zigoto de fêmeas doadoras e transferência para fêmeas pseudo-grávidas. Este protocolo demonstra sua eficácia introduzindo mutações induzidas por CRISPR/Cas9 no locus ROSA26 no cromossomo 6.

Resumo

Os métodos para criar camundongos knockout geralmente envolvem três etapas principais: (1) coletar embriões de fêmeas doadoras, (2) microinjetar construções genéticas nos zigotos ex vivo e (3) transferi-los cirurgicamente para o oviduto de fêmeas pseudo-grávidas. Este processo requer um número significativo de animais, pois envolve não apenas fêmeas doadoras, mas também machos vasectomizados e fêmeas pseudo-grávidas. Além disso, as microinjeções no citoplasma ou no pró-núcleo de zigotos de camundongos apresentam desafios como entupimento da agulha, problemas de permeabilidade da membrana devido à alta elasticidade e potencial morte do embrião. O desenvolvimento de eletroporadores avançados, como o Nepa21, oferece uma oportunidade única de gerar camundongos com nocautes genéticos direcionados em uma única etapa por meio de um método conhecido como Edição Aprimorada do Genoma via Entrega de Ácidos Nucléicos Ovidutais (I-GONAD). Esta técnica envolve a microinjeção de componentes CRISPR-Cas (proteína Cas9 e RNA guia) nos ovidutos de fêmeas grávidas 0,7 dias após a concepção, seguida de eletroporação in vivo para entregar esses componentes diretamente nos zigotos. Após o procedimento I-GONAD, a rata grávida carrega e dá à luz filhotes com o nocaute do gene alvo. Este artigo fornece um protocolo detalhado e passo a passo para implementar o método I-GONAD em camundongos, oferecendo uma alternativa mais eficiente e acessível às técnicas tradicionais de geração de camundongos knockout.

Introdução

Compreender a base genética das doenças é fundamental para identificar os mecanismos moleculares subjacentes à sua etiologia e patogênese. Um passo fundamental nesta pesquisa é o desenvolvimento de modelos animais com nocautes genéticos direcionados que simulam doenças humanas. Os camundongos são particularmente valiosos para esses estudos devido à sua semelhança genômica geral com os humanos, tamanho pequeno, vida útil curta e alta fertilidade. Os modelos de camundongos são importantes tanto para a pesquisa básica quanto para os testes pré-clínicos1.

Para criar um camundongo nocaute usando o sistema CRISPR-Cas9, os pesquisadores normalmente injetam um complexo de RNA guia e nuclease Cas9 em um zigoto, causando uma quebra de fita dupla no DNA alvo e, assim, ativando o sistema de reparo da célula para causar uma mutação no local da quebra 1,2. A microinjeção em zigotos continua sendo o padrão-ouro para esse fim. No entanto, esse método requer várias etapas: isolar embriões de fêmeas doadoras, realizar microinjeções de construções genéticas em zigotos e transferi-los cirurgicamente para os ovidutos de fêmeas pseudo-grávidas. Como resultado, é necessário manter um grande número de animais, incluindo fêmeas doadoras, machos vasectomizados e fêmeas pseudo-grávidas. Além disso, o isolamento de zigotos requer a eutanásia de fêmeas doadoras. Portanto, protocolos que minimizem o uso de animais são preferíveis, em consonância com os princípios dos 3Rs (Substituição, Redução, Refinamento)3.

Os avanços na tecnologia de eletroporação, como o uso do sistema Nepa21, oferecem uma oportunidade única de gerar camundongos nocaute genético direcionados em uma única etapa usando uma técnica conhecida como edição aprimorada do genoma via entrega de ácidos nucléicos ovidutais (I-GONAD) 4 . O Super Electroporator NEPA21 Tipo II emprega um sistema de eletroporação multipulso de 4 etapas, garantindo alta eficiência de eletroporação, mantendo alta viabilidade embrionária. O I-GONAD envolve a microinjeção de componentes CRISPR-Cas (proteína Cas9 (500-600 ng/μl) e RNA guia (80-100 ng/μl)) nos ovidutos de camundongos prenhes 0,7 dias após a concepção, seguida de eletroporação in vivo para entregar esses componentes diretamente aos zigotos5. Após o procedimento I-GONAD, a rata grávida dá à luz filhotes com o nocaute do gene alvo 6,7,8. A eficácia desse método varia de acordo com o alvo desejado, mas é comparável às técnicas padrão baseadas em microinjeção (cerca de 50%)9,10. Além disso, o I-GONAD pode ser adaptado para edição do genoma em outras espécies.

Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para implementar o método I-GONAD para gerar camundongos knockout. Como exemplo, sua eficácia foi demonstrada visando o locus do genoma ROSA26 no cromossomo 6 de camundongo. Esse locus foi selecionado por sofrer transcrição constitutiva sem tradução posterior. Portanto, é improvável que a introdução de uma mutação neste locus tenha um efeito negativo na saúde dos filhotes resultantes.

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Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual de São Petersburgo (Aprovação nº 131-03-5, 11 de outubro de 2022). Todos os procedimentos seguiram rigorosamente as diretrizes descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos CD1 de linhagem comum foram obtidos no Centro de Uso Coletivo do Instituto de Compostos Fisiologicamente Ativos da Academia Russa de Ciências (IPAC RAS). Camundongos CD1 fêmeas com idade entre 2 e 3 meses (peso médio de 27 a 30 g) foram usados para acasalamento com camundongos CD1 machos com idade entre 2,5 e 4 meses (peso médio de 35 a 37 g). Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho de RNA de guia único (sgRNA) e sua preparação para transfecção

  1. Use ferramentas de análise computacional como CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design ou CRISPOR para identificar possíveis sequências de sgRNA direcionadas ao gene selecionado de interesse.
    NOTA: O software pode identificar possíveis sequências de sgRNA em todo o gene e sugere várias variantes na saída. Essas ferramentas sugerirão as opções de sgRNA mais ideais e permitirão que o usuário escolha entre todas as variantes identificadas, se necessário. Ao fazer uma seleção, considere os seguintes critérios:
    1. Proximidade do éxon: Escolha sequências localizadas em éxons que estejam o mais próximo possível do ponto de mutação desejado. Para obter melhores resultados, considere as isoformas de emenda alternativas e selecione a sequência alvo que está presente na maioria das isoformas. Considere navegadores de genoma (por exemplo, Ensembl) para uma seleção precisa de exons.
    2. Considerações fora do alvo: analise possíveis efeitos fora do alvo usando o sistema de pontuação da ferramenta, selecionando sequências que exibem a menor atividade fora do alvo prevista.
      NOTA: Ferramentas computacionais como CHOPCHOP ou Synthego são altamente eficazes para avaliar a proximidade do exon e os efeitos fora do alvo, ajudando a identificar sequências de sgRNA ideais para edição precisa do genoma. Ao projetar RNAs guia, é importante considerar a sequência específica do gene de interesse na cepa de camundongo que está sendo usada. Para algumas cepas de camundongos (por exemplo, C57Bl, CBA, C3H), a sequência genômica completa está disponível. Se esses dados não estiverem disponíveis, pode ser aconselhável realizar o sequenciamento preliminar do gene alvo na região de edição planejada. Incompatibilidades únicas no RNA guia, causadas por polimorfismos, podem comprometer a eficiência da edição. O locus do genoma do camundongo ROSA 26 foi direcionado com a sequência sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Solicite um conjunto de primers para amplificação por PCR do modelo de sgRNA, conforme descrito na Tabela 1.
    NOTA: o gRNA pode ser encomendado em outro lugar, como sgRNA ou como crRNA:tracrRNA duplex.
  3. Produza um modelo de dsDNA linear.
    1. Prepare a mistura principal conforme indicado na Tabela 1. Adicione a polimerase no final e mantenha a mistura master no gelo para manter a estabilidade.
    2. Execute a PCR nas seguintes condições: Desnaturação inicial: 30 s a 95 °C; 30 ciclos de: 20 s a 95 °C (desnaturação), 20 s a 55 °C (recozimento), 15 s a 72 °C (extensão); Alongamento final: 2 min a 72 °C; Manter a 4 °C.
  4. Use a mistura de reação de PCR em outras reações de transcrição in vitro (IVT).
    1. Preparar a mistura principal de IVT conforme indicado no quadro 2 e incubar durante 1,5 h a 37 °C. Use um termociclador para controle consistente da temperatura.
    2. Adicione 2 μL de DNase I e incube por mais 30 min a 37 ° C para remover o molde de DNA.
    3. Inative a DNase I incubando a mistura de reação a 75 °C por 5 min.
    4. Purifique o RNA usando o reagente TRIZOL de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: O descarte do reagente TRIZOL e DNAse1, suas soluções ou quaisquer subprodutos deve ser colocado em recipientes de resíduos químicos designados.
    5. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro (o rendimento típico de uma reação é de 3-5 μg). Verifique as relações A260/A280 e A260/A230. A260 / A280 deve ser de pelo menos 2,0, e a proporção de A260 / A230 também deve ser de pelo menos 2,0 (o que significa que não há contaminação por proteínas ou solventes orgânicos). Conservar os sgRNAs a -80 °C até à utilização.
  5. Preparar a mistura RNP para transfecção
    1. A mistura de transfecção consiste em um complexo RNP, que é uma mistura da proteína Cas9 e sgRNA. Siga estas etapas para preparar o mix da RNP:
    2. Diluir o tampão Tris-HCl 1 M (pH 7,5) a 100 mM utilizando água isenta de nuclease e filtrar utilizando um filtro de seringa com poros de 0,022 μM, alíquota em porções de 10 μL e conservar a 4 °C até à utilização.
    3. Em um tubo livre de nuclease, prepare a mistura de transfecção dos seguintes componentes nas concentrações finais: 500 ng/μL de nuclease spCas9, 80 ng/μL de sgRNA, 10 mM de Tris-HCl diluído com água tratada com DEPC.
      NOTA: Altas concentrações dos componentes da mistura RNP são necessárias para garantir a eficiência adequada do protocolo.
    4. Incubar a mistura de transfecção a 37 °C por 10 min para permitir a formação do complexo RNP.
    5. Alíquota da mistura em pequenos volumes (2 μL) adequados para uma única sessão de I-GONAD.
    6. Manter as alíquotas a 4 °C durante a sessão I-GONAD. A mistura é preparada fresca para cada sessão de eletroporação I-GONAD para manter a estabilidade.
      NOTA: A mistura RNP deve ser preparada fresca para cada sessão de I-GONAD para garantir atividade e eficiência ideais.

2. Preparação de camundongos fêmeas para edição do genoma via liberação de ácido nucleico oviductal

  1. Acasalamento e seleção de camundongos fêmeas: Mate camundongos fêmeas CD1 com camundongos machos CD1 de alojamento único durante a noite. De manhã, verifique a presença de tampões de cópula nas ratas fêmeas. Selecione as fêmeas com tampões de cópula e transfira-as para uma nova gaiola para procedimentos adicionais.
    NOTA: Para minimizar o mosaicismo genético, o momento ideal para entregar a construção genética é 0,7 dias após o acasalamento no estágio10 de célula única (zigoto). Isso corresponde aproximadamente às 16h00 do dia em que o tampão de cópula foi detectado. Nesse estágio, a dissecção do oviduto revela que os zigotos têm menos células cumulus, embora permaneçam na ampola. Notavelmente, as células do cumulus também podem absorver ácidos nucléicos ou proteínas exógenas durante a eletroporação. Se o procedimento for realizado mais cedo, por exemplo, 10 h após o acasalamento, as células do cumulus ainda envolvem firmemente os zigotos, o que pode impedir a entrega eletroforética eficiente de ácidos nucléicos nos zigotos. Não use os camundongos estimulados hormonalmente, pois eles podem dar um número excessivo de oócitos, e isso pode levar ao aborto espontâneo.
  2. Preparação de instrumentos cirúrgicos: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos de aço inoxidável para garantir a esterilidade.
  3. Anestesia e preparação de camundongos: Pesar as fêmeas selecionadas e anestesiar-as por injeção intraperitoneal usando uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
    1. Monitore os camundongos quanto à perda do reflexo de pinça do dedo do pé para confirmar a anestesia adequada. Coloque o mouse anestesiado em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal durante o procedimento. Proteja os olhos do camundongo do ressecamento durante a anestesia aplicando pomada veterinária.

3. Procedimento cirúrgico

  1. Desinfete a área dorsal (dorso) do camundongo usando etanol a 70%.
  2. Faça uma incisão longitudinal na pele de 0,7 cm na região lombar.
  3. Limpe o local da incisão com um algodão embebido em etanol a 70% e remova qualquer cabelo ao redor da incisão.
  4. Estenda a incisão para 1,3 cm empurrando lateralmente com as pontas em tesoura ligeiramente abertas.
  5. Faça cuidadosamente uma pequena incisão (0,7 cm) no peritônio para acessar a cavidade abdominal.
  6. Estenda a incisão para 1,1 cm empurrando lateralmente com as pontas em tesoura ligeiramente abertas.
  7. Localize a almofada de gordura presa ao ovário e puxe-a suavemente com uma pinça até que o ovário, o oviduto e o útero estejam claramente visíveis.
  8. Prenda a almofada de gordura no lugar usando um grampo de vaso.
  9. Visualize o oviduto sob um microscópio estereoscópico para manipulação precisa (Figura 1).
  10. Carregue 2 μL da mistura de injeção em um capilar de plástico usando um Stripper Pipettor.
    NOTA: O Stripper Pipettor com capilares plásticos, originalmente projetado para manipulações com embriões em clínicas de fertilização in vitro, pode suportar várias aplicações, incluindo transferência de embriões e entrega de construção CRISPR/Cas9 em procedimentos I-GONAD. O pipetador funciona como um dispensador de líquido de precisão; Em combinação com capilares flexíveis descartáveis, permite a esterilidade e evita a contaminação cruzada. Os capilares plásticos são preferíveis ao vidro para injetar a mistura RNP para transfecção no oviduto, pois são menos traumáticos para tecidos delicados. Ao contrário dos capilares de vidro, os de plástico descartáveis não requerem polimento por chama para alisar as bordas afiadas antes da inserção, reduzindo o tempo de preparação e o risco de danos.
  11. Usando uma microtesoura, faça uma pequena incisão (0,2 cm) na parede do oviduto alguns milímetros a montante da ampola.
  12. Insira cuidadosamente o pipetador de decapagem com capilar de plástico na incisão e expulse a mistura de injeção no oviduto.
    NOTA: Certifique-se de que nenhum ar entre no oviduto, pois isso pode afetar a eficiência da eletroporação.
    Para evitar isso, encha o capilar de plástico de injeção com mais mistura de injeção do que o necessário e evite a injeção completa. Os capilares plásticos são adequados tanto para a transferência do infundíbulo quanto para a dissecção direta da parede do oviduto entre o infundíbulo e a ampola. O método de dissecção direta da parede do oviduto pode ser menos traumático do que a transferência do infundíbulo, uma vez que esta última requer uma incisão inicial através da fina membrana da bursa que cobre o oviduto e o infundíbulo. Em camundongos CD1, essa membrana é altamente vascularizada, e cortá-la pode causar pequenos sangramentos, o que pode obstruir a visibilidade e complicar a microinjeção da mistura RNP.
  13. Remova cuidadosamente o capilar de plástico do oviduto.

4. Eletroporação e sutura

  1. Ligue o eletroporador pressionando o interruptor no painel frontal.
  2. Definir parâmetros de eletroporação: Pulso de poragem: Tensão: 50 V, Comprimento de pulso: 5 m, Intervalo de pulso: 50 ms, Número de pulsos: 3, Taxa de decaimento - 10%, Polaridade: +/-; Pulso de transferência: Tensão: 10 V, Comprimento do pulso: 50 ms, Intervalo de pulso: 50 ms, Número de pulsos: 3, Taxa de decaimento - 40%, Polaridade: +/-; Limite de corrente: in vivo.
  3. Usando os eletrodos do tipo pinça, segure cuidadosamente o oviduto e verifique o valor da resistência pressionando o botão kΩ no eletroporador. Certifique-se de que os eletrodos sejam comprimidos o suficiente para que a resistência permaneça dentro da faixa ideal de 350-400 Ω.
    NOTA: Isso pode ser conseguido ajustando a distância entre os dois eletrodos quando o oviduto intacto é imprensado entre eles.
    1. Imediatamente após medir a resistência, pressione o botão Iniciar para iniciar a eletroporação. Esta etapa é fundamental para garantir a entrega eficiente de componentes CRISPR-Cas nos zigotos4. Aguarde até que o botão Ω exiba um sinal de "fim". Anote os valores mostrados no quadro Medidas.
      NOTA: O valor da impedância deve ser de aproximadamente 250-400 Ω/150-250 mA do valor da tensão para garantir um equilíbrio ideal entre viabilidade e eficiência de transferência. Para manter esse equilíbrio, evite a cobertura das regiões do oviduto com um pedaço de papel úmido embebido em solução salina tamponada com fosfato modificado (DPBS) de Dulbecco, recomendado em alguns protocolos, pois essa etapa pode diminuir significativamente a resistência além da faixa ideal. A diminuição da resistência pode aumentar a tensão para mais de 250 mA, levando à morte celular.
  4. Depois de completar a eletroporação em um oviduto, coloque cuidadosamente o trato reprodutivo de volta na cavidade abdominal. Suturar a incisão com sutura cirúrgica de ácido poliglicólico 4-0.
  5. Repita a operação e a eletroporação no segundo oviduto. Depois de concluído, retorne o trato reprodutivo à cavidade abdominal e suture a incisão conforme descrito acima.
  6. Monitoramento pós-procedimento: Coloque o mouse em uma gaiola quente (37 °C), limpa para recuperação e monitore até que ele se recupere totalmente da anestesia.
    NOTA: Após a cirurgia, aloje os ratos em gaiolas contendo dois ratos por gaiola. Se apenas um camundongo for submetido à cirurgia, forneça a ele um camundongo fêmea companheiro. Essa prática ajuda a reduzir o estresse desnecessário para o camundongo cirúrgico e promove um ambiente social mais natural.

5. Genotipagem

  1. Design de primer
    1. Para genotipagem, projete primers para amplificar um produto de PCR entre 300-600 pb de comprimento. Os iniciadores devem ter 18-21 nucleotídeos de comprimento com uma temperatura de fusão (Tm) de aproximadamente 60 °C.
    2. Evite sequências que formem estruturas secundárias ou dímeros de primer. Use ferramentas de software como PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 ou similar para garantir a qualidade do primer.
    3. Realize uma pesquisa BLAST no banco de dados do genoma do camundongo para confirmar a especificidade do primer e evitar amplificação inespecífica11.
      NOTA: Os seguintes primers foram projetados para genotipagem da sequência alvo: Primer direto: 5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3'; Primer reverso: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', comprimento esperado do produto de PCR: 320 bp e Tm 62°C. Para o sequenciamento Sanger, projete um primer de sequenciamento que recoze 150-200 pb de distância do local de corte Cas9.
  2. Realize a extração de DNA. Para extração rápida de DNA, o protocolo de isolamento Hotshot12 é o mais simples.
    1. Usando um punção de orelha, colete um pequeno fragmento de tecido (aproximadamente 2 mm) da orelha do camundongo.
    2. Adicione 100 μL de tampão de lise (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    3. Incubar a 95 °C durante 60 min, agitando a mistura a cada 20 min.
    4. Adicione 100 μL de tampão neutralizante (40 mM Tris-HCl, pH = 5) e vortex completamente.
    5. Use 1-5 μL da preparação final para PCR.
  3. Amplificação e sequenciamento de PCR. Prepare a mistura principal de PCR conforme descrito na Tabela 3. Use uma polimerase de DNA de revisão para garantir alta fidelidade. Aliquota a mistura principal no número necessário de tubos e adicione DNA genômico.
    NOTA: Sempre inclua uma amostra de DNA do tipo selvagem como controle para análise de sequenciamento.
  4. Execute o PCR para genotipagem ROSA26 . Foram utilizadas as seguintes condições: Desnaturação inicial: 30 s a 95 °C; 28 ciclos de: 20 s a 95 °C (desnaturação), 20 s a 62 °C (recozimento), 20 s a 72 °C (extensão); Alongamento final: 2 min a 72 °C; Manter a 4 °C.
    NOTA: O protocolo fornecido é preciso para a amplificação do fragmento de locus ROSA26 (tamanho estimado de 320 pb) usando primers da etapa 1.1.2. Para uma amplificação mais específica e precisa, limite o número de ciclos de amplificação a 28-30.
  5. Sequenciamento e análise
    1. Realize o sequenciamento de Sanger dos fragmentos de PCR obtidos (etapa 5.4).
    2. Análise dos resultados do sequenciamento
      NOTA: A transfecção bem-sucedida resultará em animais em mosaico, identificáveis pelo surgimento de sequências de DNA adicionais perto do local de corte da nuclease no cromatograma de sequenciamento. Use ferramentas computacionais como EditCo ICE Analysis ou TIDE13 para identificar e quantificar indels exatos no genoma.
      1. Para usar a análise ICE, basta fazer o upload dos arquivos de sequenciamento Sanger obtidos (arquivo .ab1 de controle para a sequência de produtos de PCR de camundongos wt sem edição e o arquivo .ab1 do experimento para a sequência de produtos de PCR de camundongos experimentais), inserir a sequência de RNA guia e selecionar a nuclease usada no experimento CRISPR.
        NOTA: A ferramenta ICE Analysis calculará a eficiência geral da edição e determinará os perfis e as abundâncias relativas de todos os diferentes tipos de edições presentes na amostra.
      2. Para usar o TIDE, insira a sequência de RNA guia, carregue os arquivos de sequenciamento Sanger obtidos (controle .ab1 file para wt mouse PCR product sequence sem edição e experimento .ab1 file para experimento mouse PCR product sequence) e verifique os parâmetros (em alguns casos, as configurações avançadas podem ajudar a encontrar indels maiores que 10 bp).

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Resultados

Se a eletroporação for bem-sucedida, os camundongos experimentais: (1) darão à luz um punhado de filhotes e (2) alguns animais terão diferentes indels no genoma. Se os primers de genotipagem forem bem projetados e o programa de PCR for ideal, o produto de PCR estará presente no gel de agarose como uma faixa transparente do tamanho desejado. Se a nuclease cortar com sucesso o DNA alvo, os animais obtidos provavelmente serão mosaicos e terão uma variedade de indels no genoma. Ferramentas c...

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Discussão

A eficiência de gerar camundongos knockout usando o método I-GONAD é comparável à das técnicas tradicionais de microinjeção. No entanto, os métodos tradicionais envolvem o isolamento de zigotos de fêmeas doadoras, a realização de microinjeções e o transplante de embriões para os ovidutos de fêmeas pseudo-grávidas. Em contraste, o método I-GONAD simplifica esse processo, fornecendo componentes de edição de genoma diretamente nos ovidutos de fêmeas grávidas, eliminando a necessidade de iso...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores são gratos ao Parque de Pesquisa da Universidade de São Petersburgo, Centro de Tecnologias Moleculares e Celulares. O sequenciamento foi realizado usando um analisador genético ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, EUA) no Centro de Recursos de Tecnologias Moleculares e Celulares, Parque Científico da Universidade Estadual de São Petersburgo. Os autores agradecem a Maria Rubel por sua ajuda na edição e envio dos documentos. Esta pesquisa foi financiada pela Universidade Estadual de São Petersburgo, projeto de pesquisa ID: 129658320, e Luibov Shkodenko foi apoiado pela Fundação Científica Russa (projeto 25-26-00247).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5&ntraço; 5 uL pipeta Termo Científica4642020
Tubo de 1,5 mLAptaca1003/G
100-1000 uL pipeta Termo Científica4642090
Tubo de 200 uLAxygenPCR-02-C
20-200 uL pipeta Termo Científica4642080
2-20 uL pipeta Termo Científica4642060
4x Gel Loading DyeBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963.0500
DNase I, livre de RNase (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
Conjunto dNTP, solução de 100 mMTermo CientíficaR0181
DreamTaq Green DNA Polimerase (5 U/μ L)Termo CientíficaEP0713
Dulbecco' s soro fosfatado tamponado modificadoSigma AldrichD8537
Análise ICE da EditCohttps://ice.editco.bio/#/acessado em 06.04.2025
Solução EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmlacessado em 09.06.2025
Brometo de etídioBiolabmixEtBr-10
Gotas de gel para os olhos" Oftagel"URSAPHARM204604
Sistema de documentação em gel ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  acessado em 09.06.2025
Tecnologias Integradas de DNA & nbsp;https://eu.idtdna.comacessado em 09.06.2025
Tesoura microcirúrgicaURAIS de MedinM124
Eletroporador NEPA21Nepa GeneNEPA21Com eletrodo CUY652P2,5X4
NTP Set, Solução de 100 mMTermo CientíficaR0481
OligonucleotídeosEvrogenPurificação padrão por dessalinização por ordem direta
Opti-MEM I Médio Sérico ReduzidoThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netVersão 1.1.21.
Phusion Alta Polimerase de DNA de Alta Fidelidade (2 U/μ L)Termo CientíficaF530L
Pontas de pipeta 10 uLUlplastHT-10-960
Ponteiras de pipeta 1000 uLUlplastHT-1000-576
Ponteiras de pipeta 200 uLUlplastHT-200-960
Fonte de energia " Elf-4"Tecnologia de DNAPS-400 NOVO
Água livre de RNAse/DNAseInvitrogen10977049
Solução salinaPanEcoP011n
Sistema de eletroforese horisontal SE-1HeliconSE-1
Hidróxido de SódioSigma-AldrichS5881-500G
Escada de DNA Step100BiolabmixS-8100
Estereomicroscópio SMZ1000Nikon5-363376
Micropipetador stripperCooperSurgicalMXL3-STR
Ponteiras de stripperORIGIOMXL3-125
Agulha cirúrgica & nbsp;KMIZ4A1- 0,6 e vezes; 20
Pinças de suturaURAIS de MedinM302.2
Pinças de suturaURAIS de MedinM303
Tópico de sutura POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
Design do Guia Knockout SYNTHEGO  https://design.synthego.com/#/acessado em 09.06.2025
Amplificador T100BioRad10014822
RNA polimerase T7  Termo CientíficaEP0111
Buffer TBE 10xBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/acessado em 04.06.2025 
Cloridrato de TrisSuzhou Yacoo ScienceSYS-S0005-0.5
Solução de cloridrato de TrizmaSigma AldrichT2663
Reagente TrizolInvitrogen15596026
Proteína Cas9 TrueCutInvitrogenA36499
Tesouras universaisURAIS de MedinM147
XilazinaInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilLaboratório Virbac2000443714739.00

Referências

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